用PCR扩增及Southern印迹杂交对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病病原体kDNA同源性研究

本研究自新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（ＣＬ）患者的皮肤病变组织内抽取微量的利什曼原虫ｋＤＮＡ，采用引物１３Ａ、１３Ｂ进行ＰＣＲ扩增，获１２０ｈＰ扩增产物（ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ），并转移到尼龙膜上，分别与地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ）标记的Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｇｅｒｂｉｌｌｉ、Ｌ．ｍａｊｏｒｋＤＮＡ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，结果可见病变组织内ｋＤＮＡＰＣＲ－ＡＰ仅与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ探针有明显的杂交信号带，提示该地区皮肤利什曼病病原体ｋＤＮＡ与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ有较强的同源性。为进一步分析该病原体与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株的同源关系，我们采用杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ）种特异引物Ⅰ和Ⅱ对患者病变组织进行ＰＣＲ扩增，未见扩增产物。用地高辛标记的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ探针对Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株进行打点杂交，结果显示该地区ＣＬ病原体与Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆分离株以及其它利什曼原虫呈阴性反应。以上结果证实Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ与克拉玛依地区ＣＬ患者的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ之间的同源关系。     

用PCR扩增及Southern印迹杂交对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病…

本研究自新疆克拉玛依地区肤利什曼病患者的皮肤病变组织内抽取微量的利什曼原虫ｋＤＮＡ，采用引物１３Ａ、１３Ｂ进行ＰＣＲ扩增，获１２０ｂｐ扩增皮物，并转移到尼龙膜上，分别与地高辛标记的Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｇｅｒｂｉｌｌｉ、Ｌ．ｍａｊｏｒｋＤＮＡ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，结果可见病变组织内ｋＤＮＡＰＣＲ－ＡＰ仅与Ｌ．ＴＲＯＰＩＣＡＫｄｎａ探针有明显的杂交信号带，提示该地     

恶性疟原虫SSUrDNA特定片段的体外扩增及鉴定

根据已知疟原虫、其它寄生人体原虫及人的小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）编码区序列，借助计算机核酸序列软件分析，设计出一对用于恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）ＳＳＵｒＤＮＡ特定片段扩增的引物。采用双温度点聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，从我国Ｐ．ｆ．ＦＣＣ／ＹＮ茅芽株红内期基因组ＤＮＡ中，扩增出约５７０个碱基对（ｂｐ）的ＤＮＡ片段，与预期长度相符；而间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）、利什曼原虫（Ｌ．ｄ．）、弓形虫（Ｔ．ｇ．）及人白细胞ＤＮＡ样本均无此扩增带出现。扩增片段经限制性内切酶消化和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交分析，证实为Ｐ．ｆ．ＳＳＵｒＤＮＡ目的片段。     

用RAPD技术分析利什曼原虫DNA多态性

为了建立ＲＡＰＤ技术分析利什曼原虫ＤＮＡ多态性的方法，并进一步揭示Ｌｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌｔｒｏｐｉｃａ之间的亲缘关系，本文应用筛选的两种随机引物（Ｍ１３，３３０１）分别扩增了Ｌｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌｔｒｏｐｉｃａ的ｎＤＮＡ和ｋＤＮＡ。结果显示，两种利什曼原虫ｎＤＮＡ及ｋＤＮＡ均扩增出各自特有的带型，两虫种间ｎＤＮＡ、ｋＤＮＡ的扩增片段共享度Ｆ值分别为０７２７２和０８５７１。表明ＲＡＰＤＰＣＲ可作为利什曼原虫虫种分析鉴别的工具     

内脏利什曼病患者骨髓及血内病原体特异性kDNA片…

目的：建立简易、准确的诊断内脏利什曼病和病原体鉴定技术。方法：采用作者设计的杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ．）种特异引物Ｉ和Ⅱ，经ＰＣＲ扩增样品内病原体ｋＤＮＡ２９７ｂｐ片段，检测２２例确诊内脏利什曼病（ＶＬ）患者骨髓、血、血清共５５份样品和４例临床疑诊为黑热病患者的骨髓（共２６例，５９份样品）。结果：（１）ＰＣＲ法与骨髓涂片镜检符合率为９６．２％（２５／２６）；（２）ＰＣＲ法检测骨髓、血及血清的总阳性率     

我国新疆皮肤利什曼病病原体SSU rDNA多变区序列分析

我国新疆皮肤利什曼病病原体（ＣＬＰ）各株鉴定尚有分歧。本研究用一对利什曼原虫属特异引物Ｒ２２２和Ｒ３３３，直接从皮肤利什曼病病人皮肤病变组织，热带利什曼原虫和婴儿利什曼原虫基因组ＤＮＡ中扩增出一ＳＳＵ ｒＤＮＡ特异片段，克隆到ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ上，并以双脱氧链末端终止法测序。序列分析显示扩增的ＣＬＰ、Ｌ．ｉｎｆｏｎｔｕｍ和Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ ＳＳＵ ｒＤＮＡ序列皆为３９１ｂｐ长。     

我国山丘,平原疫区利什曼原虫分离株kDNA分析

为鉴别我国山丘、平原疫区杜氏利什曼原虫分离株，采用内切酶ＡｌｕＩ对其ＫＤＮＡ进行酶切。结果显示实验各株均有５００ｂｐ片段；Ｌ．ｄ．汶川人株、Ｌ．ｄ．四川人株、Ｌｄ．甘肃人株（ＧＳ２）、Ｌ．ｄ．四川株株、Ｌｉｎｆａｎｔｕｍ及Ｌ．ｄ．Ｊｅｄｄａｈ具有２１０ｂｐ片段；Ｌｄ．四川人株、Ｌｄ甘肃人株（ＧＳ２）及Ｌｄ四川犬株具有１２０ｂｐ片段；Ｌｄ汶川人株、Ｌ．ｄ．甘肃人株（ＧＳ２）和Ｌｄ．四川犬株具有４００     

地高辛标记杜氏利什曼原虫kDNA重组片段特异性分析及序列测定

用地高辛（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ）标记杜氏利什曼原虫ｋＤＮＡ重组片段作为探针，与不同种株利什曼原虫ｋＤＮＡ斑点杂交，获得杜氏利什曼原虫一种特异性ｋＤＮＡ片段，双脱氧核苷酸链终止法测定该片段长３２１ｂｐ，计算机检索及同源性分析比较再次表明该片段具有较高的种特异性。该片段可作为探针用于利什曼病病原体的检测，有助于虫株鉴定，也可以作为聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增的靶序列。     

用RAPD技术分析利什曼原虫DNA多态性

为了建立ＲＡＰＤ技术分析利什曼原虫ＤＮＡ多态性的方法，并进一步提示Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ之间的亲缘关系，本文应用筛选的两种随机引物（Ｍ１３，３３０１）分别扩增了Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ的ｎＤＮＡ和ｋＤＮＡ。结果显示，两种利会曼原虫ｎＤＮＡ及ｋＤＮＡ均扩增出各自特有的带型，两虫种间ｎＤＮＡ、ｋＤＮＡ的扩增片段共享度Ｆ值分别为０．７２７２和０．８５７１。表明ＲＡＰＤ－     

新疆地区皮肤利什曼病病原体SSU rDNA PCR扩增及限制性酶切分析

我们采用引物Ｒ２００和Ｒ３００，对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病患者的皮肤病变组织内抽提的微量利什曼原虫ＳＳＵｒＤＮＡ以及有关利什曼原虫种株的ＳＳＵ ｒＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，然后分别采用限制性内切酶ＲｓａＩ和ＰＣＲ扩增产物进行限制性酶切分析。     

我国山丘、平原疫区利什曼原虫分离株kDNA分析

为鉴别我国山丘、平原疫区杜氏利什曼原虫分离株，采用内切酶AluⅠ对其kDNA进行酶切。结果显示实验各株均有500bp片段；L．d．汶川人株、L．d．四川人株、L．d．甘肃人株（GS2）、L．d．四川犬株、L．infantum及L．d．Jeddah具有210bp片段；L．d．四川人株、Ld．甘肃人株（GS2）及L．d．四川犬株具有120bp片段；L．d．汶川人株、L．d．甘肃人株（GS2）和L．d．四川犬株具有400bp和280bp片段。L．d．甘肃犬株也具有400bp片段；L．infantum和L．d．Jeddah具有280bp片段。提示山丘疫区不同分离株的kDNAAluⅠ酶切片段相近，其中人株与犬株的相似；山丘疫区分离株与平原疫区分离株的酶切片段之间有较大差异，山丘疫区分离株与L．infantum的酶切片段之间既有相似又有差异。     

杜氏利什曼原虫动基体DNA种林特异片段的克隆

作者在质粒pUC18中克隆了限制性内切酶AIuI消化的Leishmania donovani四川人分离株kDNA片段,筛选后获得能区别杜氏利什曼原虫山丘疫区分离株和平原疫区分离株的的克隆pLK1-10和对杜氏利什曼原虫四川人分离株特异的克隆pLK1-14,对杜氏利什曼原虫种特异的克隆PLK1-1、pLK1-2等。这些克隆将是鉴定杜氏利什曼原虫,区别鉴定山丘及平原疫区黑热病病原体较好的探针。     

我国山丘疫区和平原疫区利什曼原虫分离株基因组DNA基因型分析

目的：分析我国山丘和平原疫区利什曼原虫分离株基因组DNA（nDNA）的多态性。方法：对基因组DNA进行内切酶酶切、Southern杂交、染色体定位。探针采用地高辛标记。结果：采用gp63探针，显示杜氏利什曼原虫（Leishmaniadonovani，L．d．）江苏人株和L．d．Jeddah nDNA之间有相似的染色体杂交带，L．d．四川人株和L．infantum nDNA之间有相似的染色体杂交带；采用β－tubulin探针，显示L．d．江苏人株与L．d．Jeddah nDNA之间有两条相似的染色体杂交带，L．d．四川犬株与L．d．甘肃犬株nDNA之间有三条相似的染色体杂交带、与L．d．汶川人株nDNA之间有两条相似的染色体杂交带。结论：提示平原疫区的江苏人株与L. d. J eddah 之间存在同源性, 山丘疫区的L. d. 四川人株与L. infantum 之间存在同源性, L. d. 四川犬株与L. d. 甘肃犬株之间存在同源性、与L. d. 汶川人株之间既存在同源性又存在差异, 山丘疫区与平原疫区分离株之间存在异源性。     

我国内脏利什曼病山丘疫区与平原疫区利什曼原虫SSUrDNA多变区序列分析

[目的 ]分析我国内脏利什曼病 (VL)山丘疫区与平原疫区利什曼原虫 (L .d )分离株小亚基核糖体DNA (SSUrDNA)多变区的序列差异。 [方法 ]nDNA进行PCR扩增 ,将扩增出的SSUrDNA基因的特异片段克隆于 pGEMR TEasyVector上 ,采用通用引物M 13进行PCR扩增 ,全自动测序仪测序。 [结果 ]序列分析显示 ,扩增的 5株利什曼原虫SSUrDNA序列大小均为 392bp ;序列差异均发生在两个独特序列区 (UQ Ⅰ和UQ Ⅱ ) ;山丘疫区L .d甘肃分离株和四川分离株均在UQ Ⅱ区上有 2个相同的碱基突变 ,L .d甘肃分离株UQ Ⅰ区上有 1个碱基突变 ;无移码突变。 [结论 ]山丘疫区分离株与平原疫区分离株之间的碱基序列有差异 ,平原疫区L .d山东分离株与婴儿利什曼原虫 (L .infantum)的碱基序列相同     

杜氏利什曼原虫平原和荒漠疫区分离株LACK基因克隆及序列分析

目的　测定我国平原疫区和荒漠疫区杜氏利什曼原虫分离株活性蛋白激酶 C受体同源物 (L ACK)基因序列 ,并与山丘疫区分离株及国外利什曼原虫分离株进行比较。　方法　应用 RT- PCR扩增 L ACK基因 ,将其克隆入p UC18载体后用双脱氧链末端终止法测序 ,并与 Gen Bank中相关数据进行比较。　结果　用 RT- PCR成功扩增出约95 0 bp的 L ACK基因片段 ,测序结果表明其片段大小均为 94 2 bp,与 Gen Bank中多种利什曼原虫 L ACK基因的核苷酸序列一致性达 97%以上。我国山丘、平原和荒漠 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因序列的一致性达95 %以上。　结论　获得了我国平原和荒漠疫区杜氏利什曼原虫 L ACK基因序列。我国 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因具有高度同源性。     

利什曼原虫中国分离株SSU rDNA多变区序列分析

目的分析我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株的SSUrDNA多变区序列差异。方法nDNA进行PCR扩增，将扩增出的SSUrDNA基因的特异片段克隆于pGEMR-TEasyVector上，采用通用引物M13进行PCR扩增，全自动测序仪测序。结果序列分析显示本文报道的荒漠、山丘疫区的2株利什曼原虫（L.d.XJ771、L.d.SC6）的SSUrDNA序列大小均为392bp；序列差异发生在两个独特序列区（UQ-Ⅰ和UQ-Ⅱ），无移码突变；与GeneBank中的利什曼原虫比较分析，同源性在98%以上。结论我国荒漠、山丘疫区利什曼原虫分离株之间的SSUrDNA多变区的碱基序列有差异；荒漠疫区分离株L.d.XJ771与国际标准株L.d.DD8的SSUrDNA多变区的碱基序列完全相同。     

我国山丘疫区与平原疫区利什曼虫分离株分子核型分析

目的：分析我国山丘疫区和平原疫区利什曼原虫分离株分子核型。方法：脉冲场电泳。采用１％琼脂糖凝胶，电压６Ｖ／ｃｍ，０．５×ＴＢＥ，１４℃，脉冲时间６０ｓ，电泳１５ｈ和脉冲时间９０ｓ，电泳９ｈ。结果：各个分离株均分离出分子量范围在２００ｋｂ－２２００ｋｂ的ＥＢ染色条带为１５条左右，其中６个山丘疫区分离株之间的核型相似，且犬 株与人株的亦相似，并与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ的核型接近；２个平原疫区分离株之间的核型相似；山丘疫区与平原疫区分离株之间的核型不同。结论：山丘疫区分离株之间和平原疫区分离株之间均各自存在着同源性，山丘疫区分离株与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ之间存有部分同源性，但两个疫区分离株之间存在着异源性；保虫宿主——家犬，是我国山丘疫区内脏利什曼病的重要传染源。     

山丘疫区杜氏利什曼原虫核糖体基因内转录间隔区的克隆及序列分析

目的　构建我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株前鞭体核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)片段克隆,并进行测序及同源性分析。　方法　提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA进行PCR扩增,将扩增出rDNAITS片段克隆入pMD18 Tvector上,双脱氧链末端终止法测序。　结果　扩增出约 1000bp的rDNAITS片段。测序结果表明山丘疫区的2株利什曼原虫L.d.SC10和L.d.6分别为1027bp和1028bp。序列分析结果表明,L.d.SC10和L.d .6有一定差异。　结论　获得了我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株L.d.SC10和L.d.6的前鞭体rDNAITS序列。     

我国利什曼原虫RAPD分析

目的　我国不同疫区利什曼原虫分离株的RAPD分析。　方法　用 7种随机引物 ,扩增来自我国 3个疫区 (得自利什曼病患者、病犬及白蛉 )的利什曼原虫分离株和国际标准株 ,并将扩增产物进行聚类分析。　结果　①来自我国山丘疫区及平原疫区的L d .分离株分别聚为两类 ,两者遗传距离较远 ;②来自新疆荒漠疫区、近荒漠疫区及平原地区的L d .XJ771、L d .XJ90 1和L d .XJ80 1聚在一类 ,表明它们的遗传距离较近 ;③山丘疫区虫株中来自病人和病犬的分离株区别不明显 ,两者同源性高 ,表明犬在传播中起着重要作用 ;④印度平原型标准株L d .DD8与我国平原疫区虫株聚在一类 ;⑤L infantum与我国山丘疫区的L d .分离株分属于两类 ;⑥L dJed与平原疫区L d .分离株亲缘关系较近 ;⑦L infantum与L tropica最早聚合 ,遗传距离最近。　结论　我国不同疫区利什曼原虫分离株在基因水平上存有差异。     

杜氏利什曼原虫特异性kDNA片段扩增及用于内脏利什曼病诊断的研究

本文报道了用杜氏利什曼原虫特异的一对寡核苷酸引物Ⅰ和Ⅱ进行PCR,扩增微环kDNA分子上一种特异性kDNA片段,进行杜氏利什曼原虫虫种鉴定和病原体检测。敏感性分析表明用此法能够检测到的最低模板DNA需要量为1fg,检测健康犬全血稀释的利什曼原虫前鞭毛体,最低可达2个/ml。扩增六种不同的利什曼原虫kDNA样品,在L.donovani四川人株、四川犬株和L.infantum出现阳性产物,其长度和设计扩增长度一致,扩增产物和地高辛标记的重组质粒探针pLK2斑点杂交结果表明为利什曼原虫kDNA序列。应用此对引物,检测8份内脏利什曼病患者骨髓样品和4份血清样品,经琼脂糖凝胶电泳,Southern杂交证实,分别有7例和2例阳性,显示出可喜的应用前景。