整合素αV对鼻咽癌CNE-2Z细胞放疗敏感性的影响

目的：探讨粘附分子整合素αV通过细胞间相互作用，是否对鼻咽癌CNE-2Z细胞的放疗敏感性产生影响，进而初步探讨其可能机制。方法：采用liquid overlay技术进行CNE-2Z细胞三维立体（多细胞球）培养；血球计数器计数法比较在阻断整合素αV作用前后CNE-2Z细胞的放射敏感性；AnnexinV／PI双标流式细胞术检测细胞凋亡。结果：（1）成功建立CNE-2Z多细胞球培养模型；（2）CNE-2Z多细胞球在接受X射线照射后，并在一定的照射剂量下，其表达的整合素αV量，随着照射剂量的增加而增加；（3）阻断整合素αV作用后CNE-2Z多细胞球放疗敏感性增强、细胞凋亡率上调。结论：以多细胞球培养模型模拟体内实体瘤情况，证实粘附分子整合素αV的表达情况可以影响鼻咽癌CNE-2Z细胞的放疗敏感性，抑制细胞凋亡是其可能的作用机制。     

αV整合素在鼻咽癌放疗群集耐受中的作用

目的:探讨黏附分子αV整合素在鼻咽癌放疗群集耐受中的作用和机制。方法:采用liquidoverlay技术进行CNE-2Z多细胞球(multicellularspheroids,MCSs)培养,同时进行单层细胞(monolayercells,MCs)培养;免疫荧光流式细胞术、MTT比色法及血球计数器计数法比较2种培养条件下CNE-2Z细胞αV整合素表达情况、阻断αV整合素作用前后CNE-2Z细胞的放射敏感性变化AnnexinV/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡Westernblot法分别检测X射线处理、阻断αV整合素前后MCSs中SAPK/JNK信号通道的活性。结果:与MCs相比,MCSs的αV整合素表达增高[(11·64±0·35)%vs(30·15±0·64)%,t=4·947,P<0·05],放射敏感性降低;阻断αV整合素作用后,MCSs放射敏感性增强、凋亡率上调[(14·16±0·24)%vs(33·04±1·12)%,t=2·783,P<0·05];X射线照射后MCSs中SAPK/JNK信号通道表现动态磷酸化过程,其中2h磷酸化水平最高(0·6906±0·02358);阻断αV整合素作用X射线照射2h后,MCSs中SAPK/JNK信号通道磷酸化水平明显低于未阻断组[(0·2891±0·02058)vs(0·6631±0·05185),t=6·662,P<0·01]。结论:黏附分子αV整合素在鼻咽癌放疗群集耐受中发挥重要作用,可能与其抑制凋亡相关;其发挥作用的机制可能涉及SAPK/JNK信号通道的激活。     

西妥昔单抗联合放疗对鼻咽癌细胞凋亡影响的研究

目的:西妥昔单抗(C225)对鼻咽癌细胞放疗增敏作用及其相关机制的研究.方法:通过免疫细胞化学法测得EGFR在鼻咽癌CNE-2Z细胞株中的表达水平,MTT法测出西妥昔单抗在体外细胞实验中的工作浓度,克隆形成实验测定不同处理组的Do、SER值.将细胞分为对照组(N)、单纯照射组(R)、单纯用药组(C)和放疗联合使用西妥昔单抗组(RC)4组,应用流式细胞技术(Annexin V/PI标记)检测西妥昔单抗在体外对鼻咽癌细胞凋亡的影响.结果:免疫细胞化学法检测鼻咽癌CNE-2Z细胞株EGFR呈高表达水平.克隆形成实验测出放疗联合西妥昔单抗组Do低于单纯照射组,SER为1.581 1±0.035 7,P＜0.05.放疗联合用药组的细胞凋亡率为(31.9±0.98)％,单纯放疗组的细胞凋亡率为(13.1±0.60)％,单纯用药组的细胞凋亡率为(6.4±0.95)％,对照组的细胞凋亡率为(2.5±0.51)％,放疗联合用药组的细胞凋亡率明显高于单纯处理组和对照组,P＜0.05.结论:西妥昔单抗增加了鼻咽癌细胞对放疗的敏感性,其机制可能与其诱导细胞凋亡有关.     

反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞乏氧条件下放射敏感性的影响

目的:探讨乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在乏氧状态下对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响.方法:氯化钴处理CNE-1细胞模拟乏氧条件下的培养传代,通过脂质体将不同HIF-1α反义寡核苷酸酸导入CNE-1细胞中,根据转染复合物的不同将CNE-1细胞分为反义联合组、正义联合组、脂质体组和单纯放疗组(放疗对照组).X射线单次照射,照射条件为照射率4 Gy/min,共8Gy,细胞照射后继续乏氧条件下培养24 h.MTT法检测CNE-1细胞的存活率,Western blotting检测CNE-1细胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表达.结果:在乏氧条件下,反义联合组的鼻咽癌CNE-1细胞存活率明显大于正义联合组和单纯放疗组.Western blotting结果显示,与正义联合组和单纯放疗组相比,反义联合组CNE-1细胞中HIF-1α蛋白表达显著下降(0.162 ±0.055vs 0.872 ±0.191,0.768±0.217,0.863±0.245,P＜0.05);同时反义联合组CNE-1细胞中VEGF蛋白的表达量较正义联合组和单纯放疗组明显减少(0.364±0.078 vs 1.165±0.346,1.068±0.379,1.087±0.266,P＜0.05).结论:HIF-1α反义寡核苷酸能有效抑制HIF-1α的表达,对乏氧状态下的鼻咽癌CNE-1细胞具有放射增敏作用.     

顺铂对人鼻咽癌CNE-2Z细胞端粒酶活性和细胞周期及凋亡的影响

目的研究顺铂对人鼻咽癌CNE-2Z细胞端粒酶活性、细胞周期及凋亡的影响,以探讨顺铂诱导CNE-2Z细胞凋亡与端粒酶活性水平的关系以及顺铂诱导鼻咽癌细胞凋亡的可能机制。方法分别以不同的药物浓度作用于体外培养的CNE-2Z细胞不同的时间,用TRAP-ELISA的方法定量检测CNE-2Z细胞在顺铂处理前后的端粒酶活性水平,同步进行细胞形态观察,流式细胞仪分析细胞周期的改变并检测凋亡。结果CNE-2Z细胞端粒酶呈阳性。用不同浓度的顺铂不同的时间作用于CNE-2Z细胞,结果细胞周期被阻滞在G1期,出现细胞凋亡,下调端粒酶活性,且呈时间依赖性及剂量依赖性。结论化疗药物顺铂可能是通过改变细胞周期分布(G1期阻滞)并同时诱导细胞凋亡、下调其端粒酶活性而发挥抗癌作用的,故可将化疗前后细胞端粒酶活性的变化作为鼻咽癌化疗敏感性指标之一。     

姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖及 凋亡的影响

 目的探讨姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖及凋亡的影响及其相关的分子机制。方法体外培养的 CNE-2Z细胞经不同剂量姜黄素处理后,用MTT法观察对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡 率的改变,Western blot检测姜黄素处理后相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平的变化。结果姜黄素对CNE-2Z细 胞的生长和增殖都具有一定程度的抑制作用,阻断细胞于S期和G2/M期。姜黄素处理后CNE-2Z细胞凋亡抑 制基因Bcl-2蛋白表达减少,同时促凋亡基因Bax蛋白表达增加。 结论姜黄素可抑制CNE-2Z细胞增殖并促进 其凋亡。     

鼻咽癌细胞系CNE-2Z放射敏感性异质性与凋亡的关系

目的评估人鼻咽癌细胞系CNE-2Z放射敏感性异质性与凋亡敏感性的相关性。方法用流式细胞仪、荧光显微镜、电镜、Western-blot检测H5和S1凋亡能力的不同及凋亡相关蛋白表达的差异。结果H5、S1两种细胞的凋亡率均随着照射后时间的延长而增加,但H5比S1高且差异有显著性(P<0.05)。结论人鼻咽癌细胞系CNE-2Z放射敏感性的异质性,与细胞受射线照射后凋亡呈正相关,对射线敏感的亚细胞系凋亡率高。     

Prohibitin在放射照射诱导鼻咽癌细胞凋亡中的表达及亚细胞定位的变化

目的:探讨放射照射诱导鼻咽癌细胞凋亡中prohibitin(PHB)的表达及亚细胞定位的改变。方法:体外培养鼻咽癌细胞系CNE-1和CNE-2,应用流式细胞术测定4 Gy X线照射前后CNE-1和CNE-2的凋亡率,Western blot检测照射前后PHB和凋亡相关蛋白Bax与P53表达水平的变化,同时应用免疫荧光染色分析上述蛋白亚细胞定位的改变。结果:X线照射后24 h,CNE-1和CNE-2细胞凋亡率、PHB蛋白表达以及凋亡相关蛋白Bax与P53的表达均较照射前显著增加(P<0.05或P<0.01)。PHB和P53在照射前均主要定位于细胞核,少量分布于胞浆,照射后胞浆荧光强度明显增加,细胞核荧光强度下降,表现为出核转运。Bax在照射前后未发现明显的细胞定位改变。结论:放射照射诱导的鼻咽癌细胞凋亡可能与PHB和P53表达及亚细胞定位改变有关。     

盐霉素增加鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的实验研究

目的:探讨盐霉素（Sal）对鼻咽癌CNE-2细胞的放疗增敏作用及其可能的机制。方法:CCK8测定不同浓度盐霉素、不同剂量放疗及联合应用对CNE-2细胞增殖的抑制作用;平板克隆实验观察盐霉素联合放疗后细胞的克隆形成率;Hoechst33258染色观察细胞凋亡;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期的变化情况。结果:CCK8结果显示,盐霉素和放疗对鼻咽癌CNE-2细胞的生长有显著的抑制作用,呈浓度和剂量依赖性,且联合组抑制作用强于单纯药物组或放疗组。平板克隆实验显示盐霉素联合放疗后能显著降低细胞的克隆形成率;Hoechst33258染色显示盐霉素联合放疗治疗后细胞凋亡现象更明显;细胞流式术检测显示联合组较单纯药物组或放疗组凋亡率增加,盐霉素对放疗具有增敏作用。药物组和放疗组均能使G2/M期细胞比例增加,两者联合效果更明显。结论:盐霉素能增加人鼻咽癌CNE-2细胞的放疗敏感性,其作用机制可能与周期阻滞及其凋亡诱导相关。     

人参皂苷Rg3对鼻咽癌肿瘤干细胞放疗增敏的作用研究

目的探讨人参皂苷Rg3对体外培养鼻咽癌肿瘤干细胞放疗敏感性的影响。方法采常规无血清悬浮培养法从鼻咽癌低分化细胞株CNE-2中筛选出鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群CNE-2S;采随机分组法将细胞分为人参皂苷Rg3组(15μg/m L)、放疗组和人参皂苷Rg3(15μg/m L)联合放疗组;人参皂苷Rg3干预4 h后,将三组细胞16 Gy放射线照射30 min,然后在培养箱内继续孵育1 d、2 d和3 d,再进行相关测定。MTT法检测各组CNE-2S细胞增殖抑制率;DAPI染色法检测各组CNE-2S细胞凋亡情况,并分析细胞的光密度和面密度变化;Elisa法检测各组CNE-2S细胞SOD水平。结果 1 d、2 d和3 d,人参皂苷Rg3联合放疗组的细胞增殖抑制率以及细胞SOD水平均明显高于人参皂苷Rg3组和放疗组,而细胞光密度、面密度明显于人参皂苷Rg3和放疗组,比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论人参皂苷Rg3可显著提高CNE-2S细胞的放疗敏感性,其促进细胞SOD表达可能是其作用机制之一。     

CD166对鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的影响

目的 探讨CD166对鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的影响.方法 采用流式细胞术检测鼻咽癌CNE-2细胞膜CD166阳性表达率,免疫磁珠分选技术获得CNE-2-CD166(+)、CNE-2-CD166(-)细胞亚群,克隆形成实验验证其放射敏感性,CCK-8法及流式细胞术检测10 Gy剂量照射前后的细胞增殖率及细胞凋亡率.结果 CNE-2细胞膜CD166阳性表达率为(24.27±5.31)％,分选后CNE-2-CD166(+)细胞CD166阳性表达率为96.5％,CNE-2-CD166(-)细胞为0.6％.克隆形成实验结果显示,CNE-2-CD166(-)细胞相对CNE-2-CD166(+)细胞的放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)为1.24.10Gy照射后24 h、48 h和72 h,CNE-2-CD166(+)细胞的存活分数分别为(76.66±3.36)％、(62.44± 1.66)％和(55.21±3.39)％,CNE-2-CD166(-)细胞为(60.34±5.13)％、(41.11±3.00)％和(35.28±4.36)％,同时段内两组细胞的存活分数比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).10 Gy照射前,CNE-2-CD 166(+)细胞和CNE-2-CD166(-)细胞凋亡率分别为(5.87±1.14)％和(6.67±1.68)％,差异无统计学意义(P＞0.05);10 Gy照射后48 h,CNE-2-CD166(+)细胞凋亡率为(19.37±2.54)％,显著低于CNE-2-CD166(-)细胞的(28.90±4.04)％,差异有统计学意义(P=0.026).结论 CD166表达阳性的鼻咽癌CNE-2细胞对放射更具抗拒性,可能与减少细胞受照射后的凋亡率降低有关.     

X线照射对鼻咽癌细胞hMSH2和hMLH1表达的影响

目的研究X线照射对鼻咽癌细胞中错配修复基因hMSH2和hMLH1表达的影响,探讨放射损伤后肿瘤细胞的DNA错配修复机制。方法将鼻咽癌CNE-1细胞分为实验组和对照组,对2组细胞进行X线分次外照射。实验组每次照射剂量为2Gy,总剂量为10Gy。对照组每次照射剂量为0Gy。应用RT-PCR、免疫细胞化学及Western blot方法,检测照射终止后不同时间点细胞hMSH2和hMLH1的表达。结果实验组细胞在照射后hMSH2mRNA和蛋白的表达均显著强于对照组(P<0.01);hMLH1mRNA及蛋白表达与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论放射可以诱导鼻咽癌细胞hMSH2表达;hMSH2对放射造成的DNA损伤可能有修复作用,这可能是临床上鼻咽癌放疗敏感性降低的原因之一。     

鼻咽癌放射敏感性异质性的形态学差异观察

目的探讨鼻咽癌放射敏感性异质性与形态学变化的相关性。方法应用电镜观察并用体视学技术测算,比较鼻咽癌细胞系CNE-2Z亚克隆株H5和S1,于体内体外照射后形态学改变的差异;用流式细胞仪、荧光显微镜检测H5和S1放射后凋亡率的不同,用Western-blot检测H5和S1放射后凋亡蛋白Bcl-2表达的差异,以期探讨其形态学异质性机制。结果H5和S1照射后形态学改变差异有显著性;照射后的H5比S1凋亡率高,对射线敏感;S1细胞的各个照射剂量组Bcl-2蛋白表达无明显差异;而H5细胞的各个照射剂量组Bcl-2蛋白表达随照射剂量的增加而递减。结论H5、S1照射后形态学的差异变化可用于预测其放射敏感性的异质性。     

X射线照射诱导鼻咽癌细胞hMSH2的表达

目的研究X射线照射对鼻咽癌CNE-1细胞错配修复基因hMSH2表达的影响,探讨放射损伤后肿瘤细胞的DNA修复机制。方法应用逆转录-PCR(RT-PCR)、免疫细胞化学及蛋白免疫印迹(Western blot)方法,检测X射线照射后对照组和实验组(照射总剂量分别为0Gy和10Gy)细胞中hM-SH2基因mRNA及蛋白表达。结果实验组细胞hMSH2基因mRNA及蛋白表达在照射终止后逐渐上调,其表达较对照组显著增强(P<0.01)。结论X射线照射可诱导鼻咽癌细胞hMSH2的表达,有助于放射损伤后肿瘤细胞DNA修复,这可能是肿瘤放疗敏感性降低的原因之一。     

miRNA-381表达及其与鼻咽癌放疗敏感性的关系

目的:观察人鼻咽癌细胞及组织中miRNA-381的表达变化,探讨其与放射敏感性的关系.方法:采用RT-PCR法测定正常鼻咽部上皮细胞株NP460,人鼻咽癌细胞株CNE-2,放疗抵抗细胞株CNE-2R及20例符合纳入标准的鼻咽癌组织中miRNA-381的表达.完成放疗后3个月接受影像学复查,分析患者的近期放疗疗效.所有病例都有2年或2年以上随访记录,根据随访记录制定放疗敏感性评估标准.采用克隆形成实验检测细胞的放疗敏感性.结果:入组患者根据放疗敏感性评估标准,分为放疗抵抗组(7例)和放疗敏感组(13例),放疗抵抗组的miRNA-381表达显著低于放疗敏感组(P＜0.01).克隆形成实验结果显示细胞的放疗敏感性为NP460＞ CNE-2＞CNE-2R,且有显著统计学差异(P＜0.01).RT-PCR结果显示正常鼻咽部上皮细胞株NP460中miRNA-381表达量高于鼻咽癌细胞株,放疗抵抗细胞株CNE-2R中miRNA-381表达量远低于其亲代细胞株CNE-2.近期疗效和鼻咽癌组织中miRNA-381相对表达量的相关性分析显示miRNA-381相对表达量与近期疗效呈正相关(r=0.77,P ＜0.000 1).结论:miRNA-381在放疗抵抗的鼻咽癌细胞及临床标本中的表达量显著低于放疗敏感的细胞及组织.miRNA-381相对表达量越高的鼻咽癌患者接受根治性放疗后的近期疗效越好.     

微小RNA hsa-miR-93靶向STAT3提高鼻咽癌对放疗敏感性的机制研究

目的 研究hsa-miR-93在鼻咽癌放疗抗拒过程中的作用及分子机制。方法 以人鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2、CNE-2R、HONE1、C666.1以及鼻咽上皮永生细胞NP460为研究对象,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组细胞经放疗后hsa-miR-93的表达;采用Western blot法检测各组细胞经放疗后STAT3蛋白的表达;通过miRWalk软件和RNAHybrid软件预测hsa-miR-93和STAT3的结合作用及结合位点;通过双荧光素酶报告基因法检测hsa-miR-93对STAT3靶向结合情况;瞬时转染小分子模拟物或抑制剂调控hsa-miR-93的表达后,采用qRT-PCR和Western blot法检测STAT3的表达;转染siSTAT3沉默STAT3的表达后,通过细胞集落形成实验检测鼻咽癌细胞经放疗后的集落形成能力。结果 与CNE-1、CNE-2细胞(相对放疗敏感)相比,hsa-miR-93在HONE1、CNE-2R细胞(相对放疗抗拒)中表达降低(P＜0.001),且各组鼻咽癌细胞经放疗后hsa-miR-93的表达呈剂量及时间依赖性降低(P＜0.05);与CNE-1、CNE-2细胞相比,STAT3在HONE1、CNE-2R细胞中表达升高,且各组鼻咽癌细胞经放疗后表达呈剂量及时间依赖性升高;经预测,hsa-miR-93可直接靶向结合STAT3。过表达hsa-miR-93可以在mRNA以及蛋白水平上显著抑制STAT3的表达(P＜0.05),而抑制hsa-miR-93的表达可以显著上调STAT3的表达(P＜0.05);过表达hsa-miR-93或沉默STAT3均使鼻咽癌细胞的集落形成显著减少(P＜0.001);抑制hsa-miR-93减弱了鼻咽癌对放疗的敏感性,而同时抑制hsa-miR-93和STAT3后,可提高鼻咽癌对放疗的敏感性。结论 hsa-miR-93可能通过靶向STAT3提高鼻咽癌对放疗的敏感性。     

奈达铂对鼻咽癌CNE-2细胞放射增敏研究

[目的]观察奈达铂对鼻咽癌CNE-2细胞系放射敏感性的影响,初步探讨其作用机制.[方法]采用CCK-8法检测奈达铂对鼻咽癌CNE-2细胞存活率影响.克隆形成实验计算各处理组的细胞存活分数,单靶多击模型拟合细胞存活曲线并求出放射敏感性参数及放射增敏比.流式细胞仪检测奈达铂用药前后的细胞周期分布及凋亡率.Western Blot检测p-AKT和bcl-2蛋白表达.[结果]奈达铂对鼻咽癌CNE-2细胞生长有抑制作用,具有时间及浓度依赖性.在奈达铂为0.25mg/L时,SERDo和SERDq分别为1.16和1.32;奈达铂0.5mg/L时,SERDo和SERDq分别达1.23和1.82.以0、0.25、0.5mg/L奈达铂作用CNE-2细胞24h时G2/M期比例分别为(3.66±0.38)％、(13.84±0.45)％和(42.09±0.79)％,凋亡率分别为(4.28±1.20)％、(6.60±1.15)％和(9.20±0.65)％,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).Western Blot结果显示:药物组、单纯照射组及联合照射组较对照组p-AKT、bcl-2蛋白表达减少,且联合照射组p-AKT、bcl-2蛋白表达低于其它各组.[结论]奈达铂对鼻咽癌CNE-2细胞系具有放射增敏作用,其机制可能与改变细胞周期分布及增加凋亡等有关.     

赫赛汀对HER-2/neu基因高表达鼻咽癌细胞株生长的影响

目的：探讨赫赛汀(Herceptin)对HER-2／neu基因高表达鼻咽癌细胞株生长的影响及机制。方法：分别采用MTT法、^3H-TdR细胞掺入法检测Herceptin对鼻咽癌细胞株CNE-22和CNE-2体外生长的影响;用流式细胞仪检测Herceptin对CNE-2Z细胞生长、细胞周期和凋亡的影响。结果：Herceptin可抑制CNE-2Z细胞的生长,引起细胞凋亡指数的增加。结论：Herceptin可抑制高表达HER-2／neu基因鼻咽癌细胞株的生长,并诱导细胞凋亡的发生。     

DNA-PKcs 表达与鼻咽癌细胞株放射敏感性的关系

 目的 探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1（鼻咽高分化鳞癌细胞株）和CNE-2（鼻咽低分化鳞癌细胞株）中DNA依赖蛋白激酶（DNA-PK）的催化亚基DNA-PKCS基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法 通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数，并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β,SF2、MID值，以及四氮唑蓝比色分析法（MTT法）检测60Co-γ线4Gy照射后12h细胞的存活率，以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术（RTrFQPCR）检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平DNA-PKCS基因的定量表达。结果CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高，MID值分别为2．78、1．61，SF2值分别为0．627、0．341；4Gy照射后12h的存活率分别为88．2％、72．3％；RT-FQPCR显示两株细胞中均有DNA-PKCS基因的表达，其相对表达量之比为7．54±2．71（t=4．17，P=0．014），表达差异有统计学意义，DNA-PKCS基因在CNE-2细胞中存在时间、剂量依赖关系。结论实验验证了CNB2比CNE-1对射线更敏感，DNA-PKCS基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。