流式细胞术不同设门方法对CD4+CD25+调节性T细胞的检测方法比较

目的 比较CD4+CD25hi、CD4+CD25+FoxP3+和CD4+CD25+CD127-/low 3种设门方法对CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)的界定效果.方法 完全随机法选择33例本院健康体检者,分别采用CD4+CD25hi、CD4+CD25+FoxP3+和CD4+CD25+CD127-/low设门的方法进行检测.结果 (1)CD4+CD25hi、CD4+CD25+FoxP3+设门方法对CD4+CD25+Treg细胞的检测结果差异无统计学意义[(6.85±2.72)%,(6.69±2.30)%,t=0.270,P=0.788],相关性检验显示,两者呈正相关(r=0.866,P＜0.001);(2)CD4+CD25+CD127-/low设门方法的细胞检测结果[(8.07±2.18)%]高于CD4+CD25hi和CD4+CD25+FoxP3+设门方法(t=2.055,P=0.043;t=2.325,P=0.022),相关性检验显示,均呈正相关(r=0.615,P＜0.001;r=0.683,P＜0.001);(3)CD4+CD25hi细胞群中FoxP3+细胞占(57.11±12.42)%,CD4+CD25hi细胞群中FoxP3+细胞占所有FoxP3+细胞的比例为(54.4±9.0)%.结论 CD4+CD25hi设门方法可用于人外周血CD4+CD25+Treg细胞的检测,CD4+CD25+CD127-/low设门方法可应用于CD4+CD25+Treg细胞的纯化.     

不同类型HBV感染者外周血Treg/Th17细胞的变化及意义

目的:探讨不同类型HBV感染者外周血中CD4+ Foxp3+ Treg/Th17细胞的变化及意义.方法:选取15例急性乙型肝炎(Acute Hepatitis B,AHB)患者、40例慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者、40例无症状携带者(Asymptomatic HBV carriers,AsC)及30例健康对照者,分别采用流式细胞术、RT-PCR和ELISA检测外周血CD4+ Foxp3+ Treg/Th17细胞百分率、核转录因子foxhead winged-helix box protein 3 (Foxp3)/retinoid-related orphan receptor gamma-t (RORγt) mRNA的表达以及血浆转化生长因子-β1(Transforming growth factor-31,TGF-β1)/IL-17的水平.结果:AHB组患者CD4+ Foxp3+ Treg/CD4+T细胞百分率、Foxp3 mRNA及TGF-β1水平与正常对照组相比无明显差异(P＞0.05);而CD4+ IL-17 +/CD4+T细胞百分率、RORγtmRNA及IL-17水平与正常对照组相比明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).CHB组患者CD4+ Foxp3+ Treg/CD4+T细胞百分率、Foxp3 mRNA、TGF-31水平及CD4+ IL-17 +/CD4+T细胞百分率、RORγt mRNA、IL-17水平与正常对照组相比均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与正常对照组相比,AsC组患者CD4+ Foxp3+ Treg/CD4+T细胞百分率、Foxp3 mR-NA、TGF-β1水平及CD4+ IL-17 +/CD4+T细胞百分率、RORγt mRNA、IL-17水平无明显差异(P＞0.05).结论:在不同类型HBV感染者外周血中Treg/Th17细胞失衡,Treg/Th17细胞可能与HBV感染的状态有关.     

成人麻疹细胞免疫与CD4+ CD25+调节性T细胞的关系

目的 了解CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)与麻疹患者细胞免疫的关系.方法 采集34例成年麻疹患者和27例健康对照的外周血,采用流式细胞术进行CD4+CD25+细胞和FoxP3+细胞的检测.用免疫磁珠从外周血单个核细胞(PBMC)分选出CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞,分别用抗-CD3单克隆抗体、BCG和NV减毒株进行刺激培养,收集培养上清,用ELISA法检测培养上清中的IFN-γ和IL-10.结果 麻疹患者外周血白细胞、淋巴细胞及CD3+CC4·细胞比例明显降低,而CD4+CD25+细胞与FoxP3+细胞的比例则与对照无显著差别;CD4+CD25+细胞明显抑制抗CD3刺激下CD4+CD25-T细胞产生IFN-γ,且患者和对照没有差别,而IL-10的产生没有这种改变.结论 成人麻疹患者的的免疫抑制与Treg的抑制作用无关. 4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞,分别用抗-CD3单克隆抗体、BCG和NV减毒株进行刺激培养,收集培养上清,用ELISA法检测培养上清中的IFN-γ和IL-10.结果 麻疹患者外周血白细胞、淋巴细胞及CD3+CC4+细胞比例明显降低,而CD4+CD2 +细胞与FoxP3+细胞的比例则与对照无显著差别;CD4+CD25+细胞明显抑制抗CD3刺激下CD4+CD25-T细胞产生IFN-γ,且患者和对照没有差别,而IL-10的产生     

CD4~+CD25~+CD127~(low)识别人外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞的优势

目的:探索可用于检测人外周血中CD4+CD25+Treg 细胞的最佳标记物.方法:以 52 名健康人和 47 名非血液系统肿瘤患者为研究对象,采用多色免疫荧光素标记和多参数流式细胞术同时检测外周血中CD4+CD25high、CD4+CD25+FoxP3+和 CD4+CD25+CD127lowT 细胞,并以经典指标CD4+CD25high 和 CD4+CD25+FoxP3+为标准,分析和比较CD4+CD25+CD127low作为识别CD4+CD25+ Treg 细胞的可行性及其优势.结果:健康人和肿瘤患者外周血 CD4+CD25high、CD4+ CD25+FoxP3+和CD4+CD25+CDl27+lowT 细胞占CD4+T 细胞百分比分别为(1.769±O.682)%和(2.958±1.392)%;(2.905±1.772)%和(5.128±2.227)%以及(5.396±1.306)%和(7.175±2.565)%.三者呈相同的趋势,即肿瘤患者组>健康人组,且三者之间呈显著正相关(P<0.05).用两种不同标记法高纯度分选CD4+ CD25high 和 CD4+CD25+CD127lowT 细胞群后,FoxP3 阳性率分别为90.9%和92.7%.结论:CD4+CD25+CD127low 三标记法可以帮助识别 CD4+CD25+Treg 和部分激活的 CD4+T 细胞,提高CD4+CD25+Treg细胞的可检出数量,并且不影响细胞活性度,是反映CD4+CD25+Treg 细胞更理想的指标.     

慢性乙型肝炎患者外周血CD4~+CD25~+Treg与CD4~+和CD8~+ T淋巴细胞亚群的相关研究

目的:探讨慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的含量和CD4+CD8+T淋巴细胞亚群分布,两者之间相关性及与HBV的相关性。方法:采用流式细胞术检测50例慢性乙型肝炎患者和20例健康对照者外周血中CD4+CD25high、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达及CD3/CD4/CD8 T淋巴细胞亚群,荧光定量PCR法检测HBV DNA含量。结果:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25highTreg明显高于健康对照组(P0.01),且随HBV DNA载量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg细胞的水平逐渐升高。慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞也相应增高,且与CD4+CD25highTreg细胞的变化成正相关(r=0.890,P0.001)。与健康对照组比较,患者组CD4+T细胞百分率及CD4+/CD8+比值均降低,而CD3+T细胞和CD8+T细胞百分率差异无显著性(P0.05)。CD4+CD25highTreg细胞与HBV DNA取对数后成正相关(r=0.782,P0.001),与谷丙转氨酶(ALT)成正相关(r=0.432,P0.005);与CD3+、CD4+、CD8+T细胞水平及CD4+/CD8+比值均无相关性(P0.05)。CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值与HBV DNA载量之间亦无相关性(P0.05)。结论:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞增高,且与HBV的复制水平及ALT增高具有一致性,而T细胞亚群是否可作为监测CHB患者免疫状态的指标需进一步探讨。     

人外周血CD39~+ FoxP3~+调节性T细胞的表型及功能特点分析

目的:了解健康人外周血CD39+ FoxP3+调节性T细胞(Treg)的表型及功能特点。方法:采集健康志愿者外周血,经密度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。采用流式细胞术检测CD39+ FoxP3+和CD39- FoxP3+两群Treg细胞CTLA-4、HLA-DR、CD45RO及Ki-67的表达水平,分别采用[3H]-胸腺嘧啶掺入法和ELISA检测其抑制PBMC增殖和IFN-γ分泌的能力。结果:按照表型不同可将Treg细胞分成CD39+ FoxP3+和CD39- FoxP3+两群细胞。发现CTLA-4、HLA-DR、CD45RO、Ki-67在CD39+ FoxP3+ Treg细胞的表达明显高于CD39- FoxP3+ Treg细胞,CD39+ FoxP3+ Treg细胞抑制PBMC增殖及IFN-γ分泌的能力明显高于CD39- FoxP3+ Treg细胞(P0.05)。结论:CD39+ FoxP3+ Treg可能是主要发挥免疫调节作用的Treg细胞群,可以作为鉴定Treg细胞的表面标志之一。     

急性冠脉综合征患者胸腺新近输出CD4~+CD25~+调节性T细胞的检测及意义

目的:探讨急性冠脉综合征患者胸腺新近输出的CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的水平及意义。方法:实验共分3组:急性冠脉综合征(ACS)组28例,稳定型心绞痛(SA)组25例和健康对照(HCs)组24例。采用CD31作为胸腺新近输出的典型标志,用磁性细胞分离器(MACS)分离各组CD4+CD25+调节性T细胞,流式细胞分析法检测各组患者外周血CD31+Treg占Treg细胞的比例,应用实时定量PCR检测CD4+CD25+调节性T细胞中T细胞受体重排删除环的数量。结果:ACS组外周血CD31+Treg/Treg比例明显低于SA组(P=0.003)和HCs组(P<0.001)。ACS组Treg细胞中TREC的数量亦明显低于SA组(P=0.001)和HCs组(P<0.001)。而SA组和HCs组间差异均无统计学意义(P=0.106和P=0.566)。患者CD31+Treg的比例与Treg细胞中TREC的数量呈正相关(r=0.493,P=0.014)。结论:急性冠状动脉综合征患者胸腺新近输出CD4+CD25+调节性T细胞减少可能是动脉粥样斑块不稳定的原因。     

炎性关节炎患者调节性T细胞亚群的变化及其对TNF-α拮抗剂治疗的反应

人外周血CD4+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的表型和功能存在异质性。本文用Foxp3和CD45RO共同标记Treg,研究强直性脊柱炎(AS)和类风湿性关节炎(RA)患者外周血Treg亚群数量以及接受TNF-α拮抗剂治疗对其亚群的改变。分别采集未经治疗的21例活动性AS患者和27例活动性RA患者的外周血。两种疾病各有14名患者接受TNF-α拮抗剂治疗40周。应用流式细胞术检测外周血Treg细胞数量。在CD4+T细胞中,活动性AS和RA患者其表型为CD45RO+Foxp3hi的效应型Treg(AS与正常对照相比,P=0.020;RA与正常对照相比,P0.001)和表型为CD45RO-Foxp3low的幼稚型Treg(AS与正常对照相比,P=0.009;RA与正常对照相比,P=0.001)细胞数量均显著下降。与正常对照相比,AS和RA患者的CD4+Foxp3+T细胞中非Treg亚群细胞(表型为CD45RO+Foxp3low)的比例显著增加(AS与正常对照相比,P=0.027;RA与正常对照相比,P0.001)。TNF-α拮抗剂治疗后,AS患者外周血中效应型Treg(P=0.025)和幼稚型Treg(P=0.005)细胞数量均增加,RA患者中仅效应型Treg细胞数量增加(P=0.003)。因此,不仅分析CD4+Foxp3+T细胞总数,而且分析其中不同表型的亚群细胞数量更有助于明确炎性关节炎的发病机制。     

子痫前期患者外周血CD8+ CD25+ FoxP3+ 调节T 细胞的变化及意义

目的:探讨外周血CD8+ CD25+ FoxP3+调节T 细胞(Treg)在子痫前期(PE)疾病过程中的作用。方法:研究对象包括子痫前期孕晚期患者46 例,其中轻度子痫24 例(MPE 组),重度子痫22 例(SPE 组),并选择24 例与患者孕龄匹配的健康孕妇作为对照组(HP 组)。流式细胞仪检测分析外周血CD8+ CD25+ FoxP3+ Treg 比例;Luminex200 检测血清IL-6、IL-17A、IL-10、IL-1β、IL-33 和TGF-β1 浓度。分离10 例健康对照者单个核细胞(PBMCs),IL-33 刺激培养后检测CD8+ CD25+ FoxP3+Treg 比例的变化。结果:MPE 和SPE 组CD8+ CD25+ FoxP3+ Treg 比例分别为[0.32(0.19-0.63)%]、[0.13(0.02-0.41)%],两组均低于HP 组[0.48(0.21-0.96)%],三组差异有统计学意义(P<0.05)。与HP 组相比,MPE 组和SPE 组血清IL-6、IL-17A浓度均升高,且SPE 组患者血清IL-6、IL-17A 浓度升高更明显,差异有统计学意义(P<0.05);IL-10、IL-1β和IL-33 浓度在HP、MPE 及SPE 三组间差异无统计学意义(P>0.05);与HP 对照者相比,MPE 和SPE 组血清TGF-β浓度均升高,差异有统计学意义(P<0.05);但MPE 和SPE 组之间差异无统计学意义(P>0.05)。PE 患者CD8+ CD25+ FoxP3+ Treg 比例与血清IL-17A 负相关(r =-0.338,P =0.021),与IL-33 正相关(r =0.548,P =0.001)。PBMCs 用IL-33 刺激5 d 后,与空白对照组相比,CD8+ CD25+FoxP3+ Treg 比例显著增高(P<0.05)。结论:子痫前期患者外周血CD8+ CD25+ FoxP3+ Treg 细胞比例降低可能在其疾病过程中发挥重要作用。     

CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞抑制肺结核患者特异细胞免疫

  目的 了解结核患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞在抑制结核患者结核特异细胞免疫反应中的作用。 方法 使用细胞分离、流式细胞分析、细胞增殖和细胞因子测定等方法,比较结核患者及健康正常人群外周血中CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞的量及功能特征的差异。 结果 结核患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞数占CD4+细胞总数的比例显著高于健康正常人群;在BCG及ESAT-6的刺激下,结核患者外周血单个核细胞增殖能力和产生γ-干扰素的能力比健康正常人群明显增强。在BCG刺激下,结核患者外周血CD4-细胞产生γ-干扰素(1289.62±519.01)及白介素-10(1045.40±534.12)的能力比结核患者外周血BPMCs细胞产生γ-干扰素(624.50±261.13)及白介素-10(377.00±249.56)的能力显著增强(均p<0.05);在BCG及ESAT-6的刺激下,结核患者外周血CD4+CD25+调节T细胞显著抑制结核患者外周血CD4+CD25-细胞产生γ-干扰素及白介素-10。 结论 结核患者CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞数量增多,抑制结核患者结核特异细胞免疫反应功能增强,可能与结核的发生、发展及转归有密切关系。     

慢性HBV感染患者肝组织内CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的表达

目的 观察慢性HBV感染患者免疫耐受期与免疫清除期肝组织中CD4+ CD25+调节性T细胞的表达及分布情况.方法 应用免疫组织化学法检测19例免疫耐受期及12例免疫清除期慢性乙型肝炎患者肝组织中FoxP3的表达,6例正常肝组织为对照.结果 FoxP3阳性信号位于淋巴细胞胞核内,阳性细胞主要聚集在汇管区,肝窦内亦可见散在单个淋巴细胞呈阳性.在免疫耐受期及免疫清除期患者肝组织中FoxP3较正常肝组织明显增加(P<0.01),免疫清除期患者肝组织内Fox P3明显高于免疫耐受期患者(P<0.01).免疫清除期患者肝组织中FoxP3阳性标记指数与ALT、HBeAg及HBV-DNA水平无明显相关性.免疫耐受期与免疫清除期两组相比,在年龄、ALT、TBIL、PTA、HBeAg及HBV-DNA水平方面差异均有统计学意义.结论 肝组织中CD4+ CD25+调节性T细胞在慢性HBV感染慢性化和抑制免疫,控制肝脏炎症反应方面可能起了重要作用.     

慢性HBV感染者调节性T细胞水平及Foxp3与CD127表达关系的研究

目的 探讨慢性HBV感染者外周血中CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋调节性T细胞（RegulatoryT,Treg）的水平,并研究其两种细胞标志--CD127分子的低表达与Foxp3转录因子表达之间的关系.方法 采集34例免疫耐受期、26例免疫清除期和31例非活动或低（非）复制期慢性HBV感染者的外周全血,用流式细胞术分析CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞和CD4^＋CD25^＋CD127^（low）T细胞的频率.结果 在慢性HBV感染者外周血中,免疫耐受组CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞和CD4^＋CD25^＋CD127^（low）T细胞的频率均比非活动或低（非）复制组高（Z=-2.693,P=0.007和t=3.251,P=0.002）;且病毒阳性组（免疫耐受组＋免疫清除组）比非活动或低（非）复制组高（t=2.266,P=0.026和t=3.208,P=0.002）;ALT异常组（免疫清除组）与ALT正常组（免疫耐受组＋非活动或低（非）复制组）之间的比较差异无统计学意义（P〉0.05）.91例病例外周血中CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞和CD4^＋CD25^＋CD127^（low）T细胞之间的表达有一致性,但两者频率的差异有统计学意义（Z=-4.718,P〈0.001）.结论 调节性T细胞在慢性HBV感染者病毒高复制组中明显升高.CD4^＋CD25^＋T细胞中CD127分子的低表达与Foxp3转录因子的表达有一致性,但前者代表Treg的频率明显高于后者.     

FoxP3：重症肌无力发病过程中的重要调控因子

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）是维持机体内稳态的重要细胞,具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特性。FoxP3是其特异性表达的转录因子,FoxP3突变或各种原因引起Treg表达FoxP3减少及／或功能下降均会导致Treg数量减少或功能缺陷,从而导致自身免疫性疾病如重症肌无力（MG）的发生。研究发现,大部分MG患者体内均在FoxP3表达减少或有Treg功能障碍,而这些都与MG的发病密切相关。随着MG发病机制研究的深入,其治疗也将进入一个崭新的时代。     

CD4~+CD25~+调节性T细胞对巨噬细胞泡沫化的影响

目的 研究CD4~+ CD25~+调节性T细胞(Tr)对巨噬细胞泡沫化过程的影响及机制.方法 磁性细胞分离器(MACS)分离CD4~+ CD25~+ T细胞及CD4~+ CD25~- T细胞,在氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)作用下,将巨噬细胞分别与CD4~+ CD25~+ T细胞、CD4~+ CD25~- T细胞共培养48 h.采用油红O染色和细胞内脂质测定的方法观察CD4~+ CD25~+ T细胞对巨噬细胞泡沫化的影响;采用RT-PCR、real-time PCR、Western blot的方法测定泡沫细胞清道夫受体(CD36和SRA)的表达.结果 与对照组比较,CD4~+ CD25~+ T细胞可显著抑制巨噬细胞脂质聚集及清道夫受体的表达.结论 CD4~+CD25~+ T细胞可显著抑制巨噬细胞泡沫化,其作用机制可能为下调清道夫受体的表达.     

类风湿关节炎患者Th17细胞与调节性T细胞失衡的研究

目的观察类风湿性关节炎（RA）患者外周血Th17细胞与CD4^＋CD25^＋FoxP3^＋调节性T细胞（Treg）平衡状态与疾病的关系,分析Th17／Treg细胞免疫失衡在RA发病机制中的作用。方法采用流式细胞仪四色荧光抗体标记法分别对47例RA患者和39名健康志愿者（HVs）进行CD3、CD8、IL-17与CD4、CD25、F0xP3标记,测定Th17与调节性T细胞的比例变化及相关细胞因子IL-6、IL-23和IL-17水平。结果RA组患者外周血中,CD3^＋CD8^＋IL-17^＋T细胞占CD3^＋T淋巴细胞的百分比为（1．12±0．38）％,明显高于对照组（0．68±0．29）％（t=1．83,P〈0．05）;CD4’CD25’FoxP3^＋细胞占CD4^＋T淋巴细胞的百分比为（2．74±0．71）％,明显低于对照组（4．69±1．23）％（t=-2．94,P〈0．05）。相关细胞因子测定结果：IL-6水平在RA组为（13．5±3．7）ng／L,正常人为（4．6±0．9）ng／L（t=6．24,P〈0．01）;IL-23水平在RA组为（71±19）ng／L,正常人为（25±6）ng／L（t=14．37,P〈0．01）;IL-17水平在RA组为（122±33）ng／L,正常人为（37±9）ng／L（t=19．01,P〈0．01）;RA患者血清IL-6、IL-23和IL-17水平均明显升高。结论RA患者外周血Th17与CD4^＋CD25^＋FoxP3^＋调节性T细胞数量的异常可能是RA发病的重要因素,IL-6和IL-23的升高是引起这些改变的可能原因。     

CD28超抗体对大鼠闭塞性气管病的治疗作用

目的:研究CD28超抗体对在体扩增调节性T细胞的效果及对大鼠闭塞性气管病的影响.方法:采用大鼠同种异体异位气管移植模型.治疗组受体移植当天经腹腔注射CD28特异性单克隆超抗体JJ316 (0.5 mg);对照组注射同型抗体mIgG (0.5 mg).于术后第7天采用流式细胞仪检测颈部淋巴结单个核细胞中CD4~+CD25~+ T细胞和CD4~+Foxp3~+ T细胞的比率;第21天取出移植气管进行病理形态学检查.结果:术后第7天CD28超抗体治疗组大鼠的颈部淋巴结中CD4~+CD25~+ T细胞及CD4~+Foxp3~+ T细胞的比率(8.5%±3.4%,11.5%±2.7%)均显著高于mIgG对照组(1.8%±1.9%,3.2%±2.1%) (P<0.05);第21天CD28超抗体治疗组较mIgG对照组气管闭塞及上皮损伤程度明显减轻.结论:CD28超抗体可靶向扩增调节性T 细胞,减轻了大鼠闭塞性气管病的管腔闭塞.