地塞米松干预大鼠星形胶质细胞周期素的表达及细胞周期进程

背景:有研究表明地塞米松可引起星形胶质细胞凋亡,但其机制不清,有关地塞米松干扰星形胶质细胞的周期素表达的作用未见报道。目的:观察地塞米松引起大鼠星形胶质细胞凋亡与周期素表达的关系。方法:将不同浓度的地塞米松(0,10-5,10-4,10-3mol/L)与纯化培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞共同孵育24h后,经流式细胞仪检测细胞周期,并用免疫细胞化学方法检测周期素A和E在星形胶质细胞内的表达。结果与结论:地塞米松10-5,10-4mol/L浓度组G1期细胞指数较对照组增加(P<0.05,P<0.01),10-3mol/L组的S期细胞指数较对照组明显升高(P<0.01);周期素A的表达随着地塞米松浓度的升高而减弱(P<0.05)。周期素E的表达在地塞米松0,10-5,10-4mol/L组随着地塞米松浓度的升高而减弱(P<0.05),但在10-3mol/L浓度组反而表达增强(P<0.01)。说明地塞米松10-5,10-4mol/L干预的星形胶质细胞周期进程受阻于G1期且与周期素A和E表达降低有关,地塞米松10-3mol/L干预的星形胶质细胞周期进程受阻于S期主要与周期素A表达降低有关。     

缺血对体外培养星形胶质细胞凋亡及细胞周期的影响

目的:研究缺血干预不同时间对体外培养的星形胶质细胞(Ast)凋亡及细胞周期的影响。方法:分离新生大鼠皮质,获得细胞悬液,通过培养、分离和传代方法纯化Ast,经体外缺血条件(氧及血清剥夺,低糖)干预3、6、12和24h后收集细胞,PI染色。流式细胞仪检测每个样品单个细胞DNA含量,测算每个样品中处于凋亡及各周期细胞的百分比。结果:对照组与各缺血干预组进行组间比较,凋亡百分比无显著性差异。观察期内Ast始终未出现凋亡。缺血3、6、12hAstS期及G2/M期百分比较对照组显著增高,缺血6h达最高值。结论:Ast对缺血有一定的耐受性,缺血早期Ast反应性增生。     

应用组织芯片技术研究COX-2、c-erbB-2和Ki-67在星形胶质细胞增生和星形胶质细胞瘤中的表达及意义

目的研究COX-2、c-erbB-2、Ki-67在星形胶质细胞增生及星形胶质细胞瘤中的表达,并探讨三者在鉴别反应性与肿瘤性星形胶质细胞方面的作用.方法利用组织芯片技术及PV6000通用型二步法免疫组化方法检测COX-2、c-erbB-2、Ki-67在正常脑组织、星形胶质细胞增生、低/高级别星形胶质细胞瘤中的表达.结果正常组织中COX-2、c-erbB-2、Ki-67表达均为（-）;增生组中阳性表达率分别为28.9%、37.8%和22.2%,与正常组比较,COX-2、Ki-67表达差异不显著,c-erbB-2差异显著（P＜0.05）;低级别肿瘤组中三者阳性表达率分别为68.1%、63.8%和70.2%,与增生组比较,均差异显著（P＜0.05）;高级别肿瘤组中三者阳性表达率分别为88.1%、83.3%和95.2%,与低级别肿瘤组比较,均差异显著（P＜0.05）.COX-2、c-erbB-2与组织学分级密切相关（r值分别为0.989和0.988）.结论COX-2、c-erbB-2、Ki-67有可能成为鉴别星形胶质细胞增生与低级别星形胶质细胞瘤的客观指标,且COX-2、c-erbB-2在星形胶质细胞瘤的发生、发展过程中有重要作用.     

转染真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27对星形胶质细胞增殖的抑制作用

目的:探讨脂质体介导真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27转染体外培养星形胶质细胞后对其增殖的影响。方法:利用脂质体将质粒pGFAP-IRES2-EGFP-p27转染入纯化培养的星形胶质细胞,通过免疫荧光化学标记观察转染质粒pGFAP-IRES2-EGFP-p27后星形胶质细胞内外源基因EGFP、p27的表达情况,并观察其对星形胶质细胞Ki67表达的影响。结果:脂质体介导质粒pGFAP-IRES2-EGFP-p27转染后24 h即开始有EGFP的表达,48-72 h EGFP表达达高峰;通过免疫荧光标记发现,表达EGFP的细胞同时有p27表达水平明显增高;和EGFP阴性细胞相比,EGFP阳性细胞中Ki67的阳性率明显下调(P<0.01)。结论:GFAP启动子能启动目的基因p27和EGFP在星形胶质细胞的表达;连于p27的下游EGFP可作为报告基因,通过观察EGFP的表达可了解外源性p27的表达情况;导入外源性p27能有效抑制星形胶质细胞的增殖。     

olomoucine对星形胶质细胞增殖的影响及机制研究

目的:观察细胞周期抑制剂olomoucine对培养星形胶质细胞(AS)机械损伤后增殖的影响,并探讨其作用机制。方法:建立体外培养大鼠纯化的AS物理损伤模型(划痕损伤模型),随机分为对照组、划痕组和干预组,划痕组和干预组均继续培养,干预组给予olomoucine干预。利用免疫荧光细胞化学方法观察损伤后BrdU表达;利用Westernblot印迹分析损伤后PCNA、p27的表达。结果:划痕损伤刺激12h开始出现损伤边缘区AS胞体肥大、数目增加,BrdU阳性细胞比率和PCNA表达水平较对照组增高(P<0.05),p27表达水平较对照组下降(P<0.05);干预组的BrdU阳性细胞比率和PCNA表达水平较划痕组明显减少(P<0.05),p27表达上调(P<0.05)。结论:损伤刺激可促使AS发生反应性胶质增生,CDK选择性细胞周期抑制剂olomoucine可以通过调控细胞周期抑制其反应性增生。     

新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞培养

目的学习星形胶质细胞的培养方法,获得较纯的星形胶质细胞,为进一步研究打下基础。方法取出生3d内的新生SD大鼠,无菌取脊髓,剥除脑脊髓膜,剪成乳糜状后胰酶消化结合机械吹打使组织分散,筛网过滤制成单细胞悬液,差速粘附处理去除成纤维细胞得到次细胞悬液,接种用含20％FBS的高糖DMEM培养基培养,每3d换液一次。培养9～12d,待细胞汇合度达到80％时传代。取第四代细胞行GFAP免疫组化鉴定。结果成功分离培养并纯化了脊髓星形胶质细胞,经GFAP免疫组化鉴定,星型胶质细胞纯度达98．5％以上。结论细胞分离培养结合差速粘附可获得较纯的星形胶质细胞。     

X射线对体外培养星形胶质细胞增殖的影响及机制研究

目的：观察X射线照射对培养星形胶质细胞（AS）增殖的影响,为X射线的广泛应用提供理论依据。方法：将体外培养80%汇合的AS,在AS无血清培养基继续培养48h后分为对照组和放疗组,对照组更换含10%FBS的DMEM-F12培养基,放疗组更换含10%FBS的DMEM-F12培养基,并同时给与X射线照射,利用western印迹分析各组PCNA、p53、cyclinE的表达。结果：X射线照射后能降低S期细胞比率,呈剂量依赖性,但并不增加AS的凋亡率。通过对AS无血清培养48h后,大部分细胞周期同步于G0期,对照组更换培养基后12h出现PCNA、cyclinE表达水平增高;放疗组p53表达水平较对照组显著增高,PCNA、cyclinE表达水平较对照组显著降低。结论：X射线照射可以通过调控细胞周期有效抑制AS的增生。     

大鼠海马脑片星形胶质细胞与NG2胶质细胞形态学及电生理特性比较

目的:比较研究大鼠海马脑片星形胶质细胞和NG2胶质细胞(以下简称NG2细胞)的形态学特点和电生理特性,为区别这两种胶质细胞提供依据,也为进一步研究两者的功能及相互关系等提供实验基础。方法:以P21～P25大鼠海马CA1区放射层胶质细胞为研究对象,通过脑片钳全细胞记录、记录后染色标记以及激光共聚焦成像等技术方法,比较星形胶质细胞与NG2细胞在形态学和电生理学特性上的异同。结果:形态学上,星形胶质细胞具有大量的突起,并且突起呈丛状分支,极细的突起非常发达,形成海绵样结构;NG2细胞也具有较多突起,但突起分支较少,突起呈长线状延伸出较长的距离,往往缺少星形胶质细胞典型的一个或多个粗大的一级突起。电生理特性上,两种细胞的静息膜电位(RMP)非常接近,而膜电容(Cm)和膜电阻(Rm)则差异非常大。对于星形胶质细胞,其I-V曲线呈线性,电流没有任何整流现象;而NG2细胞I-V曲线具有明显的外向整流特性,表达大量的快钾通道电流(Ka)、延迟整流钾电流(Kdr),以及比较小的内向整流钾电流(Kir);而且部分NG2细胞还表达低密度的电压依赖性钠电流。结论:大鼠海马脑片星形胶质细胞和NG2细胞在形态学和电生理上均存在一定的差异;在脑片钳实验中,根据这些差异,可以清楚地区分两者。     

体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型

目的复制体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型。方法利用传至第2代的体外培养的大鼠星形胶质细胞进行细胞划伤实验。分别于划伤前10min、划伤后1、3、6、12、24h观察细胞形态变化,并取培养上清液进行乳酸脱氢酶活性测定。结果细胞划伤后划痕两侧边缘整齐,随时间推移细胞突起逐渐向划痕区延伸,且划痕区出现星形胶质细胞。细胞划伤后乳酸脱氢酶漏出量短时间内迅速增加,之后各时间点持续增加(P<0.05),且均高于相应时间点的对照组(P<0.05)。结论细胞形态变化及培养上清液中乳酸脱氢酶漏出量证实体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型复制成功。     

次声作用后大鼠海马星形胶质细胞的变化

目的 研究8Hz,90dB和130dB次声作用后不同时间点，大鼠海马中胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）表达的变化。方法 Hz,90dB和130dB次声作用于大鼠，2h/d，分别作用于1，7，14，21，28d后采用免疫组织化学方法，观察大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的时程改变。结果 130dB组从作用1d开始大鼠海马中GFAP阳性星形胶质细胞数量开始增加，14d达到高潮，21d开始下降，但仍然维持较高水平90dB组大鼠各时间点GFAP反应均比130dB组弱。结论 8Hz,90dB和130dB次声作用可以激活海马大量星形胶质细胞，对神经元具有保护作用。     

高压氧对大鼠活化的星形胶质细胞增殖及神经生长因子基因表达的影响

目的研究通高压氧对大鼠活化的星形胶质细胞的增殖作用及对神经生长因子(NGF)mRNA表达的影响,为探究通高压氧治疗脊髓损伤提供细胞学研究基础。方法采用酶消化法分离培养大鼠星形胶质细胞,用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定星形胶质细胞;取第4代细胞激活,将其暴露在不同的氧环境中,分四组:对照组(CO2温箱)、空气加压组(0.2 MPa空气加压舱)、纯氧组(85%以上氧浓度的纯氧舱)、高压氧组(0.2 MPa,85%以上氧浓度的高压氧舱),连续3 d,每天干预1 h,用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖水平,采用荧光定量PCR法测各组细胞NGF mRNA的相对表达量。结果经胶质纤维酸性蛋白鉴定,星形胶质细胞纯度达95%。高压氧组细胞较对照组、空气加压组和纯氧组增殖速度快,而纯氧组细胞较对照组和空气加压组增殖速度慢;荧光定量PCR测得NGF mRNA的相对表达量在通高压氧组高于对照组、空气加压组和纯氧组(P<0.05),而对照组、空气加压组和纯氧组之间两两比较差异无统计学意义。结论上述结果提示0.2 Mpa、85%的通高压氧可以促进星形胶质细胞增殖,提高NGF mRNA的相对表达量,为高压氧治疗脊髓损伤提供了细胞学研究基础。     

细胞周期抑制剂对局灶性缺血缺氧性脑损伤后神经细胞凋亡的影响

目的探讨细胞周期抑制剂对脑神经细胞凋亡的影响。方法采用光化学方法制作局灶性缺血模型,干预组大鼠腹腔注射细胞周期抑制剂Olomoucine。用HE染色测定皮层梗死灶的体积;免疫组织化学法观察缺血后第3天假手术组、缺血对照组和干预组大鼠梗死灶周围凋亡细胞的表达;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(Westernblot)观察Caspase3蛋白的表达。结果对照组梗死灶明显大于干预组;干预组梗死灶周围凋亡细胞数较假手术组显著增高,但明显低于对照组(P<0.05);Westernblot显示Caspase3蛋白的表达,干预组较假手术组增高(P<0.05),而较对照组明显降低(P<0.05)。结论脑缺血损伤后细胞周期调控参与了神经细胞的凋亡过程。     

A microRNA-21 surge facilitates rapid cyclin D1 translation and cell cycle progression in mouse liver regeneration

MicroRNA-21 (miR-21) is thought to be an oncomir because it promotes cancer cell proliferation, migration, and survival. miR-21 is also expressed in normal cells, but its physiological role is poorly understood. Recently, it has been found that miR-21 expression is rapidly induced in rodent hepatocytes during liver regeneration after two-thirds partial hepatectomy (2/3 PH). Here, we investigated the function of miR-21 in regenerating mouse hepatocytes by inhibiting it with an antisense oligonucleotide. To maintain normal hepatocyte viability and function, we antagonized the miR-21 surge induced by 2/3 PH while preserving baseline expression. We found that knockdown of miR-21 impaired progression of hepatocytes into S phase of the cell cycle, mainly through a decrease in levels of cyclin D1 protein, but not Ccnd1 mRNA. Mechanistically, we discovered that increased miR-21 expression facilitated cyclin D1 translation in the early phase of liver regeneration by relieving Akt1/mTOR complex 1 signaling (and thus eIF-4F-mediated translation initiation) from suppression by Rhob. Our findings reveal that miR-21 enables rapid hepatocyte proliferation during liver regeneration by accelerating cyclin D1 translation.     

二羧酸转运蛋白对人成纤维细胞周期和周期蛋白的影响

背景:钠依赖二羧酸转运蛋白参与能量代谢,对细胞衰老可能有影响,但其促进细胞衰老的机制不清.目的:通过细胞周期和周期蛋白的测定探讨二羧酸转运蛋白(hNaDC3)促进细胞衰老的可能机制.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-12/2008-05在南京市鼓楼医院完成.材料:WI-38细胞为ATCC公司产品;pLNCX2反转录病毒载体、正义载体PLNCX2-hNaDC3和反义载体PLNCX2-AshNaDC3为Clontech公司产品.方法:在已构建的反转录病毒载体基础上,使用含有hNaDC3基因的反转录病毒液将hNaDC3基因导入人胚肺二倍体成纤维细胞(WI-38)中,并获得表达,通过细胞周期、P16的检测以观察其对细胞衰老的影响.主要观察指标:①WI-38细胞hNaDC3整合和表达.②hNaDC3转导致WI-38细胞形态和传代数的改变.③细胞周期变化.④细胞周期蛋白P16的表达.结果:Northern blot及Western blot结果显示WI-38/hNaDC3细胞在基因和蛋白水平均有hNaDC3的表达,WI-38/As hNaDC3细胞有hNaDC3 mRNA整合而无蛋白表达.与对照细胞相比,hNaDC3基因导入后,人二倍体成纤维细胞形态呈衰老细胞样变化,细胞传代数减少8～12代,生长速率降低,细胞周期阻滞于G1期,细胞周期蛋白P16的表达增高.结论:hNaDC3可能通过增高P16表达促进人二倍体成纤维细胞的衰老.     

三氧化二砷对骨髓瘤细胞周期及其调节蛋白表达的影响

目的 研究三氧化二砷(As2O3)对骨髓瘤细胞周期及其调节蛋白表达的影响，探讨As2O3的药理机制。方法 利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨As2O3对骨髓瘤细胞系HS—Sultan周期的影响；用RT—PCR方法进一步研究As2O3对细胞周期负性调控因子P5、P16和P21mRNA表达的影响。结果 As2O3使HS-Sultan细胞主要阻滞于C0／G1期，少部分阻滞于G2／M期，诱导S期细胞凋亡；未经As2O3处理的HS-Sultan细胞P15和P16mRNA均无表达，在1．0μmol/L As2O3作用24h后P15 mRNA出现弱的阳性条带，48h和72h后变为强阳性，P16mRNA则在48h后见弱的阳性条带，72h后呈强阳性，距P21mRNA在原有表达的基础上明显增强。结论 As2O3的药理作用之一是使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P15、P16和P21重新表达或表达增强，从而影响细胞增殖周期。     

重组人粒细胞集落刺激因子对实验性脑出血大鼠星形胶质细胞表达的影响

背景:星形胶质细胞是中枢神经系统的主要成分之一,具有对各种损伤产生强烈反应的特性,脑出血后星形胶质细胞大量表达、活性增强,这种由常态转变为反应性状态的星形胶质细胞的病理生理学意义是目前研究热点.目的:探讨重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血后星形胶质细胞表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/11在泸州医学院中心实验室完成.材料:清洁级健康榷性SD大鼠50只,随机分为3组:假手术组10只、模型组20只、实验组20只.重组人粒细胞集落刺激因子为深圳新鹏生物工程有限公司产品.方法:模型组、实验组利用鼠脑立体定向仪、采用断尾取自体血法制备脑出血动物模型,假手术组用等量生理盐水代替自体血,余干预措施与模型组一致.造模1 h后,实验组大鼠腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子60 μg/kg,余2组未注射任何物质.主要观察指标:分别于干预后6 h,24 h,48 h,72 h,7 d采用免疫组织化学ABC法检测胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达.结果:假手术组未见胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达.模型组干预6 h即有少量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达,48 h后开始增多,至72 h胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量达高峰(P＜0.05),7 d后仍有大量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达,但较72 h时有所减少.实验组干预6 h时胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达与模型组相似,干预24 h,48 h,72 h,7 d时胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较模型组明显减少(P＜0.05),细胞变形程度减轻.结论:重组人粒细胞集落刺激因子能够抑制脑出血后星形胶质细胞的过度活化,可能对损伤脑组织重建和功能恢复起重要作用.     

Instruction for cytokine expression in T helper lymphocytes in relation to proliferation and cell cycle progression

T helper (Th) lymphocytes, when reactivated, recall expression of those cytokines they had been instructed to express in earlier activations, even in the absence of specific cytokine-inducing factors. In cells that memorize their expression, the cytokine genes are modified by chromatin rearrangement and demethylation, suggesting that they have been somatically imprinted. Here we show, by using inhibitors blocking the cell cycle in various stages, that for the instruction of a Th cell to express interleukin (IL)-4 or IL-10 upon restimulation, entry of the cell into the S phase of the first cell cycle after initial activation is required. Separation of the IL-4 receptor (IL-4R) and T cell antigen receptor (TCR) signals in time, demonstrates that this instruction is dependent on concomitant signaling from both receptors. In Th cells, inhibited to progress into the first S phase after activation, the IL-4R and TCR signals can be memorized for at least 1 d, priming the T cell to become instructed for expression of IL-4 upon restimulation, when entering the S phase after release of the cell cycle block. The requirement of the initial S phase of T cell activation, for instruction of Th cells to express IL-4 or IL-10 upon restimulation points to the decisive role of epigenetic modification of cytokine genes as a molecular correlate of the memory to express particular cytokines.     

MCI-186对阿尔茨海默病大鼠海马神经元细胞增殖和细胞周期的影响

目的通过MCI-186对阿尔茨海默病大鼠海马神经元细胞增殖和细胞周期的影响进行探讨,来验证MCI-186通过抗细胞凋亡机制发挥其神经保护作用。方法将Wistar雄性大鼠分为5组：正常对照组、假手术组、痴呆组（穹隆海马伞损伤联合Aβ25-35侧脑室注射）、大剂量及小剂量MCI-186治疗组,于第28 d分离海马神经细胞,进行流式细胞仪检测[由计算机测出各组大鼠海马神经元细胞周期含量（G0/G1、S、G2/M）和凋亡率（AR）,并计算增殖指数（PI）=（S＋G2/M）/（G0/G1＋S＋G2/M）×100%]。结果 MCI-186治疗组大鼠海马神经细胞中,G1期细胞数目减少,S期细胞数目增多,PI增加、AR降低;其中小剂量MCI-186治疗组改变更明显。结论 MCI-186会促使静止态G1期细胞活跃并向S期转变,增加DNA合成量,促进细胞增殖,并能抑制细胞凋亡,从而达到保护神经细胞的目的 ,以小剂量MCI-186保护神经细胞作用更强。     

pEgr-hPTEN体外稳定转染对人脑胶质瘤SHG-44 细胞周期及增殖的影响

目的　探讨外源野生型PTEN基因对人脑胶质瘤SHG 4 4细胞周期及增殖的影响 ,阐明PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制。方法　脂质体包裹重组质粒pEgr hPTEN体外转染内源性PTEN基因突变的SHG 4 4胶质瘤细胞 ;G4 18筛选稳定表达细胞株并扩增培养 ;采用细胞计数法检测肿瘤细胞增殖速度 ;流式细胞术检测肿瘤细胞周期的变化。结果　经 10到 2 0dG4 18筛选得到稳定表达细胞株 ;重组质粒pEgr hPTEN稳定转染可明显抑制SHG 4 4细胞的体外增殖 ,细胞周期明显改变 ,细胞从G1期到S期发生阻滞。结论　提示转染外源野生型PTEN基因可使SHG 4 4细胞周期阻滞于G1期 ,并可抑制肿瘤细胞增殖。