Y500R可吸收珊瑚羟基磷灰石人工骨体外成骨细胞相容性研究

目的：探讨Y500R可吸收珊瑚羟基磷灰石作为人工骨支架材料在体外的成骨效能,评价其组织相容性的优劣,为临床应用提供必要的实验依据。方法：采用酶消化法获得小鼠成骨细胞后,分为空白组、实验组和对照组。空白组为小鼠成骨细胞单独培养,实验组和对照组分别为颗粒型Y500R可吸收珊瑚羟基磷灰石、颗粒型羟基磷灰石（HA）与小鼠成骨细胞复合培养。对比小鼠成骨细胞在3组中的生长状况、形态学特征、碱性磷酸酶活性、矿化结节形成等成骨活性指标的差异,并采用扫描电镜观察、对比Y500R人工骨与角孔珊瑚在支架三维结构、孔隙率、孔径及孔的均匀度方面的差异。结果：实验组成骨细胞在成骨活性等指标方面与空白组无显著性差异。扫描电镜下可见Y500R可吸收珊瑚羟基磷灰石的断面呈多孔海绵状结构,微孔呈圆形,排列规则,与天然松质骨结构十分相似。Y500R的三维多孔结构和孔隙率与角孔珊瑚相比,结构类似,在电镜下几乎分不出差异,唯孔径比角孔珊瑚略小,但大小均匀、规则。结论：Y500R可吸收珊瑚羟基磷灰石具有良好的细胞相容性和成骨活性,复合培养不影响成骨细胞的正常生理功能,Y500R可吸收珊瑚羟基磷灰石能够满足组织工程对支架材料的要求,可作为一种新型的骨代用品。     

应用组织工程骨修复犬下颌骨缺损

目的　观察应用组织工程技术进行犬下颌骨缺损修复的临床疗效。方法　取犬骨髓基质干细胞(DMSSC)体外培养 ,并向成骨细胞定向诱导。将细胞与可吸收性珊瑚羟基鳞灰石 (Interpore 5 0 0R)复合体外温育 4～ 6h后 ,将细胞 -支架复合物填充于犬下颌骨缺损中 ,分别于术后 5 0d、10 0d观察缺损区域内新骨形成情况。结果　术后 10 0dX线片示骨缺损区域仍较周围正常骨质密度低 ,但与植入初期、中期相比较密度增强 ,局部已出现明显的阻射影 ;HE染色显示大片的新骨形成。结论　组织工程骨修复缺损应用前景良好。     

珊瑚复合人骨髓基质细胞构建组织工程骨

目的：观察人骨髓基质细胞在角孔珊瑚上立体培养后的生长情况及其在体内的成骨能力。方法：穿刺抽吸人髂骨区骨髓基质细胞，体外培养扩增、诱导后，接种于角孔珊瑚中立体培养5d，观察细胞在角孔珊瑚表面的贴附及伸展情况；将上述细胞/角孔珊瑚复合物植入体内，观察植入物在体内的成骨情况。结果：细胞可在角孔珊瑚中立体培养成活。体内植入后4周，复合物中有少量新骨形成；体内植入后8周，复合物中出现大量较成熟骨组织；而对照组4、8周均无骨组织形成。结论：穿刺抽吸的人骨髓基质细胞可作为骨组织工程的种子细胞，角孔珊瑚可作为骨组织工程的支架材料。     

兔骨髓基质干细胞自体嚼肌内移植异位成骨实验研究

目的：观察骨髓基质干细胞成骨向分化诱导后植入嚼肌内异位成骨的过程。方法：从兔髂骨分离骨髓基质干细胞,经体外诱导分化,与磷酸三钙／羟基磷灰石（tricalcium phosphate／hydroxyapatite,TCP／HA）支架复合,植入兔自体嚼肌内,形态学、免疫细胞化学、组织学观察其成骨特征。结果：体外培养的兔骨髓基质干细胞性状稳定,经矿化诱导培养的骨髓基质干细胞表现为成骨细胞分化,表达Ⅰ型胶原蛋白,与支架材料复合植入自体嚼肌内可见成熟骨组织形成。结论：利用骨髓基质干细胞为种子细胞植入嚼肌内开展功能性组织工程化颌骨移植方法可行。     

脂肪干细胞矿化中富血小板血浆的诱导作用及其在支架上附着增殖的研究

目的:观察Beagle犬脂肪干细胞在向成骨细胞分化的过程中富血小板血浆(platelet-richplasma,PRP)的诱导作用及其在纳米羟基磷灰石-胶原支架上的附着增殖情况.方法:酶消化法获得脂肪干细胞,分别采用含100mL/L FBS的DMEM培养液、常规成骨细胞诱导液和添加PRP的成骨细胞诱导液培养脂肪干细胞,21 d后经Von Kossa染色,观察PRP对脂肪干细胞向成骨细胞分化的诱导作用;并将脂肪干细胞与纳米羟基磷灰石-胶原共培养7d,环境扫描电镜观察细胞在支架材料上的附着情况.结果:与其他两组相比,脂肪干细胞在PRP的作用下,能生成更多的钙化结节,钙化结节细小致密,复层生长更加日月显,而且脂肪干细胞能在支架材料上充分的附着伸展.结论:脂肪干细胞是良好的牙周组织工程种子细胞,PRP具有细胞因子诱导脂肪干细胞向成骨细胞的分化和增殖,纳米羟基磷灰石-胶原可以做为牙周组织工程良好的支架材料.     

hBMP-7基因修饰犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石修复下颌骨缺损

目的:构建携带人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因的重组腺病毒载体,体外转染犬骨髓基质干细胞(dMSCs)复合珊瑚羟基磷灰石(coral hydroxyapatite, CHA),观察其修复下颌骨缺损的效果。方法:利用AdEasy腺病毒表达系统,体外构建高效表达hBMP-7重组腺病毒载体,转染dMSCs 与珊瑚羟基磷灰石支架材料复合,再分别植入取材动物的自体下颌骨缺损区,分别于4周和8周取材观察成骨情况。结果:大体观察、X线检查及组织学观察均发现构建组织工程骨在祼鼠皮下及骨缺损处均有明显新骨组织形成。结论:构建携带人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因的重组腺病毒载体,体外转染dMSCs后复合珊瑚羟基磷灰石有较多量骨组织形成,可有效修复下颌骨缺损。[关键词] 人骨形态发生蛋白7 骨髓基质干细胞 腺病毒 组织工程     

Bio-Oss胶原结合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:研究Bio-Oss胶原作为骨组织工程支架材料的可行性。方法:抽取成年小型猪骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞(BMSCs),经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况,并进行I型胶原、骨钙素的免疫细胞化学检测。将培养的第3代细胞接种于Bio-Oss胶原,进行超微结构观察,并将Bio-Oss胶原/BMSCs复合物植入裸鼠背部皮下,4、8周后进行组织学检测。结果:当接种密度为0.8×106/ml时,细胞与支架材料之间有最大附着量;VonKossa染色可见钙结节形成;I型胶原、骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示,8周时复合物内有新骨形成。结论:Bio-Oss胶原/BMSCs复合物显示成骨活性,Bio-Oss胶原可用作骨组织工程支架材料。     

犬骨髓基质细胞复合nHAC/CSH裸鼠皮下成骨的实验研究

目的：评价纳米晶羟基磷灰石/胶原/硫酸钙(nHAC/CSH)—犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)复合物体内异位成骨能力。方法：犬骨髓基质细胞(dBMSCs)通过密度梯度离心法分离得到,与nHAC/CSH复合,构建可注射骨,扫描电镜观察细胞生长情况,并将构建的可注射组织工程骨植入裸鼠体内,4周后行HE染色观察异位骨形成情况。结果：扫描电镜观察细胞生长良好,体内研究表明,可注射组织工程骨植入裸鼠皮下4周后有类骨样结构形成。结论：nHAC/CSH复合BMSCs具有良好的成骨活性。     

松质骨支架与成骨细胞生物相容性的实验研究

目的：观察松质骨支架对成骨细胞的粘附、生长、增殖的影响,为骨组织工程支架的选择提供实验依据.方法：采用Ficoll梯度离心法得到兔骨髓基质干细胞,经诱导培养为成骨细胞并通过相差显微镜观察、Ⅰ型胶原免疫组化法染色、四环素染色确认为成骨细胞;采用物理化学方法对猪松质骨进行处理得到猪松质骨支架,与成骨细胞体外复合培养,通过扫描电镜观察猪松骨材料对成骨细胞生长、粘附的影响.结果：骨髓基质干细胞经条件培养基诱导培养后已分化为成骨细胞,与松质骨支架联合培养1d后可见细胞附着于材料表面,但数量不多,细胞呈圆球形,7d后细胞生长密集,似葡萄状粘附于脱矿猪松质骨的孔壁上,细胞呈不规则圆球形,表面有丰富的绒毛状突起,细胞间有伪足样突起相连但分布不均.细胞相互融合,可见细胞遮盖微孔间隙.结论：松质骨材料具有良好的细胞相容性,可用作骨组织工程的支架材料.     

富血小板血浆和纳米羟基磷灰石胶原支架对人脂肪干细胞成骨分化的影响

目的:观察人脂肪干细胞在向成骨细胞分化过程中富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)的作用,及其与支架材料纳米羟基磷灰石/胶原生物相容性的实验研究.方法: 酶消化法获得脂肪干细胞,分别培养在含100 ml/L FBS的DMEM培养液、成骨细胞诱导液和添加PRP的成骨细胞诱导液中,观察PRP对人脂肪干细胞向成骨细胞分化的影响.并将人脂肪干细胞与经PRP孵育的纳米羟基磷灰石/胶原复合培养7 d后,环境扫描电镜观察细胞在支架材料上附着增殖情况.结果:酶消化法能成功获得人脂肪干细胞,在PRP的作用下,脂肪干细胞能够更加有效的向成骨细胞分化,形成更多的钙化结节,结节细小致密.环境扫描电镜观察,脂肪干细胞能在支架上充分的附着伸展.结论:人脂肪干细胞的成功分离诱导分化,为牙周组织工程提供了新的种子细胞来源,PRP是促进该细胞成骨细胞分化的有效的细胞因子组合,纳米羟基磷灰石/胶原可以作为牙周组织工程的支架材料.     

人髁突骨髓间充质干细胞体内成骨的实验研究

目的 探讨人髁突来源骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)体内分化成骨的能力,为构建组织工程髁突提供种子细胞.方法取切除的人髁突冲洗收集骨髓细胞,采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化BMSC,取第3或4代BMSC进行成骨细胞和成软骨细胞诱导分化后接种于珊瑚骨支架表面,扫描电镜观察细胞在支架表面的黏附和增殖状况.将成骨或成软骨细胞-珊瑚骨支架植入裸鼠背部皮下,6和9周后观察体内成骨和成软骨情况.结果 培养3～7d后扫描电镜显示细胞黏附于珊瑚骨支架表面,呈多层生长,并跨越微孔连成网状或片状;植入裸鼠体内9周,髁突形珊瑚骨支架均基本维持最初的形态,可见散在或片状的新生骨形成,新生软骨呈岛状分布.结论从人髁突骨髓中分离出的BMSC具有体内形成新骨和软骨组织的能力,可作为构建组织工程髁突的种子细胞.     

Calvarial reconstruction in baboons with porous hydroxyapatite.

The growth of bone into porous hydroxyapatite implanted in nonhealing calvarial defects of adult baboons is evaluated. Seventy-two anterior and posterior calvarial defects, 25 mm in diameter, were prepared in 24 adult male baboons (Papio ursinus). In each animal, one defect was implanted with a disc of porous hydroxyapatite obtained after hydrothermal conversion of the calcium carbonate exoskeleton of coral (genus Goniopora); pores averaged 600 microns in diameter, pore interconnections averaged 260 microns in diameter, and the void fraction was 70% (Interpore 500). Another defect was grafted with autogenous corticocancellous bone harvested from the iliac crest. The third defect was left ungrafted and used as a control. Histology and histomorphometry on nondecalcified and decalcified sections prepared from specimens harvested at 3, 6, and 9 months after surgery showed that substantial bone growth had occurred in the hydroxyapatite implants (p < 0.01 vs bone grafts at 3 mos), culminating in complete penetration of bone within the tridimensional porous spaces. Anterior untreated defects showed greater amounts of bone when compared to posterior defects. The extent of bone growth in hydroxyapatite implants, however, appeared to be independent of the site of surgical implantation. This finding suggests that bone deposition within the porous spaces was a function of the implanted matrix rather than the healing potential of specific regions within the calvaria. Of concern was the presence of nonunions at the hydroxyapatite/calvarial interfaces, despite the often extensive bone deposition within the center of the hydroxyapatite implants. Further studies are required to identify the reasons for nonunion and to evaluate the mechanical performance of the bone-porous matrix complex.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

骨髓基质干细胞与不同支架材料复合异位成骨能力的实验研究

目的:研究骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)与不同支架材料复合后的异位成骨能力。方法:将体外诱导培养的成年犬骨髓基质干细胞,以1×106/cm2的密度接种到冻干骨基质(fdDBM)、磷酸三钙(TCP)、孔径分别为200μm及500μm的珊瑚羟磷灰石(CH200、CH500)等支架材料上,分别于体外培养的第4￣7天进行扫描电镜及石蜡切片HE染色,了解细胞在不同支架上的黏附及生长情况,并于1周后将大小为10mm×5mm×2mm的上述细胞支架复合物(fdDBM、TCP、CH200、CH500)分别植入裸鼠(n=8)背部皮下,每只裸鼠均植入4个实验组及1组无细胞的fdDBM空白支架对照组。9周后,取材行石蜡切片及HE染色,以IMAGER-PROPLUS软件测量每组的新生骨小梁量,并采用SAS软件包行单因素方差分析。结果:犬BMSCs与4种支架材料均黏附良好,TCP、CH200及CH5003组各样本均能观察到新骨形成,fdDBM及fdDBM空白对照组分别有75%、25%的样本有新骨形成;其中,TCP组的TBV值(28.2%±2.86%)显著高于CH200组(24.1%±4.12%)及CH500组(18.1%±4.66%)(P<0.01)。结论:BMSCs与4种材料的相容性良好。TCP与BMSCs复合后异位成骨效果显著,是很有希望的骨组织工程支架材料。     

bFGF基因转染的骨髓间充质干细胞在珊瑚骨表面的生长特性

目的：将转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞（BMSCs）与珊瑚骨复合培养，观察转染bFGF基因的BMSCs在珊瑚支架材料上的生长状况。方法：穿刺抽取新西兰大白兔胫骨骨髓，采用密度梯度离心法分离BMSCs．采用贴壁筛选法对分离出的BMSCs进行纯化，利用脂质体转染bFGF—pcDNA3到BMSCs。取生长良好的转染bFGF基因的BMSCs和未转染的BMSCs，分别接种于不同珊瑚表面，利用扫描电镜观察珊瑚支架上BMSCs的生长状况：采用MTT法观察细胞一支架复合培养的BMSCs增殖情况，采用SPSS10．0软件包对数据进行t检验。结果：扫描电镜观察显示．复合培养的BMSCs贴附在珊瑚上，并在材料上完全铺展，形态多样，细胞跨越微孔表面或向孔内长人，部分区域有细胞外基质形成。MTT法检测显示，细胞-支架复合培养转染组与复合培养未转染组的BMSCs增殖状况相比有统计学差异（P〈0．05），复合培养转染组，BMSCs生长增殖强于未转染组。而复合培养的转染组与单纯培养转染组BMSCs增殖相比无统计学差异（P〉0．05）。结论：转染bFGF基因的BMSCs在珊瑚支架材料上的生长状况较未转染组好，珊瑚人工骨可以作为BMSCs支架材料，用于构建组织工程骨。     

Bone reaction to subperiosteally implanted hydroxyapatite/collagen/glycosaminoglycans and coral in the guinea pig

Tissue reactions and new bone formation at 30, 60, and 90 days after the subperiosteal implantation of hydroxyapatite/collagen/glycosaminoglycans and blocks of coral in 18 guinea pigs were evaluated histologically with the use of polarized light and light microscopy. Animals implanted with coral showed new bone formation at each time interval and resorption of coral was observed. Histopathologic evaluation of hydroxyapatite/collagen/glycosaminoglycans implants revealed no evidence of new bone formation and the hydroxyapatite particles were surrounded by fibrous connective tissue.     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。