人乳头瘤病毒58型E6蛋白对p53的作用研究

目的 研究HPV58 E6蛋白与p53蛋白的作用关系，以初步探讨其致癌机理。方法 先通过GST沉降试验和体外降解试验，体外研究HPV58 E6结合降解p53蛋白的作用，进而将表达质粒导人SAOS-2细胞，在细胞内研究HPV58 E6对p53诱导细胞凋亡活性的影响。结果 HPV58 E6能够有效结合p53蛋白并进一步诱导其降解，而且在细胞内，HPV58 E6具有抑制p53蛋白的诱导凋亡的功能。结论 p53蛋白的降解影响其细胞周期调控和诱导凋亡的功能，导致细胞发生恶性转化引发子宫颈癌等肿瘤。     

人乳头瘤病毒致癌机制的研究进展

人乳头瘤病毒 (human papillomavirus, HPV) 是一类小双链DNA病毒,是世界范围内最常见的性传播病原体,其发现是肿瘤病因学研究中的重要成就之一。HPV仅感染人类上皮组织,根据组织亲嗜性的不同,可分为皮肤型和黏膜型;根据HPV致瘤性的高低,又可将黏膜型HPV分为低危型(low risk HPV, LR HPV)和高危型(high risk HPV, HR HPV)。LR HPV主要引起生殖器乳头状瘤和尖锐湿疣等良性病变,而HR HPV则主要引起宫颈不典型增生和宫颈癌。HR HPV可以通过基因整合及对宿主细胞基因组不稳定性、细胞周期、细胞凋亡以及端粒酶活性等产生影响等多种机制导致宫颈上皮的恶性转化。     

人乳头瘤病毒E7蛋白生物活性研究进展

人乳头瘤病毒(HPV)是一种小分子DNA病毒，其早期基因E7编码具有多种生物活性的E7蛋白。E7蛋白与腺病毒EIA及多瘤病毒SV40蛋白有相似的结构，可与pRB、P^53反应，改变宿主细胞G1／S期的转化。E7蛋白还能同多种细胞因子发生反应，影响宿主细胞代谢，直接导致宿主细胞中心体的变化。E7蛋白在HPV的致病性方面发挥重要作用。     

牛乳头瘤病毒E6蛋白与p73蛋白作用的研究

高危型乳头瘤病毒Ｅ6蛋白能结合并降解ｐ5 3蛋白 ,导致细胞发生转化 ,是其致癌的关键环节。但最近大量研究表明ｐ5 3并非Ｅ6致癌的唯一靶位 ,Ｅ6蛋白的致癌机制还远没有阐明 ,探索Ｅ6蛋白与其新的靶分子的相互作用对肿瘤的基因治疗和全面揭示其致癌机制具有重要意义。 1997年 ,Ｋａｇｈａｄ等发现了一个在结构和功能上都和ｐ5 3极为相似的新基因 ,命名为ｐ73。ｐ73基因虽然发现时间不长 ,却已成为研究的热点。ｐ73无论在结构上还是在功能上均与ｐ5 3极为相似。ｐ73蛋白具有与ｐ5 3同样的四个主要功能区 ,其中ＤＮＡ结合结构域两者的相同序列…     

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16,HPVl6)E6E7融合基因(fmE6E7)，研制治疗HPVl6相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后，插人真核表达质粒获得pVRl012-fmE6E7，瞬时转染Cos-7细胞，免疫荧光法检测证实其表达后，在C57BL／6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫，5lCr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性Cytotoxic T lymphocyte，CTL)，间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应，与单独野生型E7基因免疫相比，E6E7融和基因可更好的活化CTT反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPVl6治疗性DNA疫苗的靶基因。     

佛波酯和人乳头瘤病毒在细胞恶性转化作用中的协同效应

目的探讨人乳头瘤病毒（HPV）和促癌物在肿瘤诱发过程中的协同作用。方法研究选择与恶性肿瘤关系密切的癌基因和抑癌基因，利用免疫组化、Southem Blot和半定量RNA斑点杂交的方法，研究在HPV18E6E7和促癌物佛波酯（TPA）的协同作用下，这些基因在细胞内的表达。结果HPVE6E7和TPA的协同作用可以引起细胞内癌基因c-myc的扩增4-8倍，c-erbB2的表达水平提高32-64倍，并导致抑癌基因p16的表达水平下降到正常水平的1／4．1／8。结论HPVE6E7和TPA的协同作用可以引起细胞内癌基因和抑癌基因表达水平异常，可能是细胞癌变的重要原因之一。     

牛乳头瘤病毒E6蛋白与p73蛋白的相互作用

为进一步探讨和阐明E6蛋白的致癌机制以及充分认识新发现的抑癌基因p73的作用，在体外通过免疫共沉淀法研究p73和牛乳头瘤病毒1型E6蛋白（BPI－1E6）的相互结合情况，后将表达p73和BPV－1E6的质粒导入SAOS－2细胞内，进一步研究细胞内E6蛋白对p73蛋白的诱导调亡和转录活化功能等生物学活性的影响。结果发现，BPV－1E6与p73蛋白结合较弱，且未检测到E6能诱导p73蛋白的降解。在SAOS－2细胞内，BPV－1E6蛋白确实能部分抑制p73蛋白的诱导细胞凋亡的功能，并且p73蛋白的转录激活作用也有影响，但这种影响作用颇弱。     

人乳头瘤病毒16E6蛋白单克隆抗体的研制

运用杂交瘤技术，我们成功地建立了两株能稳定分泌小鼠抗人乳头瘤病毒１６Ｅ６蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，经鉴定单克隆抗体属ＩｇＧ１ｋ。试验结果表明，所得单克隆抗体仅１与ＰＶ１６Ｅ６融合蛋白反应。不与ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２融合蛋白以及Ｌ１－Ｌ２真核表达蛋白反尖，也只与Ｃａｓｋｉ细胞反应，不与Ｈｅｌａ细胞反应，初步结果说明，该抗体是ＨＰＶ１６Ｅ１６蛋白特异性的ＭｃＡｂ。     

重组人乳头瘤病毒16型E6蛋白的表达、纯化和动物免疫效果分析

目的 诱导表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6蛋白,制备可溶性蛋白,并通过动物免疫进行免疫效果评估.方法 采用IPTG诱导pQE30-HPV16E6/BL21(DE3)重组菌株,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定.提取包涵体进行变性处理,变性蛋白经Ni2+金属螯合层析纯化,将纯化产物用复性透析方法处理以获取可溶性蛋白.免疫Bal B/c小鼠,检测血清抗体、CD4+/CD8+和IFN-γ.结果 诱导后重组菌有相对分子量18 000蛋白质表达,以不溶性包涵体为主要表达方式.目的蛋白可与HPV16E6多克隆抗体识别,纯化和透析处理后得到可溶性的蛋白.小鼠免疫后血清抗体滴度升高,淋巴细胞CD4+/CD8+升高,IFN-γ未见升高.结论 成功表达了HPV16E6蛋白,同时处理包涵体并制备了可溶性目的蛋白.目的蛋白可刺激小鼠体内产生有效的免疫反应,该蛋白的成功制备为患者血清抗体的检测和肿瘤细胞杀伤的免疫研究奠定了坚实基础.     

人乳头瘤病毒16型E6E7 ORF转化作用的研究

构建了含人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）－Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ（ｎｔ８３－８５５）片段和ＨＰＶ１６长控制区（ＬＣＲ）加Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ片段（ｎｔ７００７－７９０４／０－８７９）的逆转录病毒载体ｐＨ２１和ｐＨ１８质粒，利用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ分别将它们导入病毒包装细胞ｐＡ３１７中，经过筛选获得Ｇ４１８抗性的病毒包装细胞，产生的重组病毒Ｈ２１和Ｈ１８感染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞都具有恶性细胞的形态学特征，并能在裸鼠体内形成肿瘤。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证明，上述两基因片段都整合到细胞基因组中。本实验结果说明ＨＰＶ１６－Ｅ６Ｅ７基因片段是ＨＰＶ１６转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞的关键早期区，其自身ＬＣＲ区在该转化过程中没有显示出重要作用。     

人乳头瘤病毒16型转换基因的序列分析

为了解中国地区宫颈癌病人中人乳头瘤病毒１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点,从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取组织ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标本中感染ＨＰＶ型别,选单纯感染ＨＰＶ１６两例标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因后,重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。ＤＮＡ序列分析表明：两例标本的ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７序列全长均为７７６ｂｐ,与已发表的德国标准株长度相等,两     

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

宫颈癌患者外周血中的人乳头瘤病毒16例E6及E7蛋白…

本研究证明进展期宫颈癌患者１０／３７例和１０／４６例外周血中分别存在有ＨＰＶ１６Ｅ６和Ｅ７蛋白致敏的淋巴细胞，而４０例献血员中分别为１２．５％（５／４０）和１７．５％（７／４０）。４６例中有１７例和２５例分别进行了宫颈癌组织中的ＨＰＶ１６Ｅ６和Ｅ７基因序列检测，Ｅ６蛋白致敏淋巴细胞阳性的６例中检出与未检出Ｅ６序列的各占３例，Ｅ７蛋白致敏淋巴细胞阳性的５例中有３例未检出，有２例检出Ｅ７序列。     

人乳头瘤病毒E_7蛋白的研究进展

人乳头瘤病毒(HPV)的早期基因E_7,编码一个具有生物活性的癌蛋白。E_7白与腺病毒ElA、SV_(40)大T抗原病毒癌蛋白有相似的结构与功能。本文对有关E_7蛋白结构与功能的研究进展进行综述。     

中国地人株人乳头瘤病毒16型E7基因的高效表达

人乳头瘤病毒至今没有合适的体外培养系统。为了研究ＨＰＶ１６Ｅ７蛋白的免疫学性质，采用分子克隆技术构建了我国地方株ＨＰＶ１６Ｅ７基因重组表达质粒。经鉴定显示：该基因在大肠杆菌中得到高效表害，分子量约为６９ＫＤ，为ＨＰＶ１６－ＨＢＥ７与载体蛋白融合蛋白。     

人乳头瘤病毒16型致瘤基因E6在昆虫细胞中表达及其 …

目的 研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）相关肿瘤患者的ＨＰＶ１６ Ｅ６抗体水平及其流行病学意义；探讨用杆状病毒－昆虫细胞表达载体系统表达的ＨＰＶ１６ Ｅ６蛋白的抗原性；方法 用ＰＣＲ从ＨＰＶ１６基因组中扩增出ＨＰＶ１６ Ｅ６完整基因，克隆至转移载体ｐＶＬ１３９３中，重组质粒ＤＮＡ与线性杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ－９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞中表达。结果 Ｗｅｓｔｅ     

人乳头状瘤病毒16 E7 DNA在结直肠腺癌组织中的表达

结直肠癌与人类乳头状瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染有一定的关系,但由于检测方法、标本选择及样本数量不同,各研究结果之间差异很大。为进一步明确结直肠癌变与HPV16感染的关系,采用多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)对82例原发性结直肠腺癌患者手术切除的新鲜癌及癌旁正常粘膜组织进行了前瞻性对照研究,检测了组织中HPV16E7DNA的表达并进行测序鉴定。结果显示,结直肠腺癌组织HPV16E7的表达阳性率(42/82)明显高于癌旁正常粘膜组织(4/82);直肠癌组织中HPV16E7的表达(64.10%)明显高于升结肠癌(18.18%),即癌灶部位距肛门越近,感染率越高;HPV16阳性率与Dukes分期相关,Dukes分期越晚感染率越高;与癌组织分化程度无相关性。结果提示结直肠癌的发生、发展可能与HPV16感染有关。     

人乳头瘤病毒E5基因

本文对人乳头瘤病毒早期基因之一E5基因的致癌性的分子机理进行了综述,对E5蛋白与生长因子受体的相互作用、一些癌基因的反式激活作用及细胞缝隙连接的损伤作用进行了讨论。     

人乳头瘤病毒16型致瘤基因E6在昆虫细胞中表达及其蛋白抗原特性的初步研究

目的研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）相关肿瘤患者的ＨＰＶ１６Ｅ６抗体水平及其流行病学意义；探讨用杆状病毒－昆虫细胞表达载体系统表达的ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白的抗原性。方法用ＰＣＲ从ＨＰＶ１６基因组中扩增出ＨＰＶ１６Ｅ６完整基因，克隆至转移载体ｐＶＬ１３９３中，重组质粒ＤＮＡ与线性杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ－９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞中表达。结果Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和高效液相色谱法检测ＨＰＶ１６Ｅ６表达蛋白，其分子量约为１８０００。免疫印迹检测显示其能与兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６多抗特异性结合。酶联免疫吸附试验表明此重组蛋白能被人ＨＰＶ１６阳性血清所识别。结论昆虫细胞表达的ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白，具有良好的抗原性，可用于检测ＨＰＶ１６Ｅ６特异性免疫球蛋白ＩｇＧ和ＩｇＭ抗体     

宫颈癌细胞系SiHa中HPV16E6,E7蛋白的表达

我们应用免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜(ｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ,ＬＳＣＭ),观察了宫颈癌细胞系ＳｉＨａ中ＨＰＶ１６型(ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１６)Ｅ６,Ｅ７基因区产物Ｅ６,Ｅ７蛋白的表达。１材料与方法１．１材料含ＨＰＶ基因的宫颈癌细胞系ＳｉＨａ,由西安医科大学分子生物研究中心李旭教授提供。用含１００ｍＬ／Ｌ胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基(Ｇｉｂｃｏ公司)常规培养后,滴于盖玻片培养,制成单层细胞爬片。１．２方法免疫荧光染色用正常羊血清封闭…