Sj31与鼠IFN-γ基因融合DNA疫苗免疫保护效果的研究

目的构建表达mIFN-γ与Sj31抗原融合蛋白的DNA疫苗,并探讨其免疫保护作用。方法在Sj31基因上游引物与mIFN-γ下游引物的5’分别设计与克隆载体相匹配的酶切位点,在mIFN-γ上游引物与Sj31基因下游引物的5’设计相同的酶切位点。分别进行PCR扩增,再通过引物的5’端相同的酶切位点进行2个PCR产物的酶切与连接,以连接产物为模板,应用Sj31的上游引物和mIFN-γ下游引物进行PCR扩增,将此次PCR产物经常规方法克隆入载体pcDNA3.0(简称为pc),构建成多价DNA疫苗pc-Sj31-mIFN-γ。对重组质粒鉴定后,大量制备纯化质粒免疫昆明小鼠,48只小鼠分为A、B、C、D4组,对照组的小鼠于股四头肌注射质粒pcDNA3.0100μg,3个免疫组的小鼠分别注射pc-Sj31、pc-mIFN-γ和pc-Sj31-mIFN-γ质粒DNA各100μg。在0、2、6周免疫共3次,第3次免疫后2周,每只小鼠经腹部贴片感染尾蚴40±1条,感染后第42天剖杀,计数各小鼠检获成虫数及肝卵数。结果pc-Sj31-mIFN-γ(D组)免疫组的减虫率和肝组织减卵率分别为28.56%和60.20%,但是表达鼠mIFN-γ与Sj31抗原融合蛋白的DNA疫苗并未明显优于单纯表达日本血吸虫组织蛋白酶B(Sj31)DNA疫苗的免疫保护作用。结论pc-Sj31-mIFN-γ多价DNA疫苗构建成功,但其诱导小鼠抗血吸虫病免疫保护效果不明显优于pc-Sj31。     

人白细胞介素12两个亚基基因p35、p40拼接的新方法

目的: 探讨人白细胞介素12(IL-12)两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接的新方法。为进一步研究IL-12基因的生物学功能以及应用提供实验基础。方法：采用两个牛弹性蛋白基序（10个氨基酸）的基因序列为两个亚基基因拼接的连接肽基因。根据人IL-12 p35、p40两个亚基基因片段以及连接肽基因核苷酸序列设计引物,其中p40基因下游引物包括部分连接肽基因序列以及Kpn Ⅰ 酶切位点,p35基因上游引物包括部分连接肽基因序列以及Kpn Ⅰ 酶切位点。通过聚合酶链反应(PCR)方法分别获得人IL-12 p35与p40基因片段。利用Kpn Ⅰ内切酶对p35与p40基因的PCR产物进行酶切,酶切产物回收后利用T4 DNA连接酶进行连接,应用p40基因上游引物与p35基因下游引物对连接产物进行PCR扩增。利用Kpn Ⅰ内切酶对连接产物进行酶切鉴定。将扩增的连接产物克隆入T载体,挑选阳性克隆并进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行拼接产物的核苷酸序列测序。结果：通过PCR分别获得约1 000 bp大小的p40基因片段与600 bp大小的p35基因片段,两个基因酶切片段连接后PCR扩增获得1 600 bp左右的拼接产物,采用Kpn I 内切酶对拼接产物进行酶切后获得约1 000和600 bp大小的基因片段,分别与p40和p35基因片段大小一致。拼接产物的T载体经酶切鉴定可见1 600 bp 大小的酶切产物,拼接产物测序结果与GenBank核酸数据库上的p40基因、p35基因以及连接肽基因核苷酸序列完全一致。结论：利用该基因分子拼接技术成功地将人白介素12两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接。建立了一种简单、方便、有效进行人白细胞介素12两个亚基基因拼接的新方法,为进一步研究IL-12的生物学功能以及基因治疗提供实验基础。     

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒tat基因重组慢病毒表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因重组慢病毒表达载体。方法将pCDH-GFP和pCDHRFP载体分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切制备线性化载体;通过设计引物及PCR扩增,获得5′端与3′端分别与15nt线性化载体3′端与5′端互补的tat基因片段;tat基因片段和线性化载体经纯化后,进行重组反应;将重组产物转化感受态细胞DH5α,通过菌落PCR、质粒双酶切、序列测定等方法鉴定重组克隆。结果菌落PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,在约354bp位置出现预期的条带;EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒经琼脂糖凝胶电泳,在约7544bp和354bp位置上出现预期条带;通过测序,重组质粒中插入的tat基因序列与GenBank基因库中的HIV-1tat基因序列同源。结论采用本研究方法能成功构建HIV-1tat基因重组慢病毒表达载体。     

含自杀基因酵母菌Fcy::Fur融合基因重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定含自杀基因酵母菌Fcy：：Fur融合基因的重组逆转录病毒表达载体，拟将用于肿瘤的基因治疗研究。方法：设计一对PCR引物，在引物的5′端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pORF5-Fcy：：Fur为模板，采用常规PCR方法扩增Fcy：：Fur融合基因，并将其分别克隆进测序载体PCS2^ 及原核表达载体pGEX-6p-1进一步进行核酸序列测定和原核诱导表达研究。用EcoRⅠ和BamHⅠ将Fcy：：Fur融合基因从测序载体上切出，按正确阅读框架克隆进pLXSN中，重组子鉴定采用PCR法和酶切消化。结果：序列测定表明，扩增的基因即为Fcy：：Fur序列．Fcy：：Fur融合基因在大肠杆菌中获得了融合表达；重组逆转录病毒表达载体经PCR及双酶切鉴定表明：Fcy：：Fur以正确方向插入到pLXSN中。结论：成功构建含有自杀基因Fcy：：Fur的逆转录病毒表达载体，为进一步进行肿瘤实验性基因治疗奠定基础。     

PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒

目的:将PCR扩增产物人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)cDNA定向克隆到载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以构建重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。方法:在扩增目的基因的PCR引物5′端加上与线性化载体同源的15个碱基,使PCR反应产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。EcoRⅠ酶切质粒pHCM-Vsp1A-heNOS,回收heNOS cDNA作为模板,进行PCR扩增。将纯化的PCR产物heNOS cDNA与EcoR V酶切后的线性化载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以摩尔数为8∶1比例混和,在重组酶作用下,25℃反应30 min,将PCR产物定向克隆入目标载体pShuttle-IRES-hrGFP-2上,获得阳性重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定。结果:经鉴定,成功构建出重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。结论:无需传统的酶切、连接、载体去磷酸化等手段,利用PCR产物靶向克隆法,可快速、高效完成PCR产物的定向克隆。     

T-载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用

目的　探讨克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增产物的简便方法。方法　用PCR方法分别特异性扩增Wilms瘤基因wt1和尿激酶受体 (UPAR)基因 ,并利用Taq聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入T -载体 ,EcoRⅠ酶切鉴定阳性重组子。结果　设计的引物可分别扩增wt1基因锌指区 (34 3bp)和UPAR基因编码区全长 (10 83bp) ;未经修饰的常规PCR和高保真PCR扩增产物可被直接克隆入pGEM -TEasy载体 ,其中正确重组率为 6 2 .5 %～ 87.5 % ;克隆的wt1基因和UPAR基因已被成功用于竞争性PCR或表达。结论　T -载体法是克隆PCR产物通用而有效的方法。     

用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段

目的：分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法：采用PANHANDLE PCR，以基因组DNA为模板，通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构，经嵌套式PCR扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物，PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列，采用限制性内切酶BamH Ⅰ消化卡地腐霉基因组DNA，经去磷酸化处理后，在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA，经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。结果：获得一大小为876bp的PCR产物，经序列分析验证，该panhandle PCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论：这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片段两侧的未知基因片段。     

唾液富组蛋白5克隆载体的构建

目的将唾液富组蛋白5(histatin5)的cDNA克隆至T载体,获取大量酶切后的目的片段。方法选用大肠杆菌偏爱密码子编码histatin 5氨基酸,设计5′端带酶切位点、3′端互补的两条引物,通过overlap PCR获取histatin 5的cDNA,将cDNA与T载体连接后转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,PCR、酶切、测序鉴定。酶切重组T载体,获取目的片段。结果Histatin 5的cDNA正确克隆至T载体,无突变。结论克隆载体构建成功,有利于目的片段的酶切和回收。     

艰难梭菌毒素基因3′末端重复区域基因片段的PCR克隆

目的 探寻一种简单，快速，灵敏的检测艰难梭菌的方法。方法 以艰难梭菌毒素A和毒素B基因3′末端高度保守重复区分别设计一对引物。进行PCR反应，同时在同一体系相同反应条件下使用相同引物分别以大肠杆菌和乳杆菌DNA为模板进行扩增，比较二者结果。结果 从艰难梭菌成功克隆了毒素A基因3′端重复区域960bp的基因片段及毒素B基因3′端重复区域1851bp的基因片段，不同来源的菌株出现了相同的2条电泳带。并通过测序鉴定；而对照的大肠杆菌和乳杆菌株无特异电泳带出现。结论 从艰难梭菌毒素A，毒素B基因3′末端重复区域克隆的基因片段具有保守性，可以作为基因探针在临床上进行艰难梭菌检测，该方法简便，灵敏，可直接用粪便标本进行检测，此外，这些基因编码的多肽具有较高的疏水性并存在着膜受体结合区域，可以此为基础进行基因工程蛋白质疫苗的研究。     

用重组PCR技术缺失突变人单核细胞趋化蛋白-1基因

目的：用重组PCR技术对人单核细胞趋化蛋白-1(hμMCP-1)基因cDNA进行缺失突变，构建其突变体-7NDcDNA。方法：根据hμMCP-1基因缺失突变前后的两段基因分别设计两对含有酶切位点的引物，以pBluescdpt-hμMCP-1为模板，进行重组PCR反应，将PCR产物与T载体连接进行TA克隆，酶切鉴定并测序确定其长度为342bp，继之将目的基因克隆入pcDNA3．1真核表达载体。结果：成功构建hμMCP-1cDNA突变体-7ND的真核细胞表达载体，测序结果表明，该突变体N端第2至8位氨基酸缺失。结论：重组PCR技术是十分有效、可靠的基因缺失突变方法。     

完善病案复印 改善医患关系

《医疗机构病历管理规定》存在一些未详细说明的问题，如什么是有效身份证明，什么年份的病案可以复印等？这不仅影响医院为患者提供病历复印工作，更影响和谐医患关系，造成医患关系紧张；因此，一方面要完善《医疗机构病历管理规定》，另一方面，医院应利用出院记录等医疗文件进行详尽的告知义务，同时，应将住院检验、影像报告单一式两份，一份贴于病案中，一份直接给病人，这样能极大的方便患者，改善医患关系。     

病案信息管理发展趋势

目的探索病案信息管理未来发展方向。方法将病案信息管理过程中所涉及的问题进行分析。结果病案信息管理在医疗、教学、科研、医院管理、医疗保险、法律等起着举足轻重的作用。结论病案信息管理发生显著的变化,向数字化、高智能化的电子病案方向发展。     

加强病历书写的质量监控确保病案质量

目的针对住院病案缺陷的常见原因，提出解决方法。方法对2007年上半年出院病案进行质量检查。结果抽查病历924份，病历缺陷924份，共2540项次。结论加强医师的法制观念，加强责任感，强化基本功讪练，实行病案质量四级监控，杜绝缺陷病案归档上架，确保病案质量。     

学习环境中的气味与记忆成绩相关性研究

目的探索学习环境中的气味,单独或同时出现于编码与提取过程中,其对短时记忆储存的影响。方法设计两个试验:试验一,将被试随机分为气味组、想象组、控制组,在有桂花香气味、想象气味、没有也不想象气味的学习环境中分别测验被试的整体回忆成绩和相关词汇的回忆量,并进行统计学处理。试验二,气味为愉快气味和不愉快气味2种,试验是3个被试间设计(学习时伴随气味:愉快的,不愉快的,无气味×3;回忆时伴随气味:愉快的,不愉快的、无气味×3)。试验分两次进行,间隔24h,然后进行统计学处理。结果试验一,气味组的整体回忆成绩(12.500±3.117)个高于想象组(9.571±2.387)个和控制组(7.625±5.225)个,变差分析显示3组间差异有显著性(P<0.05),想象组成绩低于气味组,但高于控制组。试验二,在学习中呈现气味和回忆中呈现气味之间有着显著的相互作用(P<0.05);但对气味呈现于测验(回忆)中则无显著影响(P>0.05)。均数逐对检验亦发现A1B1、A2B1、A2B3三个组的均数与其余各组(除A2B2组外)都差异有显著或非常显著;A2B2组只与A3B1组差异有显著性。结论1.学习和回忆时,如果呈现同一种愉快气味,那么会产生记忆的增益(提高)现象,愉快气味可以认为是一种有效的记忆提取线索;2.学习时,如果呈现一种不愉快气味,那么回忆时不管有否气味,都会产生记忆的增益(提高)现象。     

肠内营养支持对胎儿宫内发育迟缓的疗效

目的探讨肠内营养支持对胎儿宫内发育迟缓（IUGR）治疗效果,以及妊娠期长时间应用肠内营养支持的可行性和安全性。方法胎儿宫内发育迟缓孕妇48例,随机分为观察组和对照组,每组24例,对照组给予相应胎龄所需热量的饮食,观察组除给予对照组的饮食外再加适量的肠内营养制剂,应用30天。结果观察组孕妇的宫高和双顶径的增加显着大于对照组孕者;观察组胎儿无应激试验（NST）阳性的比率显着大于对照组（P〈0.01）;观察组低体重出生儿（小儿出生体重小于2500g）及和Apgar小于7分的患儿比率显着小于对照组（P〈0.01）。结论肠内营养支持在胎儿宫内发育迟缓的治疗中不仅有效,而且对孕妇和胎儿也是安全的。     

病案首页信息质量与统计报表的准确性

目的提高病案首页信息质量,保证医院统计报表的准确性.方法通过了解病案首页信息质量的要求(完整性、准确性、时效性);分析病案首页信息质量常见问题对医院统计指标的影响;提出对病案首页信息质量存在问题的对策.结果病案首页信息质量,直接影响医院统计报表的准确性.结论只有提高病案首页信息质量才能保证医院统计报表的准确.     

方药离合今论

通过对方剂配伍规律的研究,阐述了配伍在遣药组方及方中药性发挥中的重要作用,指出如配伍得当,可选择发挥方中之药的某一药性,可使方剂直达病位,亦可解毒增效,体现了方药离合之妙。     

从“神、形、纳、眠、便”判断糖尿病治疗效果

朱章志教授通过长期临床实践,在糖尿病治疗方面形成了一套独特的理论,创新性的提出以"神、形、纳、眠、便"判断疗效,即以患者的精神状态、形体、饮食、睡眠及二便等症状作为糖尿病治疗效果的判断标准。人体的"神、形、纳、眠、便"是在人体正气的推动下才能够正常,"神、形、纳、眠、便"出现异常,实际上是反应了人体正气的虚弱,因而可以用来评价人体的正气是否正常,这一方法在临床上具有很强的实用性,以此作为指导,取得了广大患者的认可。     

用权利制约权力--论病人权利与医师权力的关系

医师在医疗服务中拥有的医学治疗权不是一项个人权利,而是一项社会权力.医师权力来源病人权利的部分让渡.其目的是为了维护和增进病人的健康利益,但在现实生活中,市场经济的负面因素诱发医师权力部分地背离了它的本始目的,这一现象就是医师权力异化.异化了的医师权力侵犯病人权利,引起医患双方利益冲突,形成医疗纠纷.在立法上全面确定病人的权利与医师的义务,用病人权利制约医师权力,这是和谐医患关系的一条有效途径.     

现代司法技术与经验法则的运用

经验法则是利用事物发展常态而形成的规律,而适用于证据司法场域的特殊法官心证过程.借助现代司法的自由心证技术,以及盖然强度的适用效能评估,可以促进经验法则更加符合民众实质正义观感,促进基于证据事实裁量的纠纷解决结果的可接受性.