成纤维细胞生长因子21对缺氧复氧心肌细胞的保护作用及机制研究

【摘要】 目的 探讨成纤维细胞生长因子21（FGF21）对缺氧复氧（H/R）心肌细胞的保护作用及对PI3K/AKT通路的影响。方法 重组腺病毒载体Ad FGF21诱导原代心肌细胞过表达FGF21。腺病毒转染心肌细胞后构建H/R损伤模型（3h缺氧联合3h复氧）。实验分为对照组（Con组）、H/R组、H/R+Ad GFP组、H/R+Ad FGF21组4组。心肌细胞存活率评估细胞损伤程度;SOD/MDA检测联合DHE荧光染色评估氧化应激反应（ROS）;流式细胞术评估细胞凋亡;Western blot检测相关蛋白水平。在机制探讨实验中给予PI3K/AKT抑制剂（LY294002）进行干预。结果 与Con组相比,H/R损伤后FGF21蛋白表达显著下调,并伴随心肌细胞活性降低、ROS与凋亡反应激活。腺病毒介导的心肌细胞过表达FGF21能够明显抑制H/R损伤,表现为细胞活力、ROS与凋亡反应均有不同程度改善。FGF21心肌细胞过表达能够增加PI3K/AKT磷酸化水平,而抑制PI3K/AKT通路后FGF21过表达介导的细胞保护功能被逆转。结论 FGF21主要通过PI3K/AKT依赖性途径改善心肌细胞H/R损伤。     

转录因子ChREBP-α增强小鼠原代肝细胞的脂质合成能力

目的 构建含转录因子ChREBP-α基因的重组腺病毒载体,检测其在小鼠原代肝细胞中的表达及其对脂质合成的调节作用.方法 将ChREBP-αcDNA克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV载体,与pAdEasy质粒在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得腺病毒载体pAd-ChREBP-α,在293A细胞中进行病毒的包装和扩增,检测病毒的滴度;将腺病毒Ad-ChREBP-α感染小鼠原代肝细胞,用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测ChREBP-α的表达,实时荧光定量PCR检测ChREBP-α靶基因LPK mRNA的表达.用核素14C示踪法测定肝细胞的脂质合成速率.结果 成功制备了ChREBP-α重组腺病毒,利用其在原代肝细胞过表达ChREBP-α,可显著上调靶基因LPK的表达,并增强肝细胞的脂质合成速率.结论 成功制备了具有生物学活性、能在原代肝细胞中过表达的ChREBP-α重组腺病毒,为研究ChREBP-α的糖脂代谢调控作用奠定了基础.     

FLIP腺病毒表达载体的构建及其在大鼠肺血管内皮细胞中的表达

目的：构建FLIP（FLICE—inhibitory protein）腺病毒表达载体并观察该载体在大鼠肺血管内皮细胞（PVEC）中的表达情况,为研究FLIP蛋白的抗凋亡作用打下基础．方法：利用含有大鼠FLIP基因的原始载体,通过Admax腺病毒包装系统,构建表达大鼠FLIP基因的重组腺病毒Ad—FLIP;原代培养并鉴定大鼠PVEC．利用成功构建的重组腺病毒Ad—FLIP感染大鼠PVEC．通过逆转录酶-多聚酶链反应（reverse transcfiptase—polymerase chain reaction,RT—PCR）和Western Blot分别检测经重组腺病毒Ad—FLIP感染后大鼠PVEC及对照组细胞中FLIP基因mRNA和蛋白表达水平．结果：成功构建含有大鼠FLIP基因的重组腺病毒Ad—FLIP;经Ⅷ因子间接免疫荧光鉴定原代培养大鼠PVEC纯度达90％以上;大鼠PVEC经重组腺病毒Ad—FLIP感染后24h即检测到FLIP mRNA和蛋白表达水平明显增高．结论：重组腺病毒Ad—FLIP可有效提高大鼠PVEC中FLIP基因的表达水平．     

核转录因子κB RNA适体重组腺病毒载体的构建

目的：构建核转录因子κB(NF—κB)RNA适体(aptamer)重组腺病毒载体pAdeasy—aptamer，制备重组腺病毒Ad—aptamer并测定其活性。方格：采用亚磷酸二酯法合成aptamer cDNA的6个寡核苷酸片段并拼接完整，克隆至pGEM—7Z载体中，经酶切鉴定和测序后把aptamer cDNA定向插入穿梭质粒pShuttle—CMV的多克隆位点上，再将重组质粒pShuttle—CMV—aptamer与腺病毒载体pAdeasy在大肠杆菌BJ5183中同源重组产生重组腺病毒载体pAdeasy—aptamer。用脂质体转染pAdeasy—aptamer至HEK293细胞，产生有感染能力的重组腺病毒Ad—aptamer，RT—PCR检测重组腺病毒在感染细胞中的表达，并测定其对体外抑制炎症细胞系释放炎症介质IL-1β和IL—6的影响。结果：感染重组腺病毒的细胞具有aptamer cDNA的表达，重组腺病毒能抑制感染细胞炎症介质的释放，具有预期的生物学活性。结论：产生具有生物学活性的重组腺病毒Ad—aptamer，为下一步基因治疗因NF—κB过度激活引起的急慢性炎症反应奠定基础。     

GALNT2通过EGFR信号通路影响胰岛素自身免疫综合征的作用机制

目的：探究GALNT2通过激活EGFR信号通路影响胰岛素自身免疫综合征的作用机制。方法：首先在L-02细胞中过表达或者敲低GALNT2,利用western blot检测在EGF刺激诱导下的EGFR磷酸化水平,同时利用凝集素下拉试验检测了EGFR的糖基化水平。随后我们在细胞中过表达GALNT2以及同时加入PI3K抑制剂,利用western blot检测EGFR的下游信号通路PI3K/AKT的激活情况。接下来我们检测了过表达GALNT2以及同时加入PI3K抑制剂时细胞内NADPH/NADP+比率,以及培养基中的葡萄糖和乳酸含量,探索GALNT2对细胞代谢的影响。最后我们在高胰岛素处理的胰岛素抵抗细胞模型中,检测了GALNT2对细胞的葡萄糖摄取能力的影响。结果：过表达GALNT2的细胞在EGF刺激后,EGFR的磷酸化水平升高,并且EGFR的O型糖基化修饰水平也同样升高;而敲低GALNT2的细胞EGFR磷酸化和O型糖基化水平降低。过表达GALNT2的细胞AKT和mTOR的磷酸化水平升高,而同时加入PI3K抑制剂则能够逆转GALNT2的影响,即GALNT2能够通过促进EGFR磷酸化,激活PI3K/AKT信号通路。GALNT2能够提高NADPH/NADP+比率,促进细胞代谢,而同时加入PI3K抑制剂则能够逆转GALNT2的影响。在高胰岛素诱导的胰岛素抵抗细胞模型中,过表达GALNT2提高了PPAR-γ和PEPCK的mRNA水平,提高了葡萄糖摄取能力。结论：GALNT2通过糖基化修饰EGFR,促进了EGFR的磷酸化,激活PI3K/AKT信号通路,从而促进PPAR-γ和PEPCK的表达,促进细胞代谢,减少能量储存,从而可能诱发胰岛素自身免疫综合征。 关键词：GALNT2; EGFR; 胰岛素自身免疫综合征; PI3K/AKT; 胰岛素抵抗     

PTEN基因表达改变对人气道平滑肌迁移的影响

目的通过腺病毒载体体外转染人气道平滑肌细胞(HASMC),使肿瘤抑制基因PTEN过表达和RNA干扰表达,观察其对HASMC迁移的影响,并探讨其作用机制。方法利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-GFP-PTEN)和针对PTEN基因的腺病毒短发夹状RNA(shRNA)载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN)转染HASMC细胞,并以感染空载腺病毒Ad-GFP和空白组(DMEM)作为对照,用流式细胞计数确立最佳转染复数后,通过Transwell趋化小室和细胞划痕实验检测HASMC跨膜迁移能力和横向迁移能力的变化。Western blotting检测PTEN蛋白的表达和AKT、ERK1/2通路的活化情况,并加入两通路的抑制剂作为阳性对照。结果腺病毒搭载的PTEN基因过表达和干扰载体能成功改变PTEN基因的表达。上调PTEN表达能显著抑制HASMC迁移;蛋白水平上抑制PI3K/AKT通路,而MAPK/ERK通路未见变化。下调PTEN表达不能明显促进HASMC迁移;但在蛋白水平能使PI3K/AKT通路激活,而MAPK/ERK通路却受到抑制。结论上调PTEN表达能有效抑制HASMC的迁移,可能主要是通过抑制PI3K/AKT通路起作用。     

LncRNA TUC338通过激活EGFR/PI3K/AKT 信号通路促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探讨长链非编码RNATUC338（lncRNA TUC338）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖、迁移、侵袭及表皮生长因子受体（EGFR）/磷酸肌醇3激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）通路的影响。方法 收集2019年7月—2021年6月我院胸外科手术切除的37例NSCLC患者肺癌组织与癌旁组织标本,RT-qPCR检测组织标本及NSCLC细胞中lncRNA TUC338表达;对NCI-H157细胞进行干预,将si-TUC338、si-NC、pcDNA-TUC338、pcDNA-NC质粒转染细胞及EGFR与PI3K双重抑制剂MTX-211（MTX-211）、pcDNA-TUC338与MTX-211共同处理细胞,CCK-８法检测细胞增殖,Transwell小室法检测细胞迁移与侵袭,Western blot检测细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9蛋白及EGFR、PI3K、AKT相关蛋白表达。结果 LncRNA TUC338在肺癌组织与细胞中高表达;抑制lncRNA TUC338表达可显著抑制NCI-H157细胞增殖、迁移与侵袭及EGFR/PI3K/AKT通路激活（P＜0.05）;过表达lncRNA TUC338可促进NCI-H157细胞增殖、迁移与侵袭及EGFR/PI3K/AKT激活（P＜0.05）。结论 LncRNA TUC338在肺癌中呈高表达,可能通过激活EGFR/PI3K/AKT信号通路促进肺癌NCI-H157细胞增殖、迁移与侵袭。     

重组腺病毒介导siRNA抑制大鼠肝细胞NF-κB p65的表达

目的构建重组腺病毒Ad-NF-κB p65-siRNA，并观察其抑制大鼠肝细胞NF-κB p65表达的效果。方法（1）筛选针对大鼠NF-κB p65特异性siRNA靶序列，设计合成其对应的双链DNA，插入到pShuttle—H1中，得到psiRNA—NF-κB p65质粒。将构建好的psiRNA—NF-κB p65质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行重组，酶切鉴定、293A细胞包装、扩增，得到重组腺病毒Ad—NF-κB p65-siRNA。（2）将构建好的Ad—NF-κB p65-siRNA转染大鼠肝细胞株BRL，48h后，采用RT-PCR和Western blot检测NF-κB p65表达。结果成功地构建了重组腺病毒Ad—NF-κB p65-siRNA；Ad—NF-κB p65-siRNA转染大鼠肝细胞48h后，NF—κB的mRNA水平下降了81％，细胞内的NF—κB蛋白浓度下降了71％。结论腺病毒介导的RNAi技术体外显著地抑制大鼠肝细胞NF-κB p65的表达。     

重组腺病毒过表达Notch1受体胞内结合域（NICD1）外源性激活Notch信号通路

目的：构建Notch1受体胞内结合域（Notch1 intracellular domain,NICD1）的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响。方法：利用高保真PCR（high fidelity PCR,Hi?Fi PCR）扩增NICD1编码区,并通过Gibson Assembly方法将其克隆至腺病毒载体中,经过菌落PCR、测序鉴定后,在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,再次通过质粒PCR鉴定,然后运用PacⅠ酶切线性化后用重组腺病毒载体转染过表达pTP基因的人胚肾293细胞（human embryo kidney 293 cell line,HEK293）中进行包装,收取病毒后使用过表达pTP基因的HEK293细胞扩增重组腺病毒AdNICD1。运用AdNICD1感染脂肪来源的间充质干细胞（immortalized multipotent adipose?derived mesenchymal stem cells,iMAD）,检测病毒感染效率;通过Q?PCR检测NICD1和Notch下游基因表达情况;利用Western blot检测NICD1在蛋白水平的表达情况。结果：成功构建过表达NICD1的重组腺病毒并有效感染iMAD;利用AdNICD1可明显增加NICD1在基因和蛋白水平的表达,并激活Notch信号下游基因的表达。结论：成功构建过表达NICD1的重组腺病毒,并有效激活Notch信号通路。     

Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶重组腺病毒载体的构建、鉴定及初步应用

目的：构建携带Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶（PKGII）基因的重组腺病毒载体,并以此初步研究PKGⅡ对增殖相关的MAPK信号转导的影响。方法：将PKGⅡcDNA片段自载体pRC／CMV-GKⅡ（wt）中切出,克隆至穿梭质粒pENTR1A,用ClonaseⅡ将pENTR—PKG11中的PKGⅡcDNA片段定向克隆到pAd／CMV／V5．DEST中构建pAd／CMV／V5-DEST—PKGⅡ（Ad—PKGⅡ）。重组质粒Ad—PKGⅡ用PacⅠ酶酶切,使其线性化,再用脂质体转染法转染HEK293A细胞进行包装和扩增,微量全细胞病变法检测病毒滴度,蛋白质印迹法检测重组腺病毒Ad—PKGⅡ感染细胞后PKGⅡ的表达以及MAPK通路关键成分胞外信号调节激酶（ERK）活性的变化。结果：重组腺病毒滴度达5×10^9 pfu／ml,蛋白质印迹法检测显示重组腺病毒感染CS54细胞后使其PKGⅡ表达明显增高;在BGC-823胃癌细胞株,PKGⅡ对EGF导致的ERK的激活有明显抑制作用。结论：成功构建了携带PKGⅡ基因的重组腺病毒,初步证明PKGⅡ对细胞增殖相关信号转导有抑制作用,为进一步研究PKGⅡ与肿瘤细胞发生发展的关系提供了基础。     

PDX1真核表达载体的构建及其对PANC-1细胞PI3K/AKT信号途径的影响

目的 构建胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX1)基因真核表达载体并转染至PANC-1细胞,观察其对PI3K/AKT信号通路的影响.方法 从Hela细胞中提取总RNA,逆转后PCR扩增PDX1编码区片段,然后将PDX1的CDS插入PCMV6-Entry质粒构建PCMV6-Entry-PDX1表达重组体.重组体转染至PANC-1细胞中通过G418筛选出稳定表达细胞株.Western blot分析PDX1蛋白水平表达及p-AKT水平变化.结果 PDX1基因成功在PANC-1中表达.利用West-ern blot检测验证获得了稳定的PDX1过表达细胞株.West-ern blot结果显示:过表达PDX1的细胞株AKT表达含量与正常细胞及对照细胞没有区别而p-AKT水平降低.结论 PDX1基因过表达能够降低PANC-1细胞的p-AKT水平.     

PTEN基因对子宫内膜癌细胞PI3K/AKT通路的影响

 【目的】探讨PTEN基因在子宫内膜癌PI3K/AKT通路中的作用,评估PTEN基因在抗肿瘤治疗中的意义。【方法】利用慢病毒载体系统, 构建人PTEN基因RNA干扰慢病毒载体和PTEN基因过表达慢病毒载体,分别转染PTEN野生型的HEC-1A细胞和PTEN突变型的Ishikawa细胞, 建立PTEN 基因敲减及过表达的细胞模型,Western Blot方法检测PTEN基因敲减或过表达前后PTEN蛋白的表达和AKT通路的活化情况, MTT法检测慢病毒转染前后细胞增殖的变化,流式细胞术检测慢病毒转染前后细胞周期及细胞凋亡率的变化。【结果】1. HEC-1A细胞转染PTEN基因干扰慢病毒载体后,细胞的增殖曲线和细胞凋亡率与对照组比较无明显变化。但Ishikawa细胞转染PTEN基因过表达慢病毒载体后,增殖曲线和细胞凋亡率显示其生长呈明显抑制状态。2.当HEC-1A细胞转染了RNA干扰病毒后（HEC-1A-RNAi）,Western Blot 结果显示PTEN蛋白表达下调,其EGFR, p-EGFR, mTOR, p-mTOR, AKT, p-AKT蛋白表达增强,当Ishikawa细胞转染了过表达载体病毒后（Ishikawa-PTEN）,Western Blot 结果显示其PTEN蛋白表达上调,p-EGFR,p-mTOR,AKT,p-AKT蛋白表达减弱。3.HEC-1A-RNAi细胞周期中G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,Ishikawa-PTEN细胞周期中G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少。【结论】PTEN 基因可以抑制细胞增殖过程, 有可能成为子宫内膜癌患者基因治疗的选择之一。     

EGFR与PI3K/AKT信号通路相关蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其意义

目的 研究表皮生长因子受体(EGFR)和磷酸肌醇3激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路相关蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达以及其临床意义.方法 应用免疫组化学SP法检测100例NSCLC组织及其相应正常癌旁组织中的EGFR、PI3K、AKT蛋白表达水平.结果 100例正常的癌旁组织中EGFR、PI3K及AK...     

MiRNA-142-5p在大鼠角膜新生血管中的作用及机制研究

目的 观察microRNA-142-5p(miRNA-142-5p)对大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CorNV)的作用及其与VEGF/PI3 K/AKT通路的关联情况.方法 角膜缝线法诱导SD大鼠右眼CorNV作为实验组,左眼作为对照组.取缝线后第7天的角膜进行实时荧光定量聚合酶反应(Real-time PCR,RT-PCR)检测miRNA-142-5p以及VEGF mRNA的表达水平.将miRNA-142-5pmimic转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),RT-PCR检测miRNA-142-5p的表达量来验证转染是否成功.并通过RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HUVECs中VEGF及PI3 K/AKT mRNA和蛋白的表达量.分别用Transwell、CCK-8法及Matrigel胶管腔形成实验检测HUVECs的迁徙、增殖及管腔形成能力.结果 成功建立CorNV模型.RT-PCR结果显示7d组miRNA-142-5p(6.799±1.683)和VEGF(3.297±0.334)的表达量较正常角膜组(normal)显著升高(P＜0.01).转染miRNA-142-5p mimic后的miRNA-142-5p的表达量显著高于空白对照及阴性对照组(P＜0.01).Transwell、CCK-8及Matrigel胶管腔形成实验结果示miRNA-142-5p提高了HUVECs的迁徙、增殖及管腔形成能力(P＜0.01).转染miRNA-142-5p mimic后HUVECs中VEGF及PI3 K/AKT的mRNA及相应蛋白的表达均明显上升(P＜0.05).结论 CorNV中miRNA-142-5p及VEGF的表达明显上调,过表达miRNA-142-5p可以显著提高HUVECs中VEGF及PI3 K/AKT通路各主要成员mRNA和蛋白的表达水平,进而促进HUVECs的迁徙、增殖及管腔形成能力.表明miRNA-142-5p可通过PI3K/AKT通路参与CorNV的调控.     

脉冲电磁场促进成骨细胞成熟分化依赖于初级纤毛-PI3K/AKT途径

目的: 研究脉冲电磁场(pulse electromagnetic fields, PEMF)促进大鼠成骨细胞成熟分化是否与初级纤毛和PI3K/AKT途径相关,探讨PEMF促进骨形成的作用机制。方法: 用酶解法获取新生SD大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts, ROB), 50 Hz、0.6 mT PEMF处理0、0.5、1、1.5和2 h后检测磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)蛋白表达量及初级纤毛长度和发生率的变化情况;用LY294002阻断PI3K/AKT信号途径,观察PEMF促进ROB成骨性分化是否受到影响;以RNAi法干扰IFT88的基因表达以抑制初级纤毛发生,观察PEMF激活的PI3K/AKT信号途径及ROB的成骨性分化是否受到影响。成骨性分化指标包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性,real-time PCR法和Western blot法检测的成骨性相关基因BMP-2、COL-1和OSX的基因表达量,以及钙化结节数量等。结果: 经PEMF处理0、0.5、1、1.5、2 h后,ROB的PI3K、AKT蛋白表达量升高(P<0.01),初级纤毛变长;其中PI3K在0.5 h时蛋白表达量达到最高,随着PEMF处理时间增加,蛋白表达量降低; AKT在0.5 h和1.5 h时蛋白表达量较高。用PI3K阻断剂LY294002阻断PI3K/AKT信号途径后,PEMF不再能提高成骨细胞中ALP 活性和成骨性相关基因BMP-2、COL-1、OSX的基因表达量,但在阻断前PEMF能增加ROB中ALP活性和成骨性相关基因的表达;RNAi干扰初级纤毛发生后,PEMF不再能增加PI3K的蛋白表达量,说明初级纤毛干扰后,PEMF不能激活PI3K/AKT信号途径;其次,PEMF提高ALP活性的作用消失,也不能提高BMP-2、COL-1和OSX的基因表达量,其增加ROB钙化结节形成能力的作用也消失,说明初级纤毛干扰后,PEMF促进成骨细胞成熟矿化的能力消失。结论: PEMF通过成骨细胞表面的初级纤毛激活了PI3K/AKT信号途径,进而发挥了骨形成活性的促进作用。     

rhEPO通过调节PI3K/AKT信号通路改善大鼠脑出血后神经元损伤

目的 研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)是否可以通过调节PI3K/AKT信号通路来改善大鼠脑出血后的神经元损伤。方法SD大鼠构建脑出血(ICH)模型,并给予rhEPO药物治疗,采用TUNEL法和试剂盒检测神经细胞凋亡及凋亡蛋白Caspase 9表达;采用Real-Time PCR法和Western blot法检测PI3K、AKT的基因和蛋白磷酸化水平的表达。结果与ICH非治疗组相比,rhEPO治疗组中神经元凋亡细胞数和Caspase 9活性表达明显降低(P<0.05); rhEPO治疗组PI3K和AKT的蛋白磷酸化水平表达和mRNA表达显著升高 (P<0.05)。结论重组人促红细胞生成素rhEPO具有神经保护作用,可以通过调节PI3K/AKT信号来改善大鼠脑出血后的神经元损伤。     

携带表皮生长因子受体反义cDNA的重组腺病毒的构建

目的构建携带参与细胞周期调控的表皮生长因子受体(EGFR)反义cDNA的重组腺病毒载体。方法将1032 bp EGFR反义cDNA片段正向及反向插入腺病毒载体质粒pA dT rack-CM V上,与骨架质粒在大肠杆菌B J5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带EGFR反义cDNA的重组腺病毒A dE asy-GFP-EGFR-sense/an tisense。结果成功地构建了A dE asy-GFP-EGFR-sense/an tisense的重组腺病毒载体系统,经测定腺病毒载体滴度分别2.2×109efu/mL和2.5×109efu/mL。结论构建的重组腺病毒A dE asy-GFP-EGFR-an t-isense可望有效地将EGFR-an tisense cDNA基因导入喉癌细胞株/组织内,为进一步研究喉癌细胞信号转导干预机制和治疗研究提供实验基础。     

双表达骨形态发生蛋白9、7重组腺病毒载体的构建及其对间充质干细胞C3H10的成骨作用

目的 构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、7腺病毒重组体并进行初步成骨鉴定.方法 自单一表达的BMP9或BMP7 AdEasy质粒上扩增BMP9和BMP7基因序列,先后定向亚克隆至同一穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质pASG2-BMP9、7.酶切、PCR鉴定及测序正确后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组获得双表达BMP9、BMP7腺病毒质粒,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达BMP9、BMP7腺病毒,体外转染C3H10细胞,碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色检测其早晚期成骨作用.结果 成功构建双表达BMP9、BMP7的腺病毒,RT-PCR证实双表达腺病毒在C3H10细胞中表达,其转染的C3H10细胞早期碱性磷酸酶染色及晚期钙茜素红染色活性较单一表达的BMP7或BMP9腺病毒组增强.结论 成功构建双表达BMP9、BMP7的重组腺病毒载体,其重组体具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力.