不同细胞因子组合对体外培养人脐带血造血干细胞的扩增效果

目的:观察细胞因子对培养的人脐带血造血干细胞的扩增效果,寻求体外最佳细胞因子组合。方法:实验于2002-06/2004-04在承德医学院基础研究所及承德医学院附属医院中心实验室完成。①以足月顺产健康新生儿的脐带血(由承德医学院附属医院妇产科提供,新生儿家属均签署实验知情同意书)作为实验标本。无菌条件下平均采血量30～60mL,梯度离心分离脐带血单个核细胞。②细胞体外扩增DMEM培养体系(含体积分数0.2的胎牛血清)为0.25μg/L干细胞因子,0.25μg/L白细胞介素3,0.5μg/L白细胞介素6,0.25μg/L粒-巨噬细胞集落刺激因子,0.8μg/L粒细胞集落刺激因子,0.05μg/L血小板生成素,0.8μg/LFLt-3配基。此7种细胞因子及剂量按不同组合分为6组:干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 粒-巨噬细胞集落刺激因子组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 粒细胞集落刺激因子组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 粒-巨噬细胞集落刺激因子 粒细胞集落刺激因子组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基组、干细胞因子 血小板生成素 FLt-3配基组。各组单个核细胞终浓度为1×108个L-1。③培养第7,14,21天进行细胞形态学观察;培养第0,5,10,14,18,21天观察不同细胞因子组合对脐带血干细胞扩增的效果;应用流式细胞仪对培养前后细胞表面标志CD34 进行检测。结果:①脐带血干细胞形态学观察结果:体外培养第14天,细胞胞体小,胞浆量少,胞核体积大,多不规则,为早期造血干细胞。②细胞体外扩增培养情况:应用干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基这一细胞因子组合,脐带血干细胞可保持>98%的细胞存活率;培养第7天出现典型早期造血干细胞,第21天细胞总数达到高峰(F=60.228,P<0.01)。③细胞表面标志CD34 的动态变化:干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基这一细胞因子组合为生长刺激剂,应用后体外培养的造血干细胞于第14天达高峰,与培养前比较差异有显著性意义(F=20.782,P均<0.01),之后逐渐下降。结论:应用干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基细胞因子组合可长期维持脐带血干细胞的体外生长,且体外培养第14天是临床移植的最佳时机。     

基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法

目的：通过建立简单经济的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法，比较不同成熟状态下树突状细胞生物免疫学特性的变化。 方法：实验于2004-07／2005-06在南方医院检验医学中心完成。①取C57B／L小鼠骨髓细胞作为树突状细胞的前体细胞。将培养的树突状细胞分成两组，未成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4诱导)；成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4+脂多糖)，每天光镜观察各组细胞生长情况。第6天收集细胞，其形态采用电镜观察。②两组树突状细胞表型分析采用流式细胞仪分析。③取BALB／c小鼠脾脏细胞，分离T细胞作为反应细胞。用两组树突状细胞作为刺激细胞。按刺激细胞与反应细胞1∶5，1∶10，1∶20，1∶40的比例混合培养，并用T细胞悬液作阴性对照，观察混合淋巴细胞反应情况。 结果：①树突状细胞培养的光镜观察：未成熟树突状细胞多为圆形，少量菌幕样突起；脂多糖刺激后，树突状细胞呈悬浮状态，表面较多细长突起。②树突状细胞电镜观察结果：扫描电镜示未成熟树突状细胞表面皱褶和较少的毛刺；成熟树突状细胞表面大量树枝状细长突起。透射电镜示未成熟树突状细胞形态较规则，突起较少，胞浆内有许多吞饮泡及多泡体；成熟树突状细胞形态不规则，胞内囊泡结构减少，细胞器较丰富，细胞核偏向一侧，表面有细长树枝状突起。③各组树突状细胞表型分析：未成熟树突状细胞表面中度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，低水平表达CD40，CD86和CD25；成熟树突状细胞表面高度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，高水平表达共刺激分子。④混合淋巴细胞反应：未成熟树突状细胞只能轻度刺激同种T细胞增殖；成熟树突状细胞能够刺激T细胞大量增殖。 结论：采用重组小鼠粒-巨集落刺激因子和白细胞介素4联合诱导骨髓前体细胞可在体外培养出大量未成熟树突状细胞，低表达共刺激分子，体外诱导同种T细胞增殖能力较弱，呈现耐受性树突状细胞特性，有望应用于移植排斥反应及或自身免疫疾病的生物治疗。     

不同刺激因子对脐血干／祖细胞体外增殖影响的比较

背景:目前细胞因子支持的脐血体外扩增是安全性较高、最有可能运用于临床的方法之一.目的:比较白血病抑制因子、白细胞介素6及脂多糖对脐血干,祖细胞体外增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对照实验,于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成.材料:10例正常脐血标本取自广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科,白血病抑制因子为达科为试剂公司产品,白细胞介素6为晶美试剂公司产品,脂多糖由广东医学院附属医院李延平教授自制.方法:密度梯度法体外分离培养脐血单个核细胞,应用磁分选器和单克隆抗体免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞.建立液体培养体系,为含体积分数为40%的胎牛血请、20 g/L牛血清白蛋白、20 μg/L粒巨集落刺激因子、20 μg/L干细胞因子、20 μg/L白细胞介素3的RPMI 1640培养液.取2×108 L-1脐血CD34+细胞,加入配制的液体培养体系50 μL,设立8组:第1组仅加入RPMI 1640作为对照,第2～4组分别单独加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6,第5～7组分别加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6的两两混合液,第8组加入3种刺激因子的混合液,上述各组脂多糖、自血病抑制因子、白细胞介素6的终浓度分别为10 U/mL,10 μg/L,10 mg/L.主要观察指标:MTT法测定不同刺激因子在液体培养体系中对脐血CD34+细胞增殖的影响.结果:培养3d后与对照组比较,单用白血病抑制因子对脐血CD34+细胞具有促增殖作用(F=3.33,P＜0.01),单用脂多糖或白细胞介素6的效果均不显著(F=2.14,1.83.P＞0.05):刺激因子两两联用及3种刺激因子联用时,对脐血CD34+细胞均具有促增殖作用(F=3.54～4.06,P均<0.01),且3种刺激因子联用时的促增殖效果尤为显著.结论:在特定的液体培养体系中,单独使用白血病抑制因子可明显促进脐血干,祖细胞体外增殖,联合情况下白细胞介素6、脂多精与白血病抑制因子具有促增殖协同作用.     

基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法

目的：通过建立简单经济的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法,比较不同成熟状态下树突状细胞生物免疫学特性的变化.方法：实验于2004-07/2005-06在南方医院检验医学中心完成.①取C57B/L小鼠骨髓细胞作为树突状细胞的前体细胞.将培养的树突状细胞分成两组,未成熟树突状细胞组（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子＋白细胞介素4诱导）;成熟树突状细胞组（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子＋白细胞介素4＋脂多糖）,每天光镜观察各组细胞生长情况.第6天收集细胞,其形态采用电镜观察.②两组树突状细胞表型分析采用流式细胞仪分析.③取BALB/c小鼠脾脏细胞,分离T细胞作为反应细胞.用两组树突状细胞作为刺激细胞.按刺激细胞与反应细胞1：5,1：10,1：20,1：40的比例混合培养,并用T细胞悬液作阴性对照,观察混合淋巴细胞反应情况.结果：①树突状细胞培养的光镜观察：未成熟树突状细胞多为圆形,少量菌幕样突起;脂多糖刺激后,树突状细胞呈悬浮状态,表面较多细长突起.②树突状细胞电镜观察结果：扫描电镜示未成熟树突状细胞表面皱褶和较少的毛刺;成熟树突状细胞表面大量树枝状细长突起.透射电镜示未成熟树突状细胞形态较规则,突起较少,胞浆内有许多吞饮泡及多泡体;成熟树突状细胞形态不规则,胞内囊泡结构减少,细胞器较丰富,细胞核偏向一侧,表面有细长树枝状突起.③各组树突状细胞表型分析：未成熟树突状细胞表面中度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子,低水平表达CD40,CD86和CD25;成熟树突状细胞表面高度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子,高水平表达共刺激分子.④混合淋巴细胞反应：未成熟树突状细胞只能轻度刺激同种T细胞增殖;成熟树突状细胞能够刺激T细胞大量增殖.结论：采用重组小鼠粒-巨集落刺激因子和白细胞介素4联合诱导骨髓前体细胞可在体外培养出大量未成熟树突状细胞,低表达共刺激分子,体外诱导同种T细胞增殖能力较弱,呈现耐受性树突状细胞特性,有望应用于移植排斥反应及或自身免疫疾病的生物治疗.     

小鼠脾脏树突状细胞的体外扩增与培养

背景:脾脏来源的树突状细胞诱导周期长,产量相对较少,相关报道亦较少.目的:建立简便的体外扩增小鼠脾脏树突状细胞的方法.设计、时间及地点:细胞形态学观察实验,于2007-02/09在华北石油总医院中心实验室完成.材料:健康BALB/C小鼠、C57小鼠及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4.方法:无菌手术取C57小鼠脾脏,用1 mL注射器抽取Hanks液,刺入脾脏并反复冲洗,获取单个核细胞,用0.1 g/L粒-单核细胞集落刺激因了、白细胞介素4的H-DMEM培养,8 d后即得成熟的树突状细胞.同时无菌取BABIJC小鼠脾脏制备单细胞悬液,收集非黏附细胞调整密度后作为反应细胞.再将两种细胞混合培养.主要观察指标:成熟树突状细胞的形态学观察,并对其表面CD11c,CD86及MHC-Ⅱ类分子进行检测.并计算两种细胞混合培养后的吸光度值.结果:体外诱导培养8 d后获得大量成熟的树突状细胞,细胞表面具有典型的树枝状突起,高表达树突状细胞相对特异性表面分子CD11c(78.46%)、CD86(87.24%)及MHC-Ⅱ(92.65%),同时具有较强的刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖的能力.结论:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素体外诱导培养小鼠脾脏细胞,可生成大量功能成熟的树突状细胞.     

CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞的诱导培养及鉴定

背景:新近发现CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞在参与免疫负向调控机制和临床治疗上有潜在的意义。目前对于健康人骨髓来源的调节性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定的研究较少。目的:体外培养正常人骨髓来源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的调节性树突状细胞,从细胞形态、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴细胞增殖能力等方面对其进行鉴定。方法:分离正常人骨髓单个核细胞分别在不同的培养体系中进行体外诱导培养,实验分3组:①调节性树突状细胞组,在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1的1640培养基中培养7d后,用脂多糖刺激24h。②未成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养8d。③成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养7d后,予脂多糖刺激24h,使其成熟。光镜和扫描电镜观察树突状细胞的形态,流式细胞仪检测其免疫表型以及吞噬能力,CCK-8法检测其刺激异基因淋巴细胞增殖能力。结果与结论:①人骨髓源单个核细胞在联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1培养8d后获得的细胞具有调节性树突状细胞的典型特征和免疫表型,说明该实验建立的培养调节性树突状细胞的方法是切实可行的。②CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞这种新亚群具有较强的吞噬能力,刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱,为调节性树突状细胞诱导免疫耐受的进一步研究奠定实验基础。     

不同质量浓度粒巨噬细胞集落刺激因子对Lewis大鼠骨髓源性树突状细胞诱导分化的影响

背景:体内成熟和不成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)数景极少,仅占外周血单核细胞的1%,占脾细胞的0.2%～0.5%,几乎不能直接从体内分离出大量的纯化的DC,要获得足够的DC,只有依靠体外培养增殖.目的:以不同剂量粒巨噬细胞集落刺激因子诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,拟建立合适的大鼠骨髓源性未成熟DC的培养方法.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-05在苏州大学附属第一医院临床免疫学实验室和附属儿童医院骨科实验室完成.材料:雄性SPF级Lewis大鼠用于培养骨髓源性DC,雄性SPF级Brown Norway大鼠用于混合淋巴细胞反应实验.方法:采用密度梯度离心法从Lewis大鼠股骨和胫骨获取骨髓源性单个核细胞,分别以2.5,5,10,20 μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子和5μg/L白细胞介素4诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,采用黏附法纯化DC.主要观察指标:以流式细胞仪分析DC表型.混合淋巴细胞反应中以Lewis大鼠DC作为刺激细胞,以Brown Norway大鼠脾脏T细胞作为反应细胞,检测其刺激同种T细胞增殖能力.ELISA测定分泌细胞上清液中白细胞介素12、干扰素水平.结果:随粒巨噬细胞集落刺激因子质量浓度的增高,诱导的细胞获得率逐渐升高,但DC比例逐渐下降.CD86、MHC-Ⅱ表达阳性率随培养时间延长逐渐增加.培养第5,7天,DC不能有效刺激同种异体T细胞的增殖反应,培养第13天,DC刺激同种异体T细胞的增殖反应能力明显增强(P＜0.01).培养7 d以后,DC上清液中自细胞介素12水平明显增高(P＜0.01),脂多糖刺激以后升高更加明显(P＜0.01).脂多糖刺激后DC表型MHCⅡ、CD86表达明显增加,白细胞介素12分泌增加,刺激同种T细胞增殖能力轻度增强.结论:5 μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子为诱导大鼠骨髓源性未成熟DC的最佳剂量,培养9 d可以获得足够数量和纯度的未成熟DC.     

在兔外周血源性及骨髓源性单核细胞向树突状细胞转化过程中人粒-巨噬细胞集落刺激因子与人白细胞介素4的作用

背景：目前常用鼠作为动脉粥样硬化动物模型,但其体型较小,试验条件受限。兔也是常用的动脉粥样硬化动物模型之一,但其树突状细胞的培养和鉴定方式需要进一步摸索。目的：探讨兔外周血源性及骨髓源性单核细胞体外向树突状细胞转化的可行性。设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-12/2008-10在南方医科大学珠江医院儿科实验室、中山医科大学达安医学检测中心完成。材料：6周龄雄性纯种新西兰大白兔12只,购自南方医科大学实验动物中心。人粒-巨噬细胞集落刺激因子、人白细胞介素4、脂多糖为美国Pepro Tech Inc产品。方法：兔心尖穿刺抽取血液20mL,同时行骨髓穿刺抽取骨髓10mL,采用密度梯度离心法分离收集中间云雾状细胞层,加入适量的含双抗的胎牛血清的1640培养液,培养2h后弃去未贴壁细胞,即为兔外周血源性和骨髓源性单核细胞。2种不同来源的单核细胞均分为2组：实验组以含有20μg/L人粒-巨噬细胞集落刺激因子、20μg/L人白细胞介素4的上述培养基隔日换液培养6d,其中在第5天加入10mg/L脂多糖刺激并孵育过夜;对照组未添加任何细胞因子。主要观察指标：光镜及电镜观察细胞形态,流式细胞仪鉴定细胞表型。结果：培养6d后,外周血源性和骨髓源性对照组细胞呈圆形或椭圆形,表面有小杆状突起,符合巨噬细胞的特征;实验组细胞呈不规则形,表面粗糙,胞体有形态不一的突起,符合树突状细胞的特征。流式细胞仪检测结果显示,外周血源性和骨髓源性的实验组细胞均高表达HLA-DR,CD86,低表达CD14,组间比较差异无显著性意义（t=0.5187,t=1.7151,t=0.0250,P均〉0.05）;对照组细胞HLA-DR,CD86,CD14的表达则与实验组相反。结论：在人粒-巨噬细胞集落刺激因子、人白细胞介素4及脂多糖联合作用下,兔外周血源性单核细胞及骨髓源性单核细胞均能转化为成熟树突状细胞。     

在免外周血源性及骨髓源性单核细胞向树突状细胞转化过程中人粒-巨噬细胞集落刺激因子与人白细胞介素4的作用

背景:目前常用鼠作为动脉粥样硬化动物模型,但其体型较小,试验条件受限.兔也足常用的动脉粥样硬化动物模型之,但其树突状细胞的培养和鉴定方式需要进一步摸索.目的:探讨兔外周血源性及骨髓源性单核细胞体外向树突状细胞转化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-12/2008-10在南方医科大学珠江医院儿科实验室、中山医科大学达安医学检测中心完成.材料:6周龄雄性纯种新西兰大白兔12只,购自南方医科大学实验动物中心.人粒-巨噬细胞集落刺激因子、人白细胞介素4、脂多糖为美国PeproTech Inc产品.方法:兔心尖穿刺抽取血液20 mL,同时行骨髓穿刺抽取骨髓10 mL,采用密度梯度离心法分离收集中间云雾状细胞层,加入适量的含双抗的胎牛血清的1640培养液,培养2 h后弃去未贴壁细胞,即为兔外周血源性和骨髓源性单核细胞.2种不同来源的单核细胞均分为2组:实验组以含有20μg,L人粒-巨噬细胞集落刺激因子、20μg/L人白细胞介素4的上述培养基隔日换液培养6 d,其中在第5人加入10 mg/L脂多糖刺激并孵育过夜;对照组未添加任何细胞因子.主要观察指标:光镜及电镜观察细胞形态,流式细胞仪鉴定细胞表型.结果:培养6 d后,外周血源性和骨髓源件对照组细胞呈圆形或椭圆形,表面有小杆状突起,符合巨噬细胞的特征;实验组细胞呈不规则形,表面粗糙,胞体有形态不一的突起,符合树突状细胞的特征.流式细胞仪检测结果显示,外周血源性和骨髓源性的实验组细胞均高表达HLA-DR,CD86,低表达CD14,组间比较差异无显著性意义(t=0.5187,t=1.7151,t=0.0250,P均＞0.05);对照组细HLA-DR,CD86,CD14的表达则与实验组相反.结论:在人粒-巨噬细胞集落刺激因子、人白细胞介素4及脂多糖联合作用下,兔外周血源性单核细胞及骨髓源件单核细胞均能转化为成熟树突状细胞.     

HBcAg和HBeAg对人树突状细胞成熟和功能的影响

目的观察乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)和乙型肝炎e抗原(hepatits B e antigen,HBeAg)对人树突状细胞的影响。方法分离20例健康者外周抗凝血淋巴细胞,将贴壁细胞加重组人白细胞介素4和重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子培养至第7天,将树突状细胞分为HBcAg组、HBeAg组和树突状细胞对照组,分别加入HBcAg、HBeAg对树突状细胞刺激培养至第10天,检测刺激培养后细胞表型与分泌的细胞因子及其对树突状细胞体外诱导的淋巴细胞增殖效应和淋巴细胞毒活性的影响。结果 HBcAg组、HBeAg组树突状细胞表面分子(CD83,CD86,HLA-ABC)水平和分泌干扰素-γ、白细胞介素-12p70水平、体外诱导淋巴细胞增殖效应及淋巴细胞毒活性与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);HBcAg组增强树突状细胞的分子表达、分泌白细胞介素-12p70及体外诱导淋巴细胞毒活性与HBeAg组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HBcAg和HBeAg可增加人树突状细胞表达成熟活化的分子、分泌细胞因子,增强树突状细胞体外诱导淋巴细胞增殖效应及淋巴细胞毒活性。