轮状病毒我国地方株NSP4基因与病毒毒力关系的探讨

轮状病毒是引起严重婴幼儿腹泻的最重要的病毒病原，在发展中国家每年至少有60万病人死于轮状病毒感染造成的腹泻。轮状病毒属呼肠孤病毒科，双链RNA病毒，三层蛋白壳包绕核心的11个分节段双链RNA基因片段。外壳是VP4和VP7蛋白，内壳是VP6蛋白。VP6是主要的组、亚组特异     

含SARS CoV RNA病毒样颗粒的构建和表达

目的:构建并表达含有SARS冠状病毒RNA片断的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒.方法:通过克隆大肠杆菌噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因以及SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段,将这些基因连接到载体 pTrc99a上表达,并进行纯化、定量分析、RT-PCR检测和稳定性试验. 结果: 获得病毒样核蛋白颗粒,在37℃稳定性可达到30 d,能抵抗核糖核酸酶降解. 结论: 该病毒样核蛋白颗粒稳定、安全、可靠,可作为SARS冠状病毒RT-PCR检测、定量分析的有效阳性参考品.     

人轮状病毒非结构蛋白NSP4基因特征的初步分析

目的：初步了解重症腹泻轮状病毒株NSP4基因特征及变异情况，方法：在2002年100例秋冬季腹泻患儿轮状病毒分子流行特征的研究中，确诊为轮状病毒腹泻的10例患儿的粪便标本。用PCR方法对其NSP4基因进行测定，并挑选出一株重症腹泻轮状病毒毒株(简称02′K1)。采用一步法RT-PCR对其NSP4基因进行扩增获得NSP4 cDNA，利用银染测序方法对所扩增获得NSP4 cDNA进行测定，采用Winegene231核酸分析软件对02′K1株NSP4核苷酸序列进行翻译，同时利用Omiga生物软件对02′K1株、ST3株(人轮状病毒G4血清型)及代表NSP4四个主要基因型的之一的Wa株(简称Wa-1株)、Wa-a株、Wa-v株的核苷酸和氨基酸序列进行比较，分析其同源性及02′K1株的NSP4氨基酸变异位点，结果：(1)经一步法RT-PCR扩增获得的NSP4 cDNA约725bp，NSP4基因全长686个核苷酸，含有一个开放读码框架，编码一个由175个氨基酸组成的蛋白；(2)02′K1株与ST3株、Wa-1株、Wa-a株、Wa-v株的核苷酸和氨基酸同源性均达90％以上；(3)与ST3比较，02′K1株的NSP4氨基酸序列有14个位点发生了变异。即aa16、aa26、aa60、aa72、aa76、aa124、aa135、aa140、aa141、aa145、aa146、aa161、aa162、aa169，结论：(1)02′K1株的NSP4基因型属于Wa组；(2)02′K1株的NSP4氨基酸序列有14个位点发生了变异。     

含肠道病毒5'端非编码区部分核糖核酸序列病毒样颗粒的构建

目的 构建含有肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'-UTR)部分RNA序列的耐核糖核酸酶(RNase)病毒样颗粒.方法 利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2.将肠道病毒5'-UTR基因片段连接到中间载体的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV.将其转化宿主菌,IPTG诱导表达,并进行RT-PCR检测和稳定性实验.结果 表达载体pET32a-MS2-EV经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功.RT-PCR和稳定性实验结果 表明,诱导产生的病毒样颗粒内含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列,并且稳定性良好.结论 成功构建了含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列的病毒样颗粒,可作为肠道病毒检测时的标准品和质控品使用.     

2007年至2008年昆明地区腹泻患儿轮状病毒非结构蛋白基因特征的分析

目的 探讨轮状病毒非结构蛋白(NSP4)基因的特征及变异情况.方法 在2007年和2008年昆明医学院第一附属医院儿科住院的96例秋冬季腹泻患儿中,随机选取轮状病毒阳性的12例(其中2007年6例,2008年6例)患儿粪便标本,采用RT-PCR扩增NSP4基因,并进行测序,测序结果 用DNAassist软件对核苷酸序列进行翻译,并用Clustal-mp软件与Genbank Datebase中的4株人RV(Wa、KUN、AU-1、Hochi)、3株动物RV(EW、OSU、SAll)和中国北京、上海、广州的流行株的NSP4序列进行分析比较.结果 (1)选取的2007年6份和2008年6份样本均可以扩增出NSP4的全长片段,测序表明:2007年6份样本中有5株属于Wa株,1株属于KUN株;2008年6份样本中也有5株属于Wa株,1株属于KUN株.10株Wa株与来自GenBank Database的4株人RV(wa、KUN、AU-1、Hochi)和3株动物RV(EW、OSU、SAll)同源性分别为96.3%、85.3%、84.7%、95.1%和57.7%、92%、82.8%,与中国北京、上海、广州的流行株同源性均在95%以上;2株KUN株与以上来自GenBank Database的标准株的同源性分别为85.3%、98.2%、82.8%、85.9%、60.1%、85.3%、94.3%,和其他地区流行株的同源性为85%左右; (2)以Wa株为参考,10株Wa株的NSP4基因变异发生在第34位氨基酸,第76位氨基酸,第141位氨基酸,第145位氨基酸,第161位氨基酸和第169位氨基酸;以KUN株为参考,2株KUN株的NSP4基因变异仅在第87位氨基酸和第140位氨基酸.结论 2007年和2008年昆明地区流行株NSP4基因为Wa组和KUN组,以Wa组为主.     

鼠源轮状病毒抗原基因的表达载体构建及农杆菌转化研究

目的 构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp4的植物载体及农杆菌转化。方法 抗原基因vp4经PCR扩增后直接克隆到pUC-T载体，双酶切目的片断和植物表达载体，以T4连接酶将目的片断与载体相连接，电转化方式将重组质粒转入农杆菌。结果 成功地将目的基因定向克隆到表达载体，并转入到农杆菌中。结论 pUC-T载体可直接进行PCR扩增产物克隆，便于测序：电转化方式可以有效、快速地将大分子量质粒（＞10kb）转入农杆菌中。     

EB病毒核抗原3C提高Gemin3基因的表达

  目的 探讨EB病毒核抗原(EBNA)3C对Gemin3基因表达的影响。方法 共转染EBNA3C和Gemin3基因至HEK293细胞。依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减EBNA3C基因的表达,并经嘌呤霉素筛选获得稳定的EBNA3C低表达细胞系,采用Western blot检测EBNA3C对Gemin3蛋白表达的影响。结果 Gemin3基因的表达随着EBNA3C表达量的增加而增加,呈剂量依赖性,在EBNA3C基因敲减细胞中Gemin3的表达减少。结论EBNA3C可提高Gemin3基因表达水平。     

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。     

用大引物PCR法获得轮状病毒VP4基因的突变体

目的；对A组轮状病毒主要结构抗原VP4基因中PacⅠ的识别序列进行无义突变以便于用腺病毒Ad-Easy载体系统进行表达。方法：采用大引物PCR方法，通过3条引物，两轮PCR反应，获得VP4基因的突变体，并经核酸序列分析证实。结果：PacⅠ识别的8个碱基序列TTAAT－TAA，突变为CTGATCAA。结论；大引物PCR是对核酸进行突变的一种简便，快速的方法。     

人乳头瘤病毒6b型病毒样颗粒免疫活性的研究

目的：了解人乳头瘤病毒（HPV）6b型病毒样颗粒（VLP）的免疫活性及其诱导的保护性抗体对HPV11型VLP和牛乳头瘤病毒1型（BPV1）VLP的交叉免疫反应。方法：将HPV6b、HPV11和BPV1晚期基因L1的开放读码框架（ORFs）分别重组到杆状病毒中,该重组病毒在感染的昆虫细胞（Sf9细胞）中表达,表达的L1蛋白可自行组装成HPV6b、HPV11和BPV1 VLP。取50μg纯化的HPV6bVLP分别在第0天和第21天经肌肉免疫Balb/c鼠。第二次免疫后1周及3个月取血,检测血清抗HPV6b、HPV11和BVP1 VLP和BPV1 VLP IgG滴度;血凝集抑制试验检测HPV6bVLP免疫产生的抗血清是否能阻止HPV11 VLP和BPV1 VLP与鼠红细胞凝集。结果：免疫后1周,应用ELISA方法检测抗HPV6b VLP、HPV11 VLP和BVP1 VLP血清IgG滴度分别为1：6400、1：600和1：600。3个月后,抗HPV6bVLP、HPV11 VLP 和BVP 1VLP血清IgG滴度分别为1：800、1：400和1：100。血凝集抑制试验显示HPV6bVLP产生的抗血清能够阻止高度同源性的HPV6b VLP和HPV11 VLP与鼠红细胞结合。结论：HPV6b VLP具有很强的免疫原性,免疫后产生的抗血清具有阻止HPV6b VLP和HPV11 VLP与细胞结合的能力。HPV6b和11型间确实存在交叉反应的中和表位,HPV6b VLP有可能用于防治HPV6b及HPV11感染的疫苗。     

E2F3基因真核表达载体的构建和表达

目的克隆人膀胱肿瘤组织E2F3基因及构建E2F3基因真核表达载体并研究其表达。方法取新鲜膀胱肿瘤组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增E2F3基因,构建其真核表达载体,测序分析及转染膀胱肿瘤细胞,Western Blot法检测其表达情况。结果成功克隆人膀胱肿瘤组织E2F3基因、构建E2F3基因真核表达载体,转染后成功表达。结论人膀胱肿瘤组织E2F3基因克隆及其真核表达载体构建成功,可用于肿瘤生物学的研究。     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。     

低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达

目的：构建携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的腺病毒载体（pAdxsi-GFP-HIF）,观察其在内皮细胞中的表达。 方法：低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1α cDNA 设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体。检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达。 结果：通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高。以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为（48.93±3.86）ng/mL。 结论：本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部。     

人PRL-3基因真核表达载体构建及相关蛋白生物信息学分析

目的克隆人PRL-3基因并构建其真核表达载体，并运用生物信息学方法对PRL-3的相互作用蛋白进行预测分析。方法运用RT—PCR技术，从人大肠癌细胞系SW480细胞中扩增出人PRL-3 cDNA，经T—A克隆，枸建人PRL-3基因的真核表达载体pcDNA3-PRL-3，通过双酶切鉴定及测序确认，并利用生物信息学方法预测分析其相互作用蛋白。结果成功扩增出人PRL-3全长cDNA，构建pcDNA3-PRL-3真核表达载体，测序结果表明PRL-3全长cDNA与GeneBank中PRL-3序列完全一致。利用模式生物果蝇相互作用蛋白数据库DIP，利用基于保守的蛋白相互作用分析方法，预测认为肌动蛋白家族成员ARP6和功能尚不清楚的小G蛋白家族ARL-3可能是PRL-3的相互作用蛋白，提示PRL-3可能是联系信号分子和细胞骨架系统的重要桥梁，参与构建了一条独特的结直肠癌转移信号途径。结论成功克隆PRL-3基因全长cDNA并构建其真核表达载体，并利用生物信息学方法，初步预测PRL-3的相互作用蛋白，为进一步深入研究PRL-3在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础。     

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基凶的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Set的编码序列．克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T—1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达后,SDS—PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量（Mr）为35kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进-步的工作打下了基础。