Tip60基因沉默对细胞DNA双链断裂修复和辐射敏感性的影响

目的 探讨Tip60对细胞辐射敏感性的影响及相关机制。方法 采用siRNA和Tip60乙酰转移酶抑制剂漆树酸,抑制U2OS细胞中Tip60的表达或乙酰转移酶活性;用克隆形成率分析细胞对⁶⁰Co γ射线的敏感性;采用γ-H2AX原位免疫荧光集簇点法,检测DNA双链断裂损伤修复;用免疫共沉淀检测蛋白质的相互作用。结果 siRNA沉默Tip60表达明显提高了U2OS细胞对1、2 Gy中、低剂量γ射线的敏感性(t=3.364、3.979,P＜0.05),但对4 Gy大剂量照射的细胞存活率无明显影响。γ-H2AX集簇点检测结果表明,照射后1、4和8 h,Tip60失活导致细胞DNA双链断裂修复能力降低(t=3.875、3.183和3.175, P<0.05)。细胞在受到电离辐射损伤后,Tip60与DNA修复蛋白DNA-PKcs发生相互作用,漆树酸能抑制DNA-PKcs的T2609位点的磷酸化。结论 Tip60通过与DNA-PKcs相互作用,调控细胞DNA双链断裂修复机制,对细胞辐射敏感性产生影响。     

细胞辐射敏感性与DNA双链断裂及修复相关性研究

细胞的辐射敏感性一般由辐照后细胞的存活情况来衡量。细胞的辐射敏感性存在差异，不同个体不同组织来源的细胞对于同种辐射的反应不同，而同种细胞对不同的辐射的反应也存在明显差异。研究表明，DNA是辐射的靶，电离辐射可以引起多种形式的DNA损伤，改变碱基和糖类，引起DNA—DNA和DNA-蛋白之间的交联，同时可以引起DNA单链断裂（single strand break，SSB）和DNA双链断裂（double strand break，DSB）。大量的中性洗脱实验证明DSB是引起细胞死     

DNA双链断裂残留损伤与癌细胞辐射敏感性研究

目的 了解不同组织来源癌细胞株和人体肿瘤组织原代细胞的DNA双链断裂损伤修复的个体差异性,探寻预测癌细胞辐射敏感性的生物指标。方法 ⁶⁰Co γ射线照射诱发DNA损伤,脉冲电场凝胶电泳检测DNA双链断裂损伤修复,细胞克隆形成能力法检测细胞辐射敏感性。结果 8个不同组织来源癌细胞株的辐射敏感性有较大的差异(D₀为0.65~2.15 Gy),不同细胞株20 Gy γ射线照射诱发产生的DNA双链断裂原初损伤有一定的差别,但与细胞辐射抗性无相关性。辐射敏感细胞SX-10的DNA双链断裂修复缺陷发生在早期快速修复相,而A2780细胞的修复缺陷是发生在晚期慢速修复相。20 Gy照射修复2 h后DNA双链断裂残留量与细胞辐射敏感性指标D₀或SF₂值有显著的相关性。不同个体患者脑肿瘤组织原代细胞之间,辐射诱发DNA双链断裂的修复反应存在明显差异,修复2 h后残留损伤的个体差异性分布类似于癌细胞株。结论 DNA双链断裂残留损伤与癌细胞辐射抗性有显著相关性,可作生物指标预测肿瘤组织细胞对放射治疗的反应性。     

UHRF1对人乳腺癌细胞MDA-MB-231辐射敏感性的影响及作用机制

目的 了解基因UHRF1的不同表达水平对乳腺癌细胞MDA-MB-231辐射敏感性的影响及潜在的作用机制。方法 利用克隆形成实验观察细胞存活;流式细胞术测定细胞周期;利用DNA片段分析和Annexin V试剂盒测定细胞凋亡;Western blot 测定蛋白表达变化;利用经典的染色体分析,观察染色体畸变(着丝粒环和双着丝粒)。 结果 与对照相比较,UHRF1转染可将D₀值由2.08 Gy提高至3.17 Gy,即降低MDA-MB-231细胞对X射线的辐射敏感性。利用siRNA抑制UHRF1的表达,可将X射线照射后细胞的生存率由41%降低至17%,即增强了细胞的辐射敏感性。UHRF1的高表达,可诱导G₂/M期阻滞,抑制细胞凋亡,下调促凋亡蛋白Bax,上调DNA损伤修复蛋白Ku70和 Ku80的表达水平,而且,抑制X射线诱导的染色体畸变。结论 UHRF1的高表达可以抑制细胞凋亡,促进DNA损伤修复。因此,通过抑制UHRF1的表达,可作为临床提高乳腺癌放疗疗效的新靶标。     

PTEN基因敲除降低辐射敏感性及其机制

目的 探讨PTEN基因敲除对辐射敏感性的影响及机制。方法 采用流式细胞术检测MEF1和MEF1/PTEN^－/－细胞内ROS水平;采用Western blot方法,检测H₂O₂和DPI预处理后AKT激酶的表达变化;采用细胞克隆形成率试验分析细胞对⁶⁰Co γ射线的敏感性。结果 PTEN基因敲除后细胞ROS水平增加,辐射敏感性降低。H₂O₂和DPI预处理后影响MEF1细胞AKT激酶活性,但对MEF1/Pten^－/－细胞无影响。 结论 PTEN基因敲除阻断了ROS对AKT的介导,AKT激酶持续活化,可能是辐射敏感性降低的重要原因。     

神经纤毛蛋白1对非小细胞肺癌放射敏感性的影响

目的 探讨神经纤毛蛋白1 (neuropilin 1,NRP1)在不同种类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的表达情况及其与肿瘤放射敏感性的关系.方法 通过Western blot技术检测不同来源的5种人NSCLC细胞系(H358、H460、H1299、A549、SK-MES-1)NRP1的基础表达水平,MTT方法检测经不同剂量X射线照射后肺癌细胞的存活情况,初步筛选5种细胞中辐射敏感和辐射抵抗的2种细胞;采用克隆形成实验及流式细胞术分别检测细胞存活分数及凋亡率的变化,分析2种肺癌细胞的放射敏感性,采用Western blot检测2种细胞受X射线作用后 NRP1 的表达变化,通过克隆形成实验检测靶向抑制NRP1对A549细胞放射敏感性的影响.结果 5种肿瘤细胞NRP1表达量由高到低依次为:A549>SK-MES-1>H358>H460>H1299;X射线对肿瘤细胞的抑制能力呈剂量依赖性增强,其抑制率由高到低依次为:H460>H1299>H358>SK-MES-1>A549,因此选取A549细胞和 H460细胞做后续研究.克隆形成实验显示,A549在2 Gy照射下的存活分数(SF₂)是0.887,而H460细胞为0.313.A549细胞受照后的凋亡率为对照组的122.54%,明显低于H460细胞的238.88%.辐射可以诱导A549细胞NRP1的表达上调达40%,同时靶向抑制NRP1则可以增强A549细胞的放射敏感性.结论 在NSCLC细胞中A549细胞具有较强的辐射抗性,且辐射抗性的形成与其NRP1表达上调有关.     

细胞周期与辐射诱发细胞恶性转化的敏感性

细胞正常分裂增殖包括有丝分裂期及分裂间期，随着研究的深入，细胞周期调控的研究已与细胞转化和基因表达调控的研究密不可分。本文简要介绍了联系细胞周期调控与基因表达调控，细胞周期调控与细胞转化的几个问题，并阐述了辐射诱发细胞恶性转化的细胞周期敏感性。     

沙利度胺对食管癌TE1细胞DNA合成抑制作用和辐射敏感性的影响

目的 探讨不同浓度沙利度胺联合X线照射对食管癌TE1细胞放射敏感性的影响。方法 采用细胞划痕实验检测沙利度胺对细胞浸润转移能力的影响,H³-TdR掺入法研究沙利度胺单用及联合X射线对TE1细胞DNA合成抑制作用,用克隆形成法研究对TE1细胞辐射敏感性的影响。结果 沙利度胺对食管癌TE1细胞的浸润转移能力、DNA合成、克隆形成均有明显的抑制作用,并随药物浓度的升高而增强。TE1细胞的D₀、D_q、SF₂值随着沙利度胺浓度的增加而减小:沙利度胺100 μg/ml时放射增敏比SER_D0和SER_Dq分别为1.4±0.2和1.5±0.1;150 μg/ml时的放射增敏比分别为1.4±0.2和1.8±0.2。结论 沙利度胺能够抑制TE1细胞的浸润转移、DNA合成能力,显著提高TE1细胞的辐射敏感性。     

miR-101对宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性的影响和机制研究

目的 研究microRNA101（miR-101）对体外培养的人宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性的影响及其作用机制。方法 实验设为3组,分别为空白对照组、阴性对照组和实验组。采用160 kVp X射线照射细胞,吸收剂量率为1.15 Gy/min。实时定量PCR（qRT-PCR）法检测miR-101的过表达情况;克隆形成实验检测miR-101对HeLa细胞辐射敏感性的影响;γ-H2AX免疫荧光法检测细胞DNA双链断裂,Western blot实验观察ATM和DNA-PKcs蛋白表达量变化。结果 转染48 h后,实验组的细胞与空白对照组相比,miR-101的表达量明显增加（t=14.16,P<0.05）。过表达miR-101的HeLa细胞存活率明显降低（t=10.75,P<0.05）。miR-101能增加HeLa细胞的辐射敏感性（F=7.72,P<0.05）,辐射增敏比为1.29。γ-H2AX免疫荧光显示,miR-101能抑制辐照后细胞DNA损伤修复。过表达miR-101的HeLa细胞与对照组相比,ATM和DNA-PKcs蛋白表达量明显减少。结论 miR-101 mimic对HeLa细胞的生长有抑制作用。miR-101过表达能增加HeLa细胞的辐射敏感性,miR-101通过抑制辐照后DNA损伤修复提高辐射敏感性。     

组蛋白修饰影响细胞辐射敏感性的研究进展

组蛋白修饰在细胞DNA损伤修复过程发挥重要作用。近年来多项研究表明,组蛋白修饰可以在参与招募DNA损伤修复因子、创建染色质开放结构和建立组蛋白抑制性标记等方面影响细胞对辐射的应答。同时,调控组蛋白修饰方式可以影响DNA损伤修复的过程,进而影响辐射敏感性。本文就组蛋白修饰影响DNA损伤修复过程与辐射敏感性的机制进行综述。     

Ability to repair DNA double-strand breaks related to cancer susceptibility and radiosensitivity

Traditional radiobiology has aimed at elucidating the mechanism of radiosensitivity of cancer cells and normal cells. Because the mechanism of DNA double-strand break (DSB) repair, which is inherently important to radiosensitivity, was unknown, it has been difficult to obtain results applicable to clinical radiotherapy from traditional radiobiology research. Today, however, the molecular mechanism of DNA DSB repair has been elucidated because of the rapid advances in molecular biology. In DNA DSB repair, at least two major repair mechanisms, homologous recombination and nonhomologous end joining (NHEJ) have been reported. In the NHEJ pathway, DSBs are directly, or after processing of the DNA ends, rejoined at an appropriate chromosomal end. DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) plays an important role in DNA DSB repair by NHEJ. We have investigated how the ability of repair of DNA DSB influences cancer susceptibility and the radiosensitivity of tumors and normal tissues by focusing on the activity of DNA-PK. In the near future, research on DNA DSB repair mechanism will be able to be applied to research on carcinogenesis, prediction of radiosensitivity of tumors and normal cells, and sensitization of tumor cells.     

ZNF451通过调控53BP1/MDC1促进A549和HeLa细胞DNA损伤修复

目的:探究SUMO E3连接酶(zinc finger protein 451,ZNF451)介导非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞DNA损伤修复的功能及机制。方法:采用γ射线或依托泊苷处理A549细胞和HeLa细胞,CCK-8法检测细胞增殖活力,蛋白免疫印迹法检测蛋白表达量。DR-GFP质粒系统检测DNA损...     

60Coγ射线对hOGG1低表达细胞株放射敏感性的影响

目的研究^60 Co γ射线对DNA碱基切除修复基因hOGG1低表达细胞株放射敏感性的影响.方法以A549细胞和通过稳定转染hOGG1核酶而获得的hOGG1低表达的A549-R细胞为研究对象,用MTT法测定不同剂量γ射线照射后两种细胞的存活率;单细胞凝胶电泳检测^60 Coγ射线处理后两种细胞DNA损伤与修复的差异;流式细胞术检测照射后两种细胞的周期分布、凋亡率和细胞增殖指数.结果照射后两种细胞的存活率均随照射剂量的增加而下降,但A549-R细胞组的存活率显著低于相同剂量组的A549细胞（P＜0.05）;所设剂量均可诱导细胞DNA损伤,但DNA迁移长度和彗星细胞率在两种细胞间差异无统计学意义（P＞0.05）;损伤后的修复在两种细胞间差异有统计学意义（P＜0.05）,A549-R细胞的修复能力远远低于A549细胞.流式细胞术检测结果表明：照射后两种细胞都表现为G0/G1期细胞阻滞,细胞凋亡随照射剂量的增加而增加,细胞增殖指数随照射剂量的增加而降低,这些变化均以A549-R细胞更为明显.结论hOGG1低表达使得细胞DNA修复能力降低,细胞周期阻滞于G0/G1期、细胞增殖减慢、凋亡增加、存活率下降,从而使细胞对^60Coγ射线的放射敏感性增强.     

鼻咽癌细胞系CNE-2Z放射敏感性的异质性及其机理探讨

目的　进一步证实人鼻咽癌细胞系CNE 2Z确实存在着放射敏感性的异质性 ,并探讨其有关机理。方法　观察人鼻咽癌细胞系CNE 2Z亚克隆株H5和S1的裸鼠移植瘤放射敏感性的不同 ;用流式细胞仪、荧光显微镜、Western blot检测H5和S1凋亡能力的不同及凋亡相关蛋白表达的差异 ;用3H掺入法说明DNA合成抑制率与放射敏感性的不同 ;用RT PCR观察相关癌基因 (fas、p5 3)的表达与放射敏感性的关系。结果　鼻咽癌细胞系CNE 2Z中确实存在放射敏感性的异质性 ,H5、S1两种细胞的凋亡率都随着照射后时间的延长而增加 ,但H5比S1高且差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。两种细胞的DNA合成率于放射前无差别 ;照射后都较放射前受到抑制 (P <0 0 5 ) ,H5受抑制程度大 (P <0 0 5 )。H5与S1细胞fas、p5 3基因的表达差异无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论　本实验再次证实了鼻咽癌细胞系CNE 2Z确实存在放射敏感性异质性 ,并证实了其异质性的机理与细胞受射线照射后引起凋亡的能力不同有关、与DNA合成的抑制率成正相关、与癌基因fas、p5 3的表达无关。     

蒿甲醚对人鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性的影响及其机制研究

目的 研究蒿甲醚(artemether)对人鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响及其作用机理。方法 用MTT法检测蒿甲醚对CNE-1细胞生长的抑制效应;克隆形成法检测蒿甲醚对CNE-1细胞放射敏感性的影响;流式细胞仪检测不同处理因素对CNE-1细胞的细胞周期的影响;Western blot分析蒿甲醚对电离辐射诱导的CNE-1细胞中的细胞周期调控蛋白Cyclin B1和Wee1表达水平的影响。结果 蒿甲醚可抑制CNE-1细胞的增殖,且药物浓度和作用时间相关;20 μmol/L蒿甲醚对CNE-1细胞有放射增敏作用,其放射增敏作用随作用时间的延长而延长,作用24 h 后增敏作用最强,放射增敏比(SER)为1.481。流式细胞仪分析表明,单纯⁶⁰Co γ射线照射后G₂/M期细胞比例上升,而G₀/G₁期细胞比例下降;药物和射线联合作用后,与单纯照射组相比,G₀/G₁期细胞比例上升(t=4.59,P<0.05),G₂/M期细胞比例下降(t=10.60,P<0.05)。蒿甲醚可降低照射后CNE-1细胞内Wee1蛋白表达水平,提高Cyclin B1蛋白表达水平。结论 低浓度蒿甲醚对CNE-1 细胞有放射增敏作用;蒿甲醚通过改变细胞周期调控蛋白Cyclin B1和 Wee1表达水平,诱导G₂/M 期阻滞而发挥放射增敏作用。     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制。方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin。酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性。结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin 蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t₁=10.63,P<0.001;t₂=3.75 ,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D₀、D_q无明显变化,而pGenesil2-survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性。结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性。