骨髓基质饲养层对精原干细胞体外培养的影响

目的以原代培养小鼠骨髓基质细胞为饲养层，探讨精原干细胞能否在该饲养层上生长及生长的影响因素。方法采用原代培养的小鼠骨髓基质细胞，待细胞长成单层后用丝裂霉素C处理并接种生精细胞共培养。结果原代的小鼠培养骨髓基质细胞能很好的维持精原干细胞的非分化性扩增。结论小鼠原代培养的骨髓基质细胞能作为饲养层支持精原干细胞体外非分化性扩增，该细胞有望成为干细胞培养的新的饲养层。     

小鼠精原干细胞体外培养的研究

目的建立精原干细胞与Sertoli共培养细胞模型,探讨Sertoli支持精原干细胞扩增的可能机制。方法以7—8 d龄小鼠为材料,Percoll密度梯度离心,并将分离后的生精细胞接种至Sertoli饲养层上,37℃下共培养,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长特点,并对培养15 d的细胞进行苏木精-伊红染色、C-Kit受体检测。结果①增殖细胞的生长特点及形态学特征与文献报道精原干细胞的特征相符合。②苏木精-伊红染色显示培养的生殖细胞大小均匀,核大而圆着色深。C-Kit受体显示细胞膜呈强阳性,背景基质细胞为阴性。这些均符合精原干细胞的生物学特征。结论精原干细胞在未加入细胞因子的Sertoli饲养层中能较长时间生长并分裂增殖。     

小鼠精原干细胞生物学特征的研究

目的:探讨培养状态下精原干细胞的生物学特征,为体外鉴定精原干细胞及认识精原干细胞在体内的生物学行为打下实验基础.方法:在预先制备的骨髓基质饲养单层上接种生后6～10天雄性小鼠生精细胞,于IMDM培养基及37℃下培养,倒置显微镜观察细胞增殖行为并对增殖后的细胞进行组织学、细胞化学、免疫组化及遗传学检测.结果:培养状态下的精原干细胞增殖经历了短暂增殖期、静止期和分离增生期三个阶段,且增殖细胞呈簇、团状生长,细胞问可见明显的胞质间桥,细胞核大,核/质比高,碱性磷酸酶及C-KIT受体阳性,染色体核型为20对(40条).结论:精原干细胞具有典型的生物学行为和特征,结合行为及生物学特征可对增殖的精原干细胞进行鉴定.     

GDNF和SCF促进小鼠精原干细胞增殖与分化的研究

目的 探讨小鼠精原干细胞增殖和分化体外控制的可行性.方法 采取7～8日龄雄性小鼠睾丸,分离纯化精原干细胞接种在添加神经营养因子的培养基内进行增殖培养,7 d后更换添加干细胞生长因子的培养基.结果 SSCs接种于Sertoli细胞饲养层上4 d后,出现了增殖现象,可见增殖产生SSCs克隆,AKP染色阳性,β1整合素免疫细胞化学染色阳性,RT-PCR扩增出长度约为120 bp的Oct-4和280 bp的c-kit条带.结论 小鼠精原干细胞在添加50 ng/mL GDNF的培养基内培养7 d后更换添加10 ng/mL SCF的培养基可以实现小鼠SSCs从增殖到分化的转变.     

小鼠骨髓基质干细胞的培养及常见的组化染色方法

目的:研究小鼠骨髓基质干细胞的培养条件及其成为组织工程种子细胞的可能性.方法:取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、光镜及扫描电镜观察,了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点.结果:刚接种的干细胞散在分布,胞体透亮,1～2 d后开始贴壁,1周后开始形成成纤维细胞样集落,大约2周长成单层,碱性磷酸酶染色阳性,细胞可分泌胶原,可形成钙结节.结论:小鼠骨髓基质干细胞可在体外进行培养增殖并具有组织工程种子细胞的特点.     

原代培养猴骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的 :原代培养猴骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞 ,比较两种原代培养细胞形态、生长状况的差异性 .方法 :以骨髓悬液直接贴壁培养的方法获取骨髓基质细胞 ,以Per coll细胞分离介质 (质量浓度 10 73g·L-1)分离出骨髓悬液中的骨髓间充质干细胞 ,用含 10 0mL·L-1胎牛血清的DMEM培养液分别进行培养 ,观察细胞的生长状况 .结果 :原代培养的骨髓基质细胞增殖迅速 ,扩增细胞基本都呈形态均一成纤维样细胞 ,接种 1wk后细胞已长满 ,3wk后可形成钙化结节 .原代培养的骨髓间充质干细胞增殖缓慢 ,细胞增殖情况和增殖细胞形态不均一 ;有一些细胞在 4wk的培养时间内未见明显增殖 ,这些增殖不明显的细胞有的未见明显的伸张 ,呈圆形 ,有的伸展充分 ,成片状 ,偶见有神经元样的细胞出现 ;在培养 2wk后也可见一些出现明显增殖的细胞 ,分别形成克隆团状或条带状的细胞群 .结论 :非诱导条件下原代培养扩增的骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞不同 ,前者种类均一 ,可自发向成骨方向发展 ;后者则表现出间充质干细胞的多向分化潜能 .     

精原干细胞在支持细胞饲养层上的长期培养

目的建立体外研究精原干细胞与支持细胞共培养的细胞模型,研究体外精原干细胞在支持细胞层上的增殖特点。方法应用两步酶消化法,分别从14～15d及6d龄雄性昆明小鼠睾丸中分离支持细胞及精原干细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定。将精原干细胞接种在支持细胞层上,观察不同时间点精原干细胞集落形态及数目。结果在支持细胞层上培养24h后,精原干细胞开始增殖分裂,呈双细胞形态;随着培养时间延长,双细胞集落数逐渐减少,而链状细胞集落逐渐增加;培养120h后,链状细胞局部融汇堆积,且细胞集落维持在相对稳定数量。在每4～5d更换培养液的条件下,细胞集落维持稳定状态的平均时间为(51,2±5.8)d。结论精原干细胞在体外支持细胞层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可用于体外研究生精细胞增殖分化特征、药物或毒物干扰精原干细胞功能实验。     

人骨髓基质干细胞克隆对脐血造血干细胞体外扩增作用的研究

目的：探讨人骨髓基质干细胞的克隆化培养及其对体外造血干细胞扩增的影响。方法：取正常肋骨分离骨髓，制备单个核细胞贴壁培养，约5d后取集落样生长的梭形细胞扩增培养，传代、将分选的脐血造血干／祖细胞接种到克隆培养的人骨髓基质干细胞及其他培养条件液上，比较不同培养条件及不同代次骨髓基质干细胞对造血干／祖细胞扩增能力及集落形成能力的影响。结果：人骨髓基质干细胞能扩增达20代以上，经流式细胞仪检测证实基质干细胞，单纯细胞因子组和细胞因子加基质干细胞组能有效扩增造血细胞，而后者有维持长期造血的作用。结论：该克隆培养方法能有效扩增骨髓基质干细胞，培养的细胞有体外支持长期造血的作用。     

人骨髓间充质干细胞的培养及细胞增殖测定

目的 分离培养并鉴定人骨髓间充质干细胞.方法 成人骨髓取自非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性的胸外科手术中摘取的肋骨,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法进行培养;免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原.结果 人骨髓间充质干细胞(MSCs)的CD44表达阳性;早、中、晚3代传代培养具有以下共性特征:传代培养潜伏期约为24～36 h;传代培养对数增殖期约为4～6 d;对数增殖期结束后至接种后第9 d,MSCs生长逐渐缓慢,进入平台期.结论 培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞或骨髓基质中的成纤维细胞,是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞.     

兔精原干细胞培养及生物学特征的初步研究

目的:建立精原干细胞的培养方法并对培养细胞的生物学特征进行研究.方法:用饲养层和无饲养层两种方法培养幼家兔精原干细胞,在倒置相差显微镜下观察培养细胞的生长和形态变化,并对细胞的糖原、脂质及c-kit受体的细胞化学和免疫细胞化学染色结果进行分析.结果:成功的分离并培养幼家兔精原干细胞.在培养细胞中精原干细胞为主体细胞,并可见少量间质细胞.根据精原干细胞体积大小和形态特点,可分为大、小两种类型.PAS染色,精原干细胞胞质呈阳性反应;免疫细胞化学染色显示,体积较小的精原干细胞c-kit受体呈强阳性反应,体积较大的大精原干细胞呈弱阳性反应;间质细胞PAS染色和c-kit受体染色呈阴性反应,而脂质染色呈强阳性反应.精原干细胞培养无论有无饲养层,均能呈集落状生长,但有饲养层的培养,细胞的生长明显优于无饲养层培养.结论:青春期前的睾丸生精小管是精原干细胞最集中、数量最多,且容易获取分离的部位;精原干细胞的成功培养为今后重建完整的生精细胞系的治疗性移植和对这类定向干细胞的发育及分化潜能的研究提供了细胞模型.     

大鼠骨髓基质细胞的分离培养

目的：建立一种体外分离、培养扩增大鼠骨髓基质细胞的方法.方法：用密度梯度离心法（Percoll法）分离出大鼠骨髓基质细胞,并用含20%（体积分数）胎牛血清的DMEM培养液培养,胰酶消化传代,倒置显微镜下观察.结果：Percoll淋巴细胞分离液分离出的大鼠单核细胞活力达99%,将细胞接种到培养瓶10～14 d后,细胞长满瓶底,第1次传代,以后每5～7 d传代,传3～4代,细胞形态较典型.结论：PercoU法分离出离体培养的大鼠骨髓基质细胞.     

诱导兔骨髓基质细胞向神经干细胞分化的初步实验研究

目的：观察兔骨髓基质细胞体外培养的生长行为及增殖、分化情况，探讨由骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性。方法：无菌条件下行骨穿术，密度梯度离心分离获取骨髓基质细胞，利用多种增殖、分化诱导因子和神经干细胞培养液进行培养、分化诱导，用免疫细胞化学方法进行鉴定。结朵：骨髓基质细胞在体外培养中能形成NESTIN抗原阳性的细胞克隆团，进一步分化，部分细胞胞体增大并出芽，逐渐发育成为较成熟的长突起细胞，长突起相互连接、交织成网并建立纤维联系。结论：骨髓基质细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，易于取材、体外培养和增殖，在一定诱导条件下可以生成神经干细胞。     

体外诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化的形态学观察

目的:探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源.方法:无菌取成大鼠长骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(BMSC),在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞.结果:增殖培养24～72h见细胞分裂像和克隆单位;继续增殖培养仍可见细胞克隆(干细胞特性);诱导培养第10日有成熟神经细胞形成.说明BMSC在体外培养条件下,经过多种因子的"程序性"作用,可以向神经干细胞、成熟神经元及胶质细胞方向分化.结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,BMSC可成功诱导出神经元样细胞.     

小鼠精原干细胞染色体G带显示及其影响因素研究

目的:探索精原干细胞染色体G带显示技术及其影响因素,为如何鉴定培养状态下干细胞的染色体核型提供实验参考.方法:培养昆明系小白鼠精原干细胞,待细胞生长到15～20天时,吸出克隆细胞团,吹打分散后滴加秋水仙素处理4～6小时.收集细胞悬液,再经低渗处理后滴片染色制成.结果:正常小鼠精原干细胞染色体呈粒状、棒状,核型为20对,40条.结论:小鼠精原干细胞染色体受到细胞所处的分裂时期、低渗处理的效果、滴片时细胞的分散程度及胰酶浓度及消化时间等因素的影响.     

骨髓间质干细胞体外预构组织工程化肌腱的实验研究

目的探讨骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性,为构建组织工程化肌腱寻求理想方法.方法以贴壁法分离、培养骨髓间质干细胞,并检测CD44.在实验组中将骨髓间质干细胞置入含胶原-聚羟基乙酸的DMEM培基中培养:在对照组中将骨髓间质干细胞置入DMEM培基中培养.通过MTT方法比较两组的细胞活性和生长情况,并对实验组进行超微观察.以骨髓间质干细胞为种子细胞,以胶原-聚羟基乙酸为支架在体外预构组织工程化肌腱.结果以贴壁法原代培养骨髓间质干细胞,11天细胞即汇合成片,检测CD44示阳性.骨髓间质干细胞接种于胶原-聚羟基乙酸中混合培养后14天生长良好,始终保持89%以上的细胞活力,与对照组比较无显著差别;实验组细胞数未发生明显改变,而对照组从第4天开始即发生增殖.透射电镜示实验组细胞培养14天后仍保持旺盛的分泌功能.体外预构的组织工程化肌腱具有良好的形态,细胞伸展成梭形,沿聚羟基乙酸缝线大致平行排列.结论骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性好.以骨髓间质干细胞为种子细胞,以胶原-聚羟基乙酸为支架可在体外初步预构组织工程化肌腱.     

生长因子(EGF和PDGF-BB)对小鼠骨髓基质干细胞增殖的作用及其意义

目的探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和血小板源生长因子(platet-derived growth factor,PDGF-BB)对体外培养的小鼠骨髓基质干细胞(murine bone marrow stromal stem cells,mMSCs)增殖的作用,探索小鼠骨髓基质干细胞体外快速增殖的条件和方法.方法将小鼠骨髓基质干细胞进行分离和纯化培养后,加入EGF和PDGF-BB,利用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入反映细胞增殖效果,倒置显微镜下观察细胞增殖及分化状态.结果EGF和PDGF-BB干预后,3H-TdR掺入(11456.14±968.86)dpm较对照组(3271.88±420.91)dpm明显增高,说明EGF和PDGF-BB可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖;倒置显微镜下观察可见EGF和PDGF-BB处理组mMSCs具有增殖优势,分化相对延迟,而对照组提前显示出自然分化现象.结论生长因子(EGF和PDGF-BB)可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖,是小鼠骨髓基质干细胞体外大量培养和快速增殖的有效刺激因子.     

巴戟天醇提物对骨髓基质细胞增殖影响的血清药理学实验方法的建立

探讨巴戟天醇提物对骨髓基质细胞增殖影响的血清药理学实验方法的建立。方法采用MTT法检测各组给药剂量、给药时间、采血时间、血清浓度的含巴戟天醇提物的血清培养大鼠BMSCs72小时后的OD值。结果等剂量组(给药剂量),4天组(给药时间),1小时组(采血时间)的OD值,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),各组培养血清浓度的OD值20%组>10%组>5%组。结论巴戟天醇提物等剂量灌胃,给药4天,末次给药1小时后腹主动脉采血,制备血清后,以20%的浓度培养,为促进大鼠BMSCs增殖的优选方案。     

BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞体外复合培养

目的用生物活性玻璃BG/聚羟基烷酸酯PHBV复合多孔支架材料与骨髓基质细胞来源的成骨细胞体外复合培养了解其生物相容性,为骨组织工程支架材料选择提供依据。方法:将体外培养的兔骨髓基质细胞诱导分化的成骨细胞,与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养,对复合体进行形态学、扫描电镜、细胞增长能力的测定,评价细胞与材料的相容性。结果:骨髓基质细胞有较强的向成骨细胞分化和繁殖能力成骨细胞与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养8d,分布于支架材料的成骨细胞迅速分化增殖,分泌细胞外基质并形成钙结节。结论:骨髓基质细胞是骨组织种子细胞的良好来源BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞具有良好的生物相容性,是构建组织工程骨的一种理想支架材料。