乙型肝炎病毒X基因对正常肝细胞HL7702凋亡影响的初步探讨

目的 研究乙型肝炎病毒X基因(HBX基因)对HL7702肝细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法 用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3.1( )-X瞬时转入HL7702细胞,以转染空质粒pcDNA3.1( )的细胞及未转染的HL7702细胞为对照.转染后72 h收集细胞标本,作以下处理:RT-PCR法检测HBX mRNA的表达,免疫荧光鉴定HBx蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;以β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达量变化.结果 转染72h后,转染pcDNA3.1( )-X真核表达载体的HL7702细胞经RT-PCR扩增出HBX片段,免疫荧光结果 显示细胞内出现HBx蛋白的较强荧光;而转染空质粒组及未转染对照组经RT-PCR法及免疫荧光检测均显示无HBx表达.通过流式细胞术和半定量RT-PCR法检测细胞凋亡情况,结果 显示:转染HBX的细胞凋亡率(3.38%±0.67%)相对于转染空质粒组(1.25%±0.30%)及未转染质粒组(1.40%±0.37%)凋亡率增高, 差异均有显著性意义(P<0.05);转染HBx的细胞Bax mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显降低,差异均有显著性意义(P<0.05).转染空质粒组和未转染质粒组之间,对细胞凋亡率、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA进行比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论成功将HBX转染入HL7702细胞,并在细胞中表达;转染后72 h HBx可上调Bax表达,而下调Bcl-2表达,表明HBx能促进HL7702细胞凋亡.     

人颗粒溶素基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的： 构建人颗粒溶素（GNLY） 全长编码序列的真核表达载体,转染肿瘤细胞,观察GNLY在细胞内的表达及其对细胞增殖的抑制作用. 方法：用RT-PCR技术获取人GNLY 全长编码序列cDNA,克隆至pGEM-T 载体进行测序,再将克隆片段插入质粒pcDNA3.1（＋）中,构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY,用阳离子聚合物转染试剂转染肝癌细胞系SMMC-7721,检测目的基因mRNA的表达,WST-8法检测细胞增殖活性. 结果：获得人GNLY全长编码序列cDNA ,并成功构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY;转染SMMC-7721细胞后,检测出目的基因mRNA的表达;重组质粒转染组与空质粒对照组细胞增殖活性有非常显著性差异（P〈0.01和P〈0.001）,并且随着转染基因浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,2.0μg/ml pcDNA3.1（＋）/GNLY转染组细胞增殖活性下降至0.329. 结论：pcDNA3.1（＋）/GNLY真核表达载体构建成功,GNLY基因转染对SMMC-7721细胞能产生细胞毒性效应,对肝癌细胞具有一定的杀伤作用.     

SOX7基因对肝癌细胞凋亡、氧化应激 及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的探讨过表达SOX7对肝癌细胞凋亡、活性氧（ROS）水平及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法人肝癌Huh-7细胞分为空白组、空质粒pcDNA3.1组（Vector组）和pcDNA3.1-SOX7重组质粒组（pcDNA3.1-SOX7组）。转染48 h,Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡试剂盒、DCFH-DA法及Western blotting分别检测细胞凋亡率、ROS含量及SOX7、β-catenin、cyclin D1和cleaved-caspase 3蛋白表达。MTT法检测pcDNA3.1转染24 h、48 h和72 h的细胞活力。结果pcDNA3.1-SOX7重组质粒组SOX7蛋白表达明显高于空白组（P < 0.05）。与空白组比较,pcDNA3.1-SOX7组细胞活力及β-catenin和cyclin D1蛋白表达均明显降低,细胞凋亡率、ROS含量及cleaved-caspase 3蛋白表达明显升高（P < 0.05）。结论过表达SOX7可诱导肝癌细胞凋亡,凋亡机制与细胞内ROS水平提高及Wnt/β-catenin信号通路抑制有关。     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染+丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义(F=6 250.510,q=56.992、51.613,P<0.01)。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

肿瘤相关抗原MAGE-1体外诱导抗肿瘤免疫应答

目的：研究肿瘤相关抗原MAGE-1的抗肿瘤生物活性。方法：取健康人外周血,分离树突状细胞和T淋巴细胞。用脂质体介导法分别将质粒pcDNA3.1-MAGE-1和pcDNA3.1转染人肝癌SMMC-7721细胞株,设未转染的SMMC-7721细胞株为空白对照组,应用Real-timePCR检测3组细胞中MAGE-1 mRNA的表达;再分别用以上3种细胞的冻融抗原致敏树突状细胞,使其激活T淋巴细胞成为细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。应用乳酸脱氢酶释放法检测CTL对野生型SMMC-7721细胞的杀伤活性。结果：pcDNA3.1-MAGE-1转染组MAGE-1 mRNA的表达量为（1.211±0.586）,空质粒转染组及未转染组分别为（0.412±0.021）和（0.452±0.317）,3组比较,差异有统计学意义（F=538.652,P〈0.001）。转染pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒、pcDNA3.1空质粒的SMMC-7721细胞和未转染的野生型SMMC-7721细胞的冻融抗原所激活的CTL对野生型SMMC-7721细胞的杀伤活性分别为（48.26±2.47）%、（25.84±2.72）%和（26.27±0.81）%,3组比较,差异有统计学意义（F=139.607,P〈0.001）。结论：肿瘤相关抗原MAGE-1能够在体外诱导细胞抗肿瘤免疫反应。     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

抑癌基因ING2真核表达质粒的建立及其对肺癌细胞生长的影响

目的 构建抑癌基因生长抑制因子2(ING2)真核表达载体,研究p33ING2对人肺腺癌细胞A549及人小细胞肺癌细胞NCI-H446体外生长的影响.方法 构建ING2基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-ING2,采用脂质体法分别转染A549和NCI-H446细胞,以未转染组和转染pcDNA3.1(+)空质粒组作为对照,应用RT-PCR、细胞免疫组化和Western blot法分析目的基因及其蛋白表达,CCK8试剂盒分析其对细胞生长的影响,Annexin V-FITC和PI双染流式细胞术观察细胞凋亡的情况.结果 成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1(+)- ING2,转染后细胞株高水平表达ING2 mRNA及p33ING2蛋白.CCK8法检测结果显示:转染pcDNA3.1(+)-ING2的A549细胞和NCI-H446细胞增殖受到抑制,抑制率与pcDNA3.1(+)空质粒转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01).流式细胞术凋亡检测结果显示:转染pcDNA3.1(+)-ING2的A549细胞和NCI-H446细胞组凋亡率均高于未转染组和pcDNA3.1(+)空质粒转染组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 ING2蛋白表达能抑制人肺腺癌细胞A549和人小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖及增加细胞凋亡率.     

p73β基因转染对胃癌细胞的生物学影响

目的研究人p73β基因转染对人胃癌细胞SGC-7901的生物学影响,探讨p73β基因抑制SGC-7901细胞增殖的机制。方法用脂质体转染法瞬时转染SGC-7901细胞,转染重组质粒pcDNA3.1-p73β（SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组）和空载质粒pcDNA3.1-N0（SGC-7901-pcDNA3.1-N0组）,并用未转染质粒具有相同遗传背景和代数的SGC-7901细胞作为空白对照（SGC-7901组）。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞中P73β、p21、c-myc表达量变化,MTT法观察细胞增殖的活力,原位细胞凋亡检测TUNEL法观察细胞凋亡。结果RT-PCR检测发现SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞与SGC-7901-pcDNA3.1-N0和SGC-7901两对照组相比,其p73β表达明显增高,p21相对表达量明显增多,c-myc相对表达量明显减少。与两对照组相比,SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞增殖率明显减弱,细胞凋亡率明显增高（均P〈0.05）。结论p73β基因可以促进SGC-7901细胞内p21基因的表达,抑制c-myc基因表达。p73β基因可降低胃癌细胞增殖力,诱导胃癌细胞凋亡。     

hMLH1基因对人卵巢癌耐药细胞株顺铂敏感性的研究

目的 探讨错配修复基因hMLH1对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP顺铂耐药的逆转作用及其机制.方法 分别用重组质粒pcDNA3.1-hMLH1和空质粒pcDNA3.1转染SKOV3/DDP细胞.RT-PCR和Western blot检测hMLH1的表达.MTT检测转染前后SKOV3/DDP细胞对顺铂敏感性的变化.经顺铂DDP作用后,流式细胞术和Western blot法检测细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,瞬时转染24 h后,SKOV3/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05).MTT结果显示,转染细胞的IC50值(13.95±2.45)较未转染的细胞(94.16±5.18)明显减小.流式细胞仪和Western blot检测结果表明,顺铂作用24 h后,转染了重组质粒的耐药细胞的凋亡率提高到(33.33±2 31)%,同时凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达受到抑制(1.35±0.39),与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 hMLH1基因能增强卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与降低该耐药细胞内Bcl-2的表达水平,促进细胞凋亡有关.     

HIF-1对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用。方法将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染入SiHa细胞中,分别命名为fLHIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组。应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测。应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况。结果免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下,fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pcDNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。     

RNAi沉默Plk1对胰腺癌细胞系AsPC-1侵袭转移的影响

目的 探讨RNAi沉默Plk1基因表达与胰腺癌细胞侵袭转移能力的关系.方法 根据Plk1基因特点,设计并用化学方法合成了4个小干扰核糖核酸分子（siRNA） （shplk 1-1、shplk 1-2、shplk1-3、shplk1-4）,脂质体转染法将短链siRNA转入AsPC-1细胞;细胞分为：未处理组为对照组、空质粒组、shplk1-1组、shplk1-2组、shplk1-3组、shplk1-4组.采用RT-PCR和Western blot法检测siRNA对Plk1表达的抑制效果;采用Transwell法检测转染后细胞侵袭能力;采用划痕实验检测转然后细胞迁移能力.结果 RT-PCR和Western blot结果示所设计的4个siRNA均能明显抑制AsPC-1细胞Plk1 mRNA水平,以shplk1-3效果最好,与对照组、空质粒组及其他三组比较,转染shplk1-3组Hk1 mRNA和蛋白的表达水平显著降低（P＜0.01）;以转染shplk1-3处理AsPC-1细胞后与对照组、空质粒组比较,Transwell侵袭实验证实：细胞转染24 h后,正常对照组、空质粒组和shplk1-3组穿过人工基底膜的侵袭细胞数分别为（195±16）、（176±13）、（83±5）个,侵袭能力明显降低,差异有高度统计学意义（P＜0.01）;细胞划痕实验证实：shplk 1-3组迁移能力明显降低.结论 抑制胰腺癌细胞Plk1基因,侵袭迁移能力明显降低,能够为胰腺癌的治疗提供新的策略.     

人生长激素释放激素变异受体1型基因绿色荧光蛋白真核表达载体1的构建及体外表达

目的构建人生长激素释放激素变异受体1型（GHRHR-SVT1）基因绿色荧光蛋白真核表达载体1（pEG—FP—N1）并在鼠成纤维细胞株NIH-3T3细胞中的表达。方法GHRHR-SVT1基因是由人胃癌细胞株AGS中扩增出的DNA片段,克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,用高效转染试剂将pEGFP-N1／GHRHR—SVT1转染NIH-3T3细胞,NIH-3T3细胞分3组：非转染组（对照组）,只加转染试剂不加质粒;转染空质粒组（pEGFP-N1组）,加转染试剂与空质粒;重组质粒转染组（pEGFP-N1／GHRHR-SVT1组）,加转染试剂与重组质粒。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞仪检测各组转染后各组NIH-3T3细胞的生长情况。结果（1）pGEFP—N1／GHRHR-SVT1经限制性内切酶XhoⅠ和BarnHⅠ双酶切产生约1080bp和4700bp2条带。（2）构建的GHRHR-SVT1cDNA序列与GHRHR—SVT1原始序列（AF-282259）进行对比,第54位碱基突变（A突变为T）,为无义突变。（3）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖率明显高于对照组（P〈0．01）。（4）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖指数明显高于对照组（P〈0．01）。结论在适当浓度GHRH（10μmol／L）的培养基中,GHRHR—SVT1能够促进NIH-3T3细胞增殖,并为肿瘤的治疗提供新的思路。     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。     

多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1表达及细胞增殖的影响

目的 研究多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1(Cav-1)表达及细胞增殖的影响.方法 通过Real-time PCR和Western-blot检测不同浓度多西他赛作用下乳腺癌细胞MCF-7中Cav-1的表达情况;野生型MCF-7细胞株为对照组,通过基因转染技术建立Cav-1 过表达的MCF-7细胞株(转染组)及空载体的MCF-7细胞株(空载体组),利用CCK-8比色法分析多西他赛对各组细胞增殖的影响.通过Western-blot分别检测多西他赛作用下各组细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况以及PI3K/AKT 信号转导通路的活化情况.结果 在5~40 μg/mL浓度范围内,随着多西他赛作用浓度的增大,MCF-7细胞中Cav-1的蛋白表达量逐渐增加.不同浓度多西他赛对MCF-7细胞的增殖均有明显的抑制作用;在同一浓度多西他赛作用下,转染Cav-1组细胞的增殖抑制率明显高于对照组和空载体组(P<0.01).与对照组和空载体组相比,20 μg/mL多西他赛作用后转染组细胞中Bax的表达升高(P<0.01),而Bcl-2的表达降低(P<0.01),并且磷酸化AKT (p-AKT)蛋白的表达水平下降(P<0.01),而对照组和空载体组之间Bax、Bcl-2以及p-AKT蛋白的表达则无明显差异(P>0.05).结论 多西他赛可以通过促进Cav-1的表达影响PI3K/AKT 信号转导通路,进而调节凋亡相关蛋白的表达抑制MCF-7 细胞的增殖.     

NDRG1干扰载体的构建及稳定过表达NDRG1人脑微血管内皮细胞的建立

目的：构建N-myc下游调节基因1 (NDRG1)的shRNA干扰载体和过表达载体,转染人脑微血管内皮细胞（hCMECs）后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞。方法：将pGPU6-GFP质粒采用Bam HⅠ和BbsⅠ双酶切后,分别与设计的8条shRNA连接构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体,经测序鉴定后采用Lipofectamine 2000转染hCMECs,采用荧光显微镜观察载体转染效率,将PCR扩增的NDRG1编码区序列与pMD19-T连接,经测序正确后将重组质粒与pcDNA3.1空质粒采用限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ双酶切,连接后构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体,采用Lipofectamine 2000将测序正确的过表达载体转染hCMECs,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测干扰和过表达的hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平,Western blotting法检测hCMECs中NDRG1蛋白表达水平,采用新霉素筛选出阳性克隆hCMECs。结果：pGPU6-GFP载体经双酶切后,电泳结果显示完全线性化,测序...     

脆性位点基因WWOX调控人胆囊癌细胞的体外增殖效应

［摘要］目的　探讨脆性基因WWOX调控胆囊癌细胞的增殖效应及其机制．方法　将前期成功构建的pcDNA3.0-WWOX重组质粒按脂质体介导转染GBC-SD细胞,同时转染空载体、脂质体为阴性对照及GBC-SD为空白对照．转染48 h后采用倒置显微镜观察各组胆囊癌细胞形态学变化,MTT、BrdU检测胆囊癌细胞增殖水平,流式细胞仪检测细胞增值周期的变化．结果　倒置显微镜观察pcDNA3.0-WWOX组GBC-SD细胞数量明显减少,悬浮细胞及细胞碎片增加,而Vector control、NC、Mock组细胞呈正常增殖状态．MTT检测显示pcDNA3.0-WWOX组GBC-SD细胞增殖于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,并随时间推移,pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性抑制明显．BrdU检测显示pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖率为（0.44±0.03）,对照组分别为（0.78±0.02）,（0.81±0.01）,（0.85±0.01）,表明pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性较对照组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）．细胞周期检测发现pcDNA3.0-WWOX组G0 /G1期细胞增多,G2 /M 期和S 期细胞减少,细胞凋亡率较对照组（Vector control,NC,Mock）明显增高、增殖指数下降（P＜0.05）,而对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）．结论　过表达WWOX基因体外可有效抑制胆囊癌细胞增殖活性, WWOX可能参与胆囊癌细胞恶性生物学行为的发展过程,有望成为胆囊癌基因治疗新的潜在靶点．     

人LncRNA MIR31HG基因稳定转染PC9细胞系的构建及其对细胞增殖和迁移的影响

目的：检测过表达人MIR31HG基因对PC9细胞增殖和迁移的影响,阐明促癌基因MIR31HG的作用机制。方法：通过RT-PCR法扩增长链非编码RNA（LncRNA）MIR31HG全长序列,分子克隆至pcDNA3.1（-）真核表达载体,将pcDNA3.1-MIR31HG过表达质粒和对照质粒pcDNA3.1分别转染人肺癌PC9细胞。采用酶切鉴定法检测MIR31HG过表达载体的构建情况。通过G418药物筛选建立稳定过表达MIR31HG的PC9细胞系（PC9-pcDNA3.1-MIR31HG,稳定转染组）和对照细胞系（PC9-pcDNA3.1,空载体组）。采用RT-PCR法检测稳定转染细胞系中MIR31HG基因表达水平,采用CCK-8法和划痕愈合实验检测PC9细胞增殖活性和迁移能力。结果：琼脂糖凝胶电泳,成功扩增得到了MIR31HG的特异基因片段;MIR31HG真核表达载体经双酶切后分别产生目的基因和载体2个片段。RT-PCR法检测,稳定转染组细胞中MIR31HG mRNA表达水平明显高于空载体组（P<0.05）。CCK-8检测,在培养24、36和48h时,稳定转染组细胞增殖活性明显高于空载体组（P<0.01）。划痕愈合实验,在培养48h时,稳定转染组细胞划痕愈合率明显高于空载体组（P<0.05）。结论：成功构建了人LncRNA MIR31HG基因的真核过表达载体和过表达MIR31HG的稳定转染PC9细胞系,且MIR31HG过表达能够促进肺癌PC9细胞增殖和迁移。     

JAB1对缺氧环境肺癌A549细胞化疗敏感性调控的研究

目的观察导入pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒的肺癌A549细胞,在低氧环境下对健择(Gemzar)的化疗敏感性,以期找到一种提高肺癌化疗敏感性的方法。方法首先构建缺氧反应元件启动的pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒,鉴定后将该质粒导入肺癌A549细胞。在低氧环境培养过程中加入化疗药物Gemzar,观察空白组(A549)、空载体组(A549+pcD-NA3.1-HRE)和质粒组(A549+pcDNA3.1-HRE-JAB1)肺癌A549细胞对Gemzar的敏感性。采用Real-time PCR和Westernblot分别检测各组肺癌A549细胞中JAB1的mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术检测各组肺癌A549细胞周期分布和凋亡情况。结果通过双酶切鉴定,确定构建获得了pcDNA3.1-HRE-JAB1质粒。在有化疗药物Gemzar的情况下,质粒组分别与空白组或空载体组比较,质粒组肺癌A549细胞中JAB1mRNA和蛋白表达水平明显增加(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),而细胞周期被明显阻滞于G1期(P<0.01)。结论 JAB1在低氧环境下高表达提高了药物Gemzar化疗的敏感性,这将可能成为一种理想的提高肺癌或其他实体恶性肿瘤化疗敏感性的手段。     

重组腺病毒CXCR7-siRNA对人胃癌细胞增殖及迁移的影响

目的 体外考察趋化因子受体7 （chemokine receptor 7,CXCR7）在胃癌细胞MGC-803中的表达和CXCR7-siRNA重组腺病毒表达载体靶向抑制CXCR7的表达对人胃癌细胞MGC-803增殖、迁移活性的影响.方法 将MGC-803细胞分为实验组、空载体组及空白对照组,实验组加入CXCR7-siRNA重组腺病毒,空载体组加入空载腺病毒,空白对照组加入等量容积细胞培养基.噻唑蓝（MTT）法测各组细胞增殖活性;Hoechst 33258 染色法观察各组细胞凋亡情况;Western blot 免疫印迹法检测各组MGC-803细胞中CXCR7的表达情况及凋亡执行蛋白Caspase-3 表达情况; Transwell细胞迁移实验检测各组细胞趋化活性.结果 实验组细胞增殖受到抑制,转染3天后,实验组细胞MTT值为1.22±0.01,与空载体转染组（1.48±0.05）及空白对照组（1.61±0.03）比较,差异有统计学意义（F=31.2,P＜0.05）.实验组细胞凋亡比率为（37.66±1.31）%,与空载体组（3.39±0.76）%及空白对照组（13.12±0.85）%比较差异具有统计学意义（F=391.9,P〈0.05）.实验组CXCR7表达水平低于空载体组和空白对照组;实验组Caspase-3剪切激活,空载体组见少许Caspase-3剪切激活,空白对照组未见Caspase-3剪切激活;转染3天后,Transwell细胞迁移实验显示实验组穿透滤过膜细胞数量（15.00±1.73）,较空载体组（35±2.89）及空白对照组（37±4.04）显著减少,差异均有统计学意义（F=12.51,P〈0.05）.结论 靶向沉默CXCR7的表达抑制胃癌细胞MGC-803的增殖和迁移活性.     

LEF-1截短型基因真核荧光表达载体的构建及其在SW480细胞系中的功能研究

目的 构建LEF-1截短型基因的真核表达荧光质粒,在真核细胞中表达,并检测其对人结肠癌细胞系SW480增殖和凋亡的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆LEF-1截短型的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,同时插入红色荧光示踪片段mRFP.用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-LEF-1-mRFP瞬时转染Hela细胞,通过Western blot和流式细胞仪检测LEF-1截短型的表达,同法瞬时转染SW480细胞,观察细胞形态变化,MTT检测对细胞生长的影响,CSFE染色检测细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,PI染色检测细胞周期.结果 克隆LEF-1截短型的编码基因,经测序比对证实与GenBank中给出的序列一致,以含有LEF-1截短型的编码基因的真核表达荧光载体瞬时转染Hela细胞.LEF-1截短型基因的表达产物通过Westemblot和流式细胞仪方法得到证实,转染SW480细胞.光镜下观察发现部分细胞中出现颗粒,失去正常形态,细胞数目明显减少;MTT检测显示细胞活性下降,流式检测显示细胞增殖受到抑制,凋亡水平增加,细胞在G_(0/1)期发生阻滞.结论 成功构建LEF-1截短型的编码基因的真核荧光表达载体,证实其在真核细胞HeM中可以表达.同时可以抑制SW480细胞的活性和增殖,促进其凋亡,细胞被阻滞在G_(0/1)期,

Abstract：

Objective To construct a eukaryotic fluorescent expression vector of truncated lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF-1) gene and investigate its effect on the proliferation and apoptosis of human colonic carcinoma cell line SW480. Methods Truncated LEF-1 gene was obtained by PCR and DNA recombination from human lymphoid node cDNA library. The PCR product of LEF-1 gene was inserted into the plasmid pMD-18T and sequenced. The truncated LEF-1 gene was inserted into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 and fused with mRFP for tracing. Using Lipofectamine~(TM) 2000, the plasmid pcDNA3.1 -LEF-1 -mRFP was transfected into Hela cells and detected by Western blotting and fluorescence activated cell sorting (FACS). The changes in the growth, proliferation and apoptosis of the SW480 cells were observed after transfection with the plasmids. Results The truncated LEF-1 gene was successfully cloned. After transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, the Hela cells expressed the product of LEF-1 as detected by Western blotting and FACS. The growth and proliferation of SW480 cells was inhibited and the cell apoptosis increased after transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, which also caused cell cycle arrest in G_(0/1) phase. Conclusion The eukaryotic expression fluorescent vector pcDNA3.1-LEF-1-mRFP has been constructed and expressed in eukaryotic cell line successfully. The truncated LEF-1 protein expressed in the transfected SW480 cells results in inhibition of the cell growth and proliferation with increased cell apoptosis and cell cycle arrest in G_(0/1) phase.