血管内皮生长因子基因体外转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对人脐静脉内皮细胞的生物学作用,探讨其在人工血管抗血栓形成中应用的可行性.将真核表达质粒pCD-hVEGF165体外转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交、免疫组化及ELISA法检测VEGF基因的表达并描绘内皮细胞生长曲线.结果发现VEGF基因转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖.提示VEGF基因有可能作为增强人工血管抗血栓能力的有效候选基因.     

人内皮细胞特异性分子-1的转染及其在ECV304中的表达

目的构建人内皮细胞特异性分子-1(ESM-1)真核表达载体,转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,并在ECV 304中获得表达. 方法将ESM-1 cDNA插入真核载体pIRES的多克隆位点中,转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交,免疫组化检测ESM-1基因的表达.结果构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列分析证实,转染后发现ESM-1的表达在转录和蛋白水平都明显的增加. 结论成功构建了人 ESM-1真核表达载体和转染了人脐静脉内皮细胞系ECV304, 并获得高水平的表达,为进一步研究作好准备.     

血管内皮生长因子重组DNA的构建及体外表达

目的:以质粒PCNDA3.0为载体,研究血管内皮生长因子(VEGF)目的基因在体外真核细胞中的表达.方法:将编码人可溶性VEGF165的目的基因克隆于带有CMV启动子/增强子的PCNDA3.0载体上,重组为PCNDA3.0-VEGF165质粒载体.直接以质粒DNA形式应用脂质体介导的方法转染人脐静脉内皮细胞ECV304,收取细胞上清,用ELISA和Western blot方法检测上清中VEGF165可溶性表达产物.结果:VEGF165基因在CMV启动子/增强子的调控下,可在ECV304细胞高效表达,且在转染后72 h表达量明显高于转染后48 h的表达.结论:以质粒PCNDA3.0为载体,VEGF165基因可以在体外真核细胞中表达,为治疗缺血性疾病提供一个新的基因治疗途径.     

VEGF121转染对诱导后血管内皮细胞增殖的影响

目的 探讨VEGF基因转染对VEGF诱导后血管内皮细胞生物学功能的影响,为组织工程血管构建提供血管内皮细胞的可能性.方法 应用VEGF体外诱导兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化成血管内皮细胞后,再通过脂质体介导的方法将pCDI/VEGF121转染分化后的血管内皮细胞,通过MTT及流式细胞仪检测转染前后细胞的增殖与凋亡能力.结果 诱导培养2周后兔骨髓基质细胞转化为血管内皮细胞,VEGF基因转染血管内皮细胞后表达VEGF蛋白,转染后细胞增殖能力增加,凋亡能力下降.结论 转染VEGF是促进VEGF诱导血管内皮细胞增殖的有效途径,可望为组织工程血管构建提供血管内皮细胞衬层,为人工血管内皮化开辟一种新的途径.     

VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。     

抗人血管内皮生长因子发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响

目的观察抗人血管内皮生长因子（VEGF）发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304生物学特性的影响。方法将抗人VEGF发夹状核酶（RZ）基因构建的pcDNA3.1＋/RZ转染ECV304细胞,经G418筛选后,用RT-PCR法鉴定RZ基因在ECV304细胞中的转录,用MTT法和流式细胞仪检测转染前后ECV304细胞增殖活力和细胞周期,ELISA法检测细胞上清VEGF的表达水平。结果RZ基因在ECV304细胞中获得转录,它不改变细胞增殖活力和细胞周期,但能明显下调VEGF的表达。结论抗人VEGF发夹状核酶能够显著抑制ECV304细胞VEGF的表达,为进一步开展核酶的肿瘤基因治疗提供了实验依据。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及与活性测定

目的：探讨人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法：制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞，收获转染后24h至6d的转染上清和细胞，采用RT－PCR技术，免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达，用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性.方法制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性.结果VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性.结论VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF.     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子(VECF)基因修饰的免骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法 制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VFGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VECF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性。结论 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

血管内皮生长因子在内皮细胞的稳定表达促进一氧化氮分泌

目的：建立稳定表达血管内皮生长因子的人脐静脉内皮细胞系，研究转染后对内皮细胞生长和一氧化氮分泌的影响。方法：将真核表达载体PCD2－VEGF121，用阳离脂质介导，转染人脐静内皮细胞系细胞，分别用RT－PCR、免疫组化，Miles实验检测血管内皮生长因子的转录，蛋白质的表达及其生长物学活性，检测转染后内皮细胞生长状况和培养基中一氧化氮水平，结果：RT－PCR检测出了转录血内皮生长因子的稳定转染细胞克隆，该单克隆细胞的免疫组化检测血管内皮生长因子蛋白质表达结果呈阳性，Miles实验表明其表达产物具有生物学活性，而作为对照的转空白质粒细胞和未转染细胞上述实验结果皆为阴性；转染后内皮细胞生长明显加快，一氧化氮水平在48h和72h时明显增高，结论：成功建立了稳定表达血管内皮生长因子的内皮细胞系，血管内皮生长因子转染可促进内皮细胞生长和一氧化氮分泌。     

AKT对低氧模型细胞的促增殖作用

目的验证转染丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT/PKB)基因对缺氧损伤内皮细胞的生物学作用。方法首先构建人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的氯化镍(NiCl2)模拟低氧模型,Western blot检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达以鉴定模型是否构建成功。然后,分别转染血管内皮生长因子(VEGF)、AKT及两种基因联合转染模拟低氧模型。继续培养转染后细胞1、2、3、4d,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验检测细胞增殖率。结果转染VEGF组、转染AKT组、转染VEGF与AKT双质粒组细胞增殖能力较单纯NiCl2组(模型组)均有增高,转染AKT组高于单独转染VEGF组,转染VEGF与AKT双基因组最高。结论转染AKT基因能够促进缺氧损伤的内皮细胞增殖,单独转染AKT比单独转染VEGF的作用强,同时转染AKT、VEGF促内皮细胞增殖作用最强。     

ZNF580过表达对内皮细胞血管内皮生长因子的表达及增殖能力的影响

【目的】研究人锌指蛋白新基因ZNF580过表达对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及增殖能力的变化,为探讨ZNF580基因功能提供科学依据。【方法】重组质粒pEGFP-ZNF580经LipofectamineTM2000脂质体转染法转染EA.hy926细胞,48h后荧光显微镜下观察ZNF580-EGFP在内皮细胞中的表达情况;应用半定量RT-PCR、Western blotting及ELISE法检测转染前后内皮细胞ZNF580和VEGFmRNA、蛋白表达的变化;运用MTT实验检测转染前后内皮细胞增殖能力的改变。【结果】荧光显微镜下示融合蛋白ZNF580-EGFP在EA.hy926细胞核中表达;ZNF580基因过表达后,内皮细胞VEGFmRNA及蛋白的表达均上调(P<0.05),且其增殖能力显著升高(P<0.01)。【结论】ZNF580可以调控EA.hy926细胞VEGF的表达,且ZNF580在内皮细胞增殖过程中具有重要的调节作用。     

canstatin基因在体外培养血管内皮细胞中的表达及其意义

目的 探讨canstatin基因通过电穿孔法在体外培养人脐静脉内皮细胞中的表达及对其生长与凋亡的影响.方法 将canstatin基因通过电穿孔法转染人脐静脉内皮细胞HUV-ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆.用RT-PCR检测canstatin在转基因细胞mRNA中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性.结果 检测到canstatin在转染人脐静脉内皮细胞中的表达,canstatin基因转染内皮细胞组的凋亡率(16.90%)高于空载体组(1.47%)和亲代细胞组(2.85%)(P＜0.01),转染细胞生长明显受抑.结论 canstatin能特异地抑制血管内皮细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

携载VEGF基因的聚四氟乙烯血管材料对内皮细胞生长的促进作用

目的:研究聚四氟乙烯(PTFE)血管材料携载血管内皮生长因子(VEGF)基因并促进内皮细胞生长的可行性. 方法:将pCDI-hVEGF121/pCDI质粒溶液处理过的PTFE人工血管修剪成圆片,置于生理盐水中并于0.5, 1, 2, 4, 8, 16,24, 48和72 h测定溶液的吸光度,计算出溶液的DNA浓度,绘出体外释放曲线. 分离和培养人脐静脉内皮细胞,将内皮细胞种植到携带基因质粒的PTFE材料表面,在6, 24, 72和120 h检测细胞增殖情况并用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白的表达量. 结果:体外释放曲线提示在0.5～4 h的这段时间内,质粒释放较快,随后进入缓慢增长期,直至72 h仍有质粒的释放. 在24, 72和120 h时间点,VEGF质粒组PTFE材料上的内皮细胞数和增长倍率都明显高于空质粒组材料(P<0.05),在6, 24, 72和120 h时间点,VEGF质粒组培养液的VEGF蛋白水平和增长倍率也明显高于空质粒组(P<0.01). 结论:证实了PTFE材料携带VEGF基因转染内皮细胞并具有促进其生长的可能性.     

血管内皮生长因子的基因克隆与表达

目的　构建编码正反义血管内皮生长因子 1 65(vascularendothelialgrowthfactor 1 65 ,VEGF1 6 5)的真核表达质粒 ,观察质粒转染体外培养的人脐静脉血管内皮细胞 (humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)后 ,靶细胞VEGF的分泌及细胞生长速度是否发生改变。方法　RT PCR从人胚胎肾组织中获hVEGF1 6 5的cDNA片段 ,构建编码正反义hVEGF1 6 5真核表达质粒 (pCR3 .1 /anti VEGF1 6 5及 pCR3 .1 /VEGF1 6 5) ,通过脂质体介导将质粒转入HU VEC细胞 ,ELISA测定转染后细胞VEGF的分泌量 ,设空载体组及未转染的细胞为对照。筛选稳定表达外源基因的细胞克隆 ,在相差显微镜及透射电镜下观察转染后细胞形态是否发生变化 ,MTT方法检测细胞生长曲线是否有改变。结果　DNA测序结果 ,获得重组质粒pCR3 .1 /anti VEGF1 6 5与pCR3 .1 /VEGF1 6 5所携带的外源基因序列与文献报道的基本一致。质粒转染后靶细胞形态均无明显变化 ,仅在透射电镜下观察到与蛋白质合成相关的细胞器结构发生了相应的改变。反义VEGF转染明显降低靶细胞VEGF的分泌量 ,抑制率为 67.7% (P <0 .0 1 ) ,同时细胞生长速度明显减慢 (P <0 .0 5)。而转入正义基因的细胞VEGF的分泌量则能明显提高 ,与空白对照组比较增长率为984.8% (P <0 .0 1 ) ,细胞生长速     

辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子表达影响的初步研究

目的:观察辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体表达的影响.方法:将人脐静脉内皮细胞分为辛伐他汀组、TNF-α组、辛伐他汀+TNF-α组、IL-1β组、辛伐他汀+IL-1β组和空白对照组.采用免疫细胞化学方法,观察TNF-α和IL-1β对细胞中VEGF及其受体表达的影响,并观察辛伐他汀的干预作用.结果:TNF-α组和IL-1β组的VEGF及其受体表达明显高于空白对照组(P＜0.05),辛伐他汀十TNF-α组和辛伐他汀+IL-1β组表达分别明显低于TNF-α组和IL-1β组(P＜0.05).结论:辛伐他汀可以抑制炎性刺激导致的人脐静脉内皮细胞VEGF及其受体的表达.     

降钙素基因相关肽基因体外转染人脐静脉内皮细胞

目的：观察逆转录病毒载体介导的降钙素基因相关肽（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ,ＣＧＲＰ）基因对人脐静脉内皮细胞的作用,探讨其应用于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建含有ＣＧＲＰｃＤＮＡ的逆转录病毒载体,体外转染人脐静脉内皮细胞。用ＲＴＰＣＲ及放射免疫法分析检测基因表达水平。应用细胞计数及流式细胞仪观察ＣＧＲＰ基因对内皮细胞生长的影响。结果：逆转录病毒载体能有效地将外源性基因导入血管内皮细胞并稳定表达。导入ＣＧＲＰ基因可以促进内皮细胞的分裂增殖,从而加速损伤内皮的修复。结论：ＣＧＲＰ基因有可能作为动脉粥样硬化及再狭窄基因治疗的有效候选基因     

VEGF对内皮抑素诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)对内皮抑素(ES)诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用.方法 构建携带ES基因的重组腺病毒Ad-ES感染脐静脉内皮细胞ECV-304,用RT-PCR及Western blot检测ES的转录和表达;实验组为Ad-ES+VEGF组,空白对照组为空载重组腺病毒Ad-Track组,阴性对照组为...     

VEGF对体外培养的人脐静脉内皮细胞Ets-1的诱导表达

目的：探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）对体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中转录因子Ets-1的诱导表达。 方法：原代培养获得HUVECs;应用细胞免疫化学染色技术及形态计量分析系统Image-Pro Plus（IPP）,检测VEGF对培养的内皮细胞Ets-1蛋白的诱导表达作用并对相关指标进行半定量分析。结果：VEGF（10 μg•L^-1）可诱导内皮细胞Ets-1蛋白的短时表达升高（P<0.01）,即随时间的延长,Ets-1表达也逐渐增强,在10 min时达高峰,30 min后Ets-1表达逐渐降低到无VEGF刺激的水平。 结论：VEGF可诱导人脐静脉内皮细胞中Ets-1蛋白的短时表达增加。