MicroRNA-125a质粒表达载体的构建及其表达活性

背景:pSuper是一种非编码RNA的真核表达载体,可在细胞质内表达miRNA前体,经过细胞自身的Dicer酶切后形成miRNA成熟体,其过程能够完全模仿细胞内源性miRNA形成过程。因此,利用pSuper表达载体构建一种肝癌抑制性miRNA:miR-125a的表达载体,为下一步研究其抗癌机制奠定了基础。目的:构建miR-125a的真核表达质粒pSuper-miR-125a,并验证其表达miR-125a的效率和特异性。方法:PCR扩增miR-125a前体(Pre-miR-125a)的目的片段,将其T-A克隆入pMD18-T过渡质粒载体,限制性内切酶切下目的片段,连接入pSuper质粒表达载体得到pSuper-miR-125a重组质粒;将重组质粒转染Hela细胞,miRNA定量PCR检测重组质粒表达miR-125a的效率和特异性。结果与结论:成功将miR-125a前体(Pre-miR-125a)片段克隆入真核表达质粒pSuper H1启动子下游,获得pSuper-miR-125a重组表达质粒,转染该质粒进入Hela细胞后能够在细胞内高效和特异的表达miR-125a,进一步证明pSuper真核表达质粒适合miRNA的表达研究。     

3种丙型肝炎病毒结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建鉴定及表达

目的：构建能表达HCV不同结构基因（C、C E1、C E1 E2）的腺病毒表达载体的穿梭质粒，为进一步包装能高效表达HCV不同结构蛋白的腺病毒载体做准备。方法：用分别含有Bg1 Ⅱ及HindⅢ酶切位点的HCV不同片段结构基因上、下游引物，以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/HCV-3011为模板，通过PCR扩增获得HCV3种不同结构基因片段，基因片段回收后，分别以BglⅡ及Hing Ⅲ双酶切，定向插入到腺病毒穿梭质粒Pad.CMV-Link.1中CMV启动子下游Bgl Ⅱ与HindⅢ位点之间。获得3种重组腺病毒穿腺病毒穿梭质粒pad.HCV-C、Pad.HCV-CE1和Pad.HCV-S(C E1 E2)。通过Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ双酶切，聚合酶链反应（PCR）及插入片段序列测定对质粒进行了三重鉴定，以抗HCV C单克隆抗体为一抗，利用间接免疫荧光法及Western Blot检测了3种穿梭质粒在HepG2细胞中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，3种穿梭质粒的插入片段分别为HCV C、C E1和C E1 E2区基因片段，免疫荧光及Western Blot法检测表明其可以在HepG2细胞中瞬时表达。结论：构建的3种腺病毒穿梭质粒分别可以表达HCV不同段的结构基因，为包装表达HCV不同结构基因的腺病毒载体奠定了基础。     

血管内皮生长因子质粒载体的构建

[目的]构建携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒.[方法]采用PCR 技术,以pIRES2-VEGF质粒为模板扩增VEGF基因全长,采用PCR产物的粘端克隆法,将VEGF定向克隆入EGFP的多克隆位点,构建pIRES2-EGFP-VEGF重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定.[结果]PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF正确连接至EGFP的多克隆位点.[结论]成功构建了携带人VEGF及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,为进一步研究VEGF基因治疗缺血性心血管疾病奠定了实验基础.     

人泛素-核糖体蛋白27a原核表达载体构建及表达

目的构建并表达携带谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的人泛素-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)原核表达载体。方法利用反转录聚合酶链反应从HL-60细胞中扩增RPS27A基因全长,克隆至pMD-19T载体中,酶切回收后插入原核表达载体pGEX4T-1,构建重组表达载体pGEX4T1-RPS27A,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达GST-UBRPS27a融合蛋白。结果经测序与酶切鉴定,重组质粒pGEX4T1-RPS27A构建正确;经重组质粒转化的BL21细菌诱导4h后可高效表达UBRPS27a融合蛋白。结论成功构建UBRPS27a原核表达载体,为进一步研究其结构、功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

PEGFP-C1/U6质粒载体介导的表达MDR1 shRNA的质粒构建

为了构建pEGFP-C1／U6载体介导MDR1短发卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）表达的质粒，针对MDR1的19碱基大小的片段．分别设计2对寡核苷酸，形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pEGFP-C1载体（命名为pEGFP-C1／U6），两对DNA双链连接后形成中间由9个碱基序列间隔的反向互补序列，构建成能产生MDR1短发卡RNA的质粒。结果表明：经酶切、连接后构建成的质粒（pEGFP-C1／U6／A和pEGFP-C1／U6／B），经酶切与测序证实构建成功，无任何碱基突变。结论：成功构建了能表达MDR1 shRNA的质粒栽体pEGFP-C1／U6／A和pEGFP-C1／U6／B，此项研究结果可能为临床上逆转肿瘤多药耐药提供一种有效的方法。     

小鼠Oct4基因克隆及其真核表达载体的构建

背景：Oct4是第一个被发现只在多能细胞中表达的转录因子，其功能被认为是控制细胞多能性的决定性因素。Oct4的这种作用机制目前并未明确。目的：克隆小鼠Oct4基因，构建其真核表达载体pEGFP—N2-Oct4。设计、时间及地点：单一样本研究，于2007—06／09在江西省分子医学重点实验室完成。材料：TRIzol Reagent由Molecular Rearch CenterInc提供；真核表达质粒载体pEGFP—N2由南昌大学第二附属医院分子医学重点实验室提供。方法：用TRlzol Reagent提取小鼠胚胎干细胞总RNA，并经反转录．聚合酶链反应获得小鼠Oct4DNA，将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP—N2上，以构建重组质粒pEGFP—N2-Oct4。主要观察指标：总RNA鉴定结果，RT．PCR扩增产物小鼠Oct4分子质量的鉴定结果，重组表达载体的酶切鉴定结果，克隆质粒的测序结果。结果：获取小鼠胚胎干细胞Oct4基因的全序列cDNA。构建Oct4cDNA真核表达质粒时。将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因，并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论：构建重组质粒pEGFP—N2-Oct4成功，将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因的3’端，即保留了Oct4的生物学活性，又便于在研究Oct4生物学功能实验中可检测到蛋白表达。     

重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的构建与表达

目的:构建针对人鼻咽癌CNE-2Z细胞Bcl-2基因pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16.1/15a真核表达质粒,转染至CNE-2Z细胞并检测其表达.方法:采用PCR法从重组质粒PGH-16-1/15a中获得16-1/15a-X2370G全长序列,在T4 DNA Ligase连接酶作用下连接入重组载体pENTR-CMV-EGFP.重组质粒经酶切及测序鉴定.将构建成功的重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2Z,用荧光显微镜观察转染结果.结果:重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a经酶切与测序证实构建成功,转染至鼻咽癌CNE-2Z细胞后,荧光显微镜观察证实该重组质粒能在CNE-2Z中表达.结论:成功构建真核表达质粒DENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a,并在鼻咽癌CNE-2Z细胞中得到表达,可用于进一步检测其抗肿瘤机制.     

Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,mfn2)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pEGFPmfn2质粒载体。方法采用高效Trizol试剂快速提取大鼠血管平滑肌细胞株A7r5总RNA,经RT-PCR获得mfn2cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段并将质粒pEGFP-N1和mfn2基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收2.2 kb片段,再将回收的pEGFP-N1大片段与mfn2基因片段(2.2 kb)重组。对重组pEGFPmfn2质粒进行PCR和双酶切鉴定并测序。结果成功地从A7r5中克隆了mfn2基因,并构建了以pEGFP-N1为载体的真核表达质粒。结论含mfn2基因新型表达质粒构建的成功将为研究mfn2功能、进一步研究该基因异常表达与心血管疾病发生的关系奠定基础。     

心脏转录因子Nkx2.5真核表达质粒的构建

目的构建人类心脏特殊转录因子Nkx2.5的真核表达质粒,为进一步探讨Nkx2.5在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法以质粒pCMV6-XL5-Nkx2.5为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2.5编码区序列,将真核表达载体pCMV-HA和Nkx2.5的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-HA-Nkx2.5,转化至大肠杆菌,提取质粒后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果成功设计引物扩增出Nkx2.5基因编码区约1 000 bp的目的片段,PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2.5基因序列。结论成功构建了含有Nkx2.5的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。     

Toll样受体4小干扰RNA表达载体的构建及鉴定筛选

目的构建并筛选到能有效抑制TLR4基因表达的小干扰RNA表达载体,用于研究TLR4基因功能。方法 RNA干扰采用体外构建小干扰RNA表达载体法,将构建好的表达载体转染单核细胞株,分别用流式细胞术和实时荧光定量RT-PCR法检测TLR4蛋白和mRNA表达变化,筛选抑制效率最高的小干扰RNA表达载体。结果成功构建了TLR4小干扰RNA表达载体,并经电泳及测序证实;编号为S8-1的载体转染入细胞后,TLR4阳性率为27.03%,显著低于对照组的35.12%;流式细胞术和实时荧光定量RT-PCR法检测均证实编号为S8-1小干扰RNA表达载体的抑制效率最高,可用于后续实验。结论本实验所构建的编号为S8-1小干扰RNA表达载体可有效抑制TLR4基因表达,小干扰RNA表达载体法能够抑制体外培养细胞株TLR4的表达,可用于研究TLR4基因功能。     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景:胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用.目的:构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒.方法:将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒.采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞.结果与结论:重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342 bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内.免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1.     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景：胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）在人体内半衰期过短限制了其应用。目的：构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。方法：将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒。采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞。结果与结论：重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内。免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1。     

结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达

背景:Hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性。目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因Hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。设计:单一样本实验。单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室。材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠。方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成。以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGHsp65(不含终止子)重组质粒。再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGHsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6。通过限制性内切酶图谱测定pEGHsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。主要观察指标:①pEGHsp65-Esat6融合质粒大小。②pEGFP-C1DNA序列分析。③转染后Hela细胞的荧光表达情况。④细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果。结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7kb,而pEGHsp65为6.4kb,融合质粒pEGHsp65-Esat6约为6.7kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异。②结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp65和Esat6的基因序列完全相同。③转染融合质粒24h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分细胞表达荧光蛋白,说明融合质粒转染成功,转染率约为30%。未转染的Hela细胞则无荧光表达。④通过免疫组织化学法证实融合质粒在Hela细胞内能正确表达出具有生物学活性的Hsp65与ESAT-6蛋白。结论:采用Hsp65和Esat6搭配作为免疫原,成功克隆并构建了结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光真核表达质粒。     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

Formulations containing poly(lactide-co-glycolide) and plasmid DNA expression vectors

DNA expression vectors have the potential to be useful therapeutics for a wide variety of applications. However, development has been hindered by the lack of systems that provide protection from nuclease-based attack, enable cell or tissue localisation, promote adequate gene expression or provide for controlled release. At least one synthetic polymer, poly(lactide-co-glycolide) (PLG), may provide benefit in this regard. This polymer has a history of safe use in humans, has been demonstrated effective as a delivery system, its use is not hindered by composition patents, and Good Manufacturing Practices grade material is readily available from commercial sources. Safety and applicability to clinical medicine have been proven by use of the polymer as a microparticle delivery vehicle for peptides (luteinizing hormone releasing hormone agonist peptides; Lupron Depot [TAP Pharmaceuticals]; Zoladex [AstraZeneca]) and proteins (human growth hormone recombinant protein, Nutropin Depot [Genentech]). This report focuses on the expanding field of PLG-based DNA delivery and provides a review on research and clinical experience with PLG-plasmid formulations.     

HBV核心蛋白与A3C融合蛋白HBV载体质粒的构建

目的:构建HBV核心蛋白与人类载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3C(A3C)融合蛋白HBV载体质粒.方法:构建表达HBV核心蛋白的乙肝病毒载体质粒PdssX;以质粒PC-A3C为模板扩增A3C,将扩增的A3C及PdssX分别用Aor13H Ⅰ和BSEⅡ酶切双酶切,以T4连接酶连接转化TOP10感受态细胞,然后PCR和双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶切所获载体片段和目的基因片段的大小均与预期的相一致,经测序证实为pCH-CoreA3c基因,表明CoreA3c基因HBV载体质粒pCH-CoreA3c构建成功.结论:成功构建HBV核心蛋白与A3C融合蛋白HBV载体质粒pCH-CoreA3c,为下一步CoreA3c融合蛋白的原核表达及其抗病毒作用研究奠定了基础.     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的 原核表达获得大量人regucalcin（RGN）蛋白。方法 用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术从人。肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）中扩增RGN全长cDNA，将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T，测序鉴定准确后，进行酶切，将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b（＋）构建成重组质粒pET42b（＋）-RGN。将pET42b（＋）-RGN先转化入大肠杆菌DH5α，提取质粒经双酶切鉴定正确后，再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与免疫印迹分析，鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化，达电泳纯。结果 构建了重组质粒pET42b（＋）-RGN并获得高效表达，RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后以包涵体形式存在，表达的蛋白质相对分子质量为34000。结论 人RGN蛋白在pET42b（＋）原核表达载体可获得高效表达，为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。