果蝇神经特异性拼接因子Dxl6N变体在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

目的：表达与纯化果蝇中SR蛋白家族新成员Dxl6N端变体。方法：用PCR方法扩增得到Dxl6N端基因片段，经酶切亚克隆至pGEX-4T-1原核表达栽体。在大肠杆菌BL21（DE3）中与GST融合表达。并用谷胱甘肽-sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白。结果：表达产物以可溶形式经亲和层析柱纯化后获得相对分子质量约为37000的融合蛋白。结论：成功克隆、表达并纯化了果蝇神经特异性拼接因子Dxl6N端变体与GST的融合蛋白。     

人源Parkin蛋白在大肠杆菌BL-21(DE3)中的异源表达和纯化

目的 在大肠杆菌中异源表达和纯化人源Parkin蛋白.方法 构建带有人源Parkin基因的克隆载体,测序保证Parkin基因序列正确后,构建异源表达载体pET-28a/Parkin;在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导人源Parkin蛋白过表达,采用镍亲和色谱纯化人源Parkin蛋白,用West...     

SHV-4型ESBL在pET26b/BL(DE3)中的表达纯化及其特性研究

目的:表达SHV-4型超广谱β-内酰胺酶,对纯化的SHY-4酶进行特性研究.方法:将SHV-4基因克隆到pET26b表达质粒,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)构建工程菌,重组工程菌经摇瓶发酵后获得种子菌,种子菌转入发酵罐发酵,当菌体密度OD600为0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,于37℃培养6 h.培养液离心收获菌体沉淀,其超声裂解上清液进行Ni2 亲和层析,获取的SHV-4酶进行分子量、纯度、等电点、最适条件、米氏常数、催化常数等特性进行分析.结果:SDS-PAGE电泳,等电聚焦电泳及系列的酶动力学实验表明SHV-4酶分子量约为30 kD,纯度大于95%,等电点为7.9,最适pH值为6.0～8.0,最适温度为37℃,以头孢硝噻吩为底物测定的Km值为2.61×10-6 mol/L,Kcat为258 s,Kcat/Km为9.88×107 mol-1·s-1·vL.结论:重组的SHV-4酶初步满足制成商品酶的条件.     

人全长TALL-1在大肠杆菌中的表达

目的在克隆人TALL-1(TNF- and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand 1)全长 cDNA的基础上,用大肠杆菌进行表达并鉴定其生物学活性.方法采用RT-PCR技术,从HL-60细胞中扩增编码人TALL-1的cDNA,克隆于高效原核表达载体pQE-80L中,以IPTG诱导表达,Ni-NTA层析纯化后,进行生物学活性检测.结果 RT-PCR扩增得到了858 bp的DNA片段,测序结果与GenBank中报道的编码TALL-1的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中获得了高效表达,活性检测发现它能抑制U937细胞的生长.结论成功克隆了人TALL-1全长cDNA,并获得了高效表达及纯化,纯化产物具有生物学活性,这为进一步的功能研究及临床应用奠定了基础.     

岸蟹金属硫蛋白在大肠杆菌BL21中的表达

目的：在大肠杆菌BL21中表达岸蟹金属硫蛋白基因，建立金属硫蛋白原核表达的流程。方法：将重组质粒pET-GST-R转化至大肠杆菌，经PCR扩增和酶切检测，得到含重组质粒pET-GST-R的工程菌。结果：从IPTG浓度、IPTG诱导时间、金属离子浓度等几个方面摸索诱导金属硫蛋白表达的条件，表达出分子量约为33kD的融合蛋白。结论：成功制备金属硫蛋白的工程菌菌株。金属硫蛋白对大肠杆菌细胞毒性很大，培养基需添加金属离子。     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42 500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

重组人白血病抑制因子在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达并制备重组人源白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)。方法:构建p ET-30a-rh LIF表达载体并转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)之中,IPTG诱导使无标签的目的蛋白呈可溶性表达,继而利用三步柱层析纯化目的蛋白。最后对所获目的蛋白活性进行测定,并对其N端和C端的完整性分别应用Edman测序法以及质谱法进行鉴定。结果:通过三步柱层析以及中间的内毒素去除步骤可使无标签rh LIF获得纯化,检测结果提示所获目的蛋白内毒素水平<1 EU/μg,其活性同市售商品化LIF产品一致,Edman测序结果提示少部分目的蛋白N端存在甲硫氨酸修饰,质谱检测结果表明所获目的蛋白C端完整性较好。结论:建立了一种新的重组人源白血病抑制因子表达和纯化的方法,本方法不需利用标签蛋白,并可有效降低所获蛋白中内毒素水平,所获rh LIF蛋白可用于干细胞培养以及相关生物学研究。     

Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达

目的;在大肠杆菌宿主系统中表达Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基因编码的蛋白。方法：用ＰＣＲ方法从质粒中扩增出Ｔｒｏｐｉｃ１８０８ｃＤＮＡ开放阅读框架片段,并重组人表达载体ｐＥＴ－２１ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导Ｔｒｏｐｉｃ１８０８融合蛋白的表达,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,表达蛋白条带转至ＰＶＤＦ膜进行氨基酸序列分析,结果：构建了ｐＥＴ－２１ａ－１８０８重组质粒,外源性Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

Caspase 3在大肠杆菌E.coli BL21中表达和活性的研究

目的：研究凋亡蛋白酶Caspase 3在大肠杆菌中的表达及活性. 方法：用PCR法扩增出Caspase 3基因cDNA,然后插入pCMV-Myc载体,扩增后克隆至表达载体pGEX-6p,使用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导Caspase 3蛋白的表达;应用SDS-PAGE和Western blot法鉴定其性质. 结果：经测定诱导3h后Caspase 3活性最高. 结论：可在大肠杆菌E.coli BL21中诱导表达出有活性的Caspase 3,为研究其在细胞凋亡中的作用奠定了基础.     

质粒pGH/BL21在大肠杆菌中表达条件的研究

目的 寻找质粒pGH／BL21在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法 当它在大肠杆菌中表达时，考查不同IPTG诱导浓度及不同的诱导时间对表达产物的影响，表达产物的量以SDS—PAGE电泳方法分析。结果 该基因的最佳表达条件为：IPTG诱导浓度1．0mmol／L，诱导时间4h。结论 IPTG对不同的基因在不同的表达体系中需不同的诱导条件，只有找到它的最佳诱导条件才能保证终产物的最大产率。     

正交试验设计优化重组蛋白溶细胞毒素的表达

目的:对创伤弧菌溶细胞毒素融合蛋白表达条件进行优化,从而获得高效稳定的溶细胞毒素(Vibrio vulnificus Hemolysin,VVH)原核表达系统。方法:质粒pGEX-4T-1-vvh转化E.coli BL21/DE3后,针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素:诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计,对结果进行直观分析及方差分析。并对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果:直观分析表明诱导时间的R值最大,其次为摇菌转速和诱导剂IPTG浓度,诱导温度的R值最小;方差分析表明诱导时间的P<0.05,而转速、温度及IPTG浓度的P均>0.05。结论:诱导时间为主要因素(其为4h,表达水平最高),其次为摇菌转速、诱导剂IPTG浓度和诱导温度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数为250r/min、诱导时间4h、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在此诱导条件下,溶细胞毒素的表达量达到了55.31%。     

固定化E.coli BL21(pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽

分别以卡拉胶、明胶、海藻酸钠包埋E.coli BL21 (pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽(GSH).从酶活收率及机械强度方面进行比较,选择卡拉胶为包埋载体,其最适pH为7.0,最适温度为40°C.相关物质对GSH的合成均有影响半胱氨酸、甘氨酸的最适浓度为20mmol/L,谷氨酸的最适浓度为60mmol/L;Mg2+/ATP为1～5(V/V)较合适;腺苷二磷酸(ADP)浓度为5mmol/L时对酶活的抑制为20%.优化条件下罐式反应器中GSH的产量为0.84g/L,操作稳定性较好;延迟加入甘氨酸时GSH产量可提高17.5%;与酵母生产ATP体系相耦联的共固定化体系在填充床中反应,GSH合成量达1.24g/L,收率比直接加入ATP提高24.2%.     

质粒pGH/BL_(21)在大肠杆菌中表达条件的研究

目的　寻找质粒 pGH/BL2 1在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法　当它在大肠杆菌中表达时 ,考查不同IPTG诱导浓度及不同的诱导时间对表达产物的影响 ,表达产物的量以SDS -PAGE电泳方法分析。结果　该基因的最佳表达条件为 :IPTG诱导浓度 1.0mmol/L ,诱导时间 4h。结论　IPTG对不同的基因在不同的表达体系中需不同的诱导条件 ,只有找到它的最佳诱导条件才能保证终产物的最大产率     

GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 获得融合TAT短肽的融合蛋白GST—TAT-GFP，以用于阐明TAT短肽的跨膜递送机理。方法 以质粒pGEX—GFP为模板，扩增目的基因TAT—GFP，将其克隆至质粒pGEX-2T，用所构建的质粒pGEX—TAT—GFP转化大肠杆菌BL21并诱导表达，利用GS-4B亲和柱进行纯化，所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及细胞跨膜实验鉴定。结果 大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约54．3kD的蛋白，其相对分子质量与GST—TAT-GFP融合蛋白相符；Western blot显示该融合蛋白能够被抗GFP的抗体特异性识别；细胞实验表明融合TAT短肽的融合蛋白能跨膜进入细胞L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402。结论 在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST—TAT—GFP融合蛋白。     

重组人IL2-MUCl融合蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的:构建表达人IL2-MUCI融合蛋白的工程菌,为制备新型MUCI疫苗提供实验依据.方法:通过PCR方法钓取人IL-2基因片段,将其克隆入pBS-SK-MUCI重组载体中,再将人IL2-M-UCI串联基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-I.将重组的pGEX-IL2-MUCI转化大肠杆菌BL-21,通过IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白.结果:经酶切及基因测序证实获得的IL-2基因片段402 bp及IL2-MUCI基因片段852 bp基因序列正确;构建的pGEX-IL2-MUCI表达载体在BL21大肠杆菌中成功表达GST-IL2-MUCI蛋白,经SDS-PAGE证实其相对分子质量为64 000,与理论预期值相符.Western blotting分析表明该表达产物与抗人MUCI多克隆抗体及抗人IL-2单克隆抗体均具有特异性结合能力.结论:成功构建表达人IL2-MUCl融合蛋白的工程菌,为进一步研究以人MUCI为靶点的新型抗肿瘤疫苗奠定基础.