S100A8启动子的克隆及转录活性检测

目的 构建小鼠S100A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖(LPS)、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性.方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达.结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加.结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础.     

S100A8启动子的克隆及转录活性的检测

目的 构建小鼠S100 A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖（LPS）、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性。方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达。结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加。结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础。     

JAB1表达下调对LPS诱导炎性因子TNF-α和IL-6的影响

目的 初步探讨JAB1基因表达下调对炎症反应的影响.方法 构建特异性针对小鼠JAB1基因的RNA干扰真核表达载体,转染到RAW264.7细胞中降低其JAB1基因的表达,观察LPS刺激后培养上清中炎性因子TNF-α和IL-6的浓度变化.结果 成功得到小鼠JAB1基因的RNA干扰真核表达载体(pPUR/U6-siJAB1),将其转染RAW264.7细胞后使JAB1的蛋白表达水平显著下降,经LPS刺激后培养上清中炎性因子TNF-α和IL-6的浓度较正常细胞明显降低.结论 小鼠JAB1基因的低表达使RAW264.7细胞在经LPS诱导后的炎性因子产生降低,推测其在炎症反应中对致炎因素的影响更大.     

桦褐孔菌多糖对脂多糖刺激小鼠巨噬细胞促炎性细胞因子表达的影响

[目的]观察桦褐孔菌多糖对脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞株Raw264.7细胞与小鼠腹腔巨噬细胞促炎性细胞因子表达的影响.[方法]利用桦褐孔菌多糖(40mg/L)处理被LPS(100μg/L)刺激的Raw264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞,采用半定量RT-PCR方法测定促炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1βmRNA的表达;采用ELISA法测定TNF-α和IL-1β水平.[结果]与给予LPS刺激相比较,给予桦褐孔菌多糖和LPS同时刺激的Raw264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α和IL-1βmRNA表达水平均明显降低(P<0.05);给予桦褐孔菌多糖和LPS同时刺激的Raw264.7细胞株在48 h后与只给予LPS刺激相比较,细胞所分泌的促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β水平均明显下降(P<0.05).[结论]桦褐孔菌多糖对LPS刺激Raw264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α和IL-1βmRNA表达水平及Raw264.7细胞株促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌均有抑制作用.     

人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的:构建IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内IP10的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法:采用基因重组技术构建含IP10启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-IP10;用脂质体瞬时转染HEK293 细胞,观察IP10启动子对脂多糖(LPS)刺激的反应.结果:酶切和DNA 测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的;该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低,经LPS 刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论:所构建的IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于IP10基因表达信号调控机制的研究.     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的调控机制。方法以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1~ -1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc,采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS-Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞,用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞,检测并比较荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达;(3)在LPS刺激下,人eNOS启动子的转录活性降低,而在tPNS和TGFβ1刺激下,其启动子的转录活性增强,其中,TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论正确构建了人eNOS基因启动子区(-1~-1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc;tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的:探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的词控机制。方法:以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1--1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc,采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS—Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞,用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞,检测并比较荧光素酶／β-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果：(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达;(3)在LPS刺激下．人eNOS启动子的转录活性降低,而在tPNS和TGFβ1刺激下,其启动子的转录活性增强,其中,TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论：正确构建了人eNOS基因启动子区(-1-1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS—Luc;tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

神经干细胞特异性调控启动子研究

目的 研究神经干细胞特异性调控启动子。方法 PCR扩增出小鼠nestin基因启动子全序列(4000bp)、核心序列(400bp)和内含子 2;以pcDNA3.1为模板,构建6种重组质粒,分别用CMV、CMV+内含子-2、nestin基因启动子全序列、nestin基因启动子全序列+内含子 2、nestin基因启动子核心序列、nestin基因启动子核心序列+内含子-2作为启动子调控报告基因EGFP表达;6种重组质粒分别转染nestin+、nestin-细胞,荧光显微镜下观察转染后细胞内EGFP表达,同时采用流式细胞仪法测定表达EGFP细胞表达率。结果 nestin基因启动子全序列及核心序列都能非特异性调控EGFP基因在细胞内表达,并且具有较强调控能力,与内含子-2融合后,只能特异性调控EGFP基因在nestin+细胞表达,而CMV启动子与内含子-2序列融合只具有非特异性调控能力。结论 nestin基因启动子全序列与内含子-2协同调控外源基因在nestin+细胞特异性表达。     

异丙酚对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞内皮源型一氧化氮合酶基因启动子转录活性的影响

目的 探讨异丙酚对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内皮源型一氧化氮合酶(heNOS)基因启动子转录活性的影响.方法 以基因重组技术构建heNOS基因启动子区(-1～-1600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL2-Basic,得到质粒peNOS-Luc.采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS-Luc、空载体pGL2-Basic和?-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-?共转染HUVEC,用LPS、LPS 异丙酚和LPS 转移生长因子?1(TGFb1)分别刺激转染后的HUVEC,检测并比较荧光素酶/?-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、异丙酚和TGF?1对heNOS基因启动子转录活性的影响.结果 (1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在HUVEC中有效表达;(3)与未加刺激组比较,LPS刺激组heNOS启动子的转录活性降低.与LPS刺激组比较,LPS 异丙酚和LPS TGF?1组heNOS启动子的转录活性增强.结论 异丙酚能明显增强heNOS基因启动子的转录活性,可初步证实异丙酚在转录水平通过上调heNOS基因启动子的转录活性而影响NO的生成和释放,这可能是异丙酚防治LPS诱导引起炎症反应的机制之一.     

蛋白激酶C对内毒素诱导的诱导型一氧化氮合酶基因表达的调控作用

目的探讨内毒素(LPS)诱导单核/巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达的分子机制.方法用LPS刺激诱导RAW264.7细胞,观察其对蛋白激酶C(PKC)的激活,用Griess还原法测定PKC抑制剂对LPS诱导的一氧化氮(NO)生成作用,并用逆转录PCR(RT-PCR)研究其对iNOS基因表达的影响;构建iNOS荧光素酶报告基因载体,用基因转染及报告基因检测等方法研究LPS刺激RAW264.7细胞对iNOS启动子活性的诱导作用及PKC对其影响.结果 LPS刺激RAW264.7细胞引起PKC磷酸化激活和膜移位(P<0.01);LPS刺激诱导RAW264.7细胞12 h后即可明显诱导NO生成(30.1 μmol/L±5.4 μmol/L, P<0.01)和iNOS基因表达;PKC抑制剂H-7可抑制NO的生成(P<0.01)和iNOS基因表达;LPS刺激诱导iNOS启动子的转录活性(25.3±4.6相对荧光素酶活性单位, P<0.01),用H-7和钙离子通道阻滞剂异博定(Verapamil)均可抑制其转录活性(P<0.01).结论 LPS刺激RAW264.7细胞,通过引起细胞内钙增加和PKC激活诱导iNOS基因表达,使NO生成增加,这是内毒素休克时NO增加的一个重要的信号机制.     

前列腺特异性膜抗原启动子调控的重组质粒的构建及表达

目的 探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,为前列腺癌靶向性基因治疗作前期铺垫。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中扩增PSMA启动子序列,将其克隆到含有报告基因——增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体,脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察EGFP在不同细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP-PSMAm,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNeap细胞中存在GFP的有效表达。结论 PSMA启动子调控EGFP表达的重组质粒的构建证明了PSMA启动子的基因转录启动与细胞PSMA的表达相关,即具有前列腺细胞特异性。     

含人P21启动子双荧光素酶基因载体的构建

目的构建带有EGFP标记含人P21启动子的双荧光素酶报告基因载体。方法从人血白细胞DNA中克隆P21启动子,用于控制firefly荧光素酶的表达;renilla荧光素酶基因和EGFP基因用IRES连接,在CMV启动子控制下表达;上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序的方法进行鉴定正确后转染至293FT细胞观察EGFP表达。结果经酶切、测序证实成功构建了带有EGFP标记的含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体,并成功表达EGFP。结论含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体成功构建,为下一步的药物筛选打下基础。     

Lipopolysaccharide induces RAW264.7 macrophageautophagy-related LC3B-GFP fluorescent aggregates formed

目的 构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程.方法 根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1 /LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布.结果 成功构建真核表达质粒pEGFP-C1 /LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果 显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加.结论 成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成.     

稳定沉默TRB3细胞模型及TRB3启动子报告基因的建立

构建人TRB3基因的shRNA真核表达载体和稳定沉默TRB3的人结肠癌细胞系HCT-8,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因,为以TRB3为靶点的药物研究提供有效的筛选平台。针对TRB3的mRNA设计寡核苷酸序列,构建TRB3-shRNA表达载体和control-shRNA阴性对照载体,宿主菌扩增,并测序鉴定。测序正确的重组质粒转染HCT-8细胞,以潮霉素筛选,分别建立稳定表达TRB3-shRNA和control-shRNA的HCT-8细胞系。通过细胞划痕-修复实验检测细胞的迁移能力。同时,通过克隆、酶切、连接、转化和扩增,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因pTRB3-Luc,转染HEK293ET细胞并给予衣霉素刺激,检测荧光素酶报告基因的活性。经测序证实,TRB3-shRNA真核表达载体构建成功,插入的DNA片段与设计序列完全一致。在建立的稳定表达TRB3-shRNA的HCT-8细胞中,TRB3的mRNA和蛋白表达水平都显著下降,细胞的迁移能力显著降低。同时,TRB3启动子区荧光素酶报告基因pTRB3-Luc构建成功,并在衣霉素诱导下呈现剂量依赖性的活性增强。TRB3-shRNA重组质粒、稳定沉默TRB3的HCT-8细胞系和TRB3启动子报告基因的建立为进一步研究TRB3在肿瘤发生发展过程中的作用以及TRB3抑制剂的筛选提供了有力的工具。     

脂多糖诱导巨噬细胞自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体的形成

目的构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程。方法根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布。结果成功构建真核表达质粒pEGFP-C1/LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加。结论成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成。     

小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列分析

目的 对小鼠酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydroxylase,TH) 启动子进行序列分析,研究启动子不同区域对下游基因表达调控能力.方法 高保真PCR分别扩增出450、1500、2000、2400、3400 bp TH启动子片段置换pcDNA3中CMV启动子,并在多克隆位点插入EGFP报告基因,重组后质粒分别瞬时转染MN-9D细胞 (TH+) 和ECV细胞 (TH-),流式细胞仪观察EGFP基因在细胞内表达情况.结果 转染后MN-9D细胞中EGFP阳性率分别为8.01%、7.97%、7.85%、7.72%、7.74%,差异无显著性.转染ECV细胞 (TH-)中,EGFP阳性率分别为6.51%、6.35%、6.71%、0.89%、1.02%.3400bp、2400 bp启动子片段在TH-细胞中调控能力受到明显抑制.结论 上述启动子片段均有调控基因表达能力,初步证明TH启动子中特异性调控区域在2400～2000 bp范围内.     

人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的：构建IPl0启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体，为研究细胞内IPl0的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具。方法：采用基因重组技术构建含IPl0启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-IPl0；用脂质体瞬时转染HEK293细胞，观察IPl0启动子对脂多糖（LPS）刺激的反应。结果：酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的；该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低，经LPS刺激后，在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论：所构建的IPl0启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的，对生理相关刺激有很好的反应，可有效地用于IPl0基因表达信号调控机制的研究。     

不同核心启动子对中国仓鼠卵巢细胞重组蛋白表达的影响

目的 探讨不同核心启动子对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞重组蛋白表达的影响.方法 以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因,分别构建以巨细胞病毒(CMV)启动子、Natural CMV启动子、超级核心启动子(SCP)2和SCP3驱动的表达载体并转染CHO细胞,根据转染表达载体的不同将细胞分为对照组、Natural C...     

AFP启动子调控增强型绿色荧光蛋白在人肝癌细胞中表达的研究

目的研究人0.3 kb的AFP启动子序列对EGFP在人肝癌细胞中表达的影响.方法通过设计含有特定酶切位点的引物,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋白启动子(AFP promoter)序列,分别构建含有AFP启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及AFP启动子序列和DTA基因的真核表达载体pAF-EGFP、pAF- DTA;将pAF- EGFP转染HepG2、SMMC-7721及NIH3T3后进行荧光强度检测.结果转染pAF-EGFP质粒细胞的EGFP表达量在HepG2细胞中明显高于SMMC-7721、NIH3T3细胞,组间差异显著(P<0.01).结论 AFP启动子可以特异性地启动它后面的目的基因在AFP阳性的细胞中高效表达.     

全长与成熟形式IL-37b的真核表达载体的构建与研究

目的构建全长与成熟形式IL-37b的真核表达载体p EGFP N1/IL-37b,检测二者在RAW 264.7细胞中的表达情况。方法以含IL-37b全长编码区基因的质粒p UBC/IL-37b为模板,构建能够表达全长与成熟形式IL-37b的真核表达载体。将构建的重组质粒p EGFP N1/IL-37b转染到RAW 264.7细胞中,通过western blot和共聚焦显微镜检测全长与成熟形式的IL-37b的表达情况,并通过real-time PCR检测全长与成熟形式IL-37b对LPS诱导的IL-6表达的抑制作用。结果构建的p EGFP N1/IL-37b转染后能够在细胞中表达全长与成熟形式的IL-37b,并且能够抑制LPS诱导的IL-6的表达。结论成功构建了全长与成熟形式IL-37b的真核表达载体,为进一步研究IL-37b的炎症抑制作用与机制打好基础。