肝癌中具有高突变率位于染色体17p13.3区的新抑癌基因

目的　以往研究表明肝癌中染色体 1 7p1 3 .3区有高频率的杂合性缺失。其最小杂合性缺失范围已被确定在D1 7S643至D1 7S1 574位点间 ,而且其中的D1 7S92 6位点有最高的杂合性缺失率。含有该位点的基因组克隆P579已被测序分析 ,在P579范围共有 1 3个新基因。这里报告其中的一个新基因 (命名为肝癌抑癌基因 1 ,HCCS1 )的克隆和特性研究结果。方法　利用直接杂交筛选方法获得基因组克隆P579中的基因克隆。根据HCCS1基因克隆的cDNA序列与基因组序列进行比较确定基因的外显子与内含子。应用RT PCR扩增组织中的HCCS1基因 ,序列测定检查突变。应用免疫组化检测HCCS1在组织中的表达。应用克隆形成试验和裸鼠成瘤试验检测HCCS1的生物学功能。结果　HCCS1有 1 8个外显子 ,cDNA全长约2 .0kb ,蛋白产物定位于线粒体。HCCS1在肝癌组织中有高频率的突变 ,免疫组化检测表明HCCS1在癌旁组织的表达明显高于癌组织。HCCS1转染肝癌细胞明显抑制其克隆的形成及在裸鼠体内的成瘤。结论　上述发现表明HCCS1具有肝癌抑癌基因的作用     

肝癌相关新基因HC6的全长cDNA克隆及分析

目的：染色体17p13.3区域内多态性位点D17S926是肝细胞肝癌（HCC）杂合性缺失热点,PAC579克隆含有D17S926位点,本实验目的在于从PAC579克隆中寻找与肝癌相关的表达序列（ESTs),对有意义的EST片段克隆其全长cDNA。方法：根据PAC579克隆中现有的9个代表新基因的 EST序列设计引物,对正常人肝cDNA文库作多聚酶链式反应（PCR）扩增检测,确定在肝组织中表达的EST,然后采用Southern杂交检测肝组织中表达的EST在27对肝癌和癌旁标本中杂合性生缺失（LOH）频率,选择缺失频率最高的EST克隆其全长cDNA,Nothern杂交验证后测序并作进一步分析。结果：PAC579现有9个代表新基因的EST中有3个在肝组织中表达,其中EST6有肝癌中LOH频率高达54．6％（6／11）,通过PACE－PCR方法,得到约1．8kb全长cDNA克隆,与Northern杂交结果一致,结构及同源性分析显示该基因是一新基因,编码一个包含134个氨基酸,分子量约为14．7kD的蛋白质,另外发现碱基序列313－592属于ALu同源序列,重新命名为肝癌相关基因6（HC6）。结论：通过定位克隆方法从肝癌杂合性缺失热点得到一个新基因HC6,该基因与肝癌的关系有待进一步研究。     

肝癌染色体17p13.3区的杂合性缺失分析及缺失区连续克隆群的构建

目的　检测原发性肝癌在染色体 17p13.3区的杂合性缺失状况 ,确定其共同缺失范围和最小热点缺失范围 ,并获得缺失范围内基因组克隆和构建连续克隆群。方法　应用Southern杂交分析VNTR(variablenumberoftandemrepeat,VNTR)和RFLP标志在肝癌中杂合性缺失 (LOH)状况。应用PCR扩增微卫星标志 ,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各个微卫星标志的LOH状况。以微卫星标志为引物 ,经过 3轮PCR筛选阳性基因组克隆。通过检测各位点标志对基因组克隆的反应 ,构建连续克隆群。结果　检测了 5 4份原发性肝癌样品在染色体 17p13.3区 16个位点标志和染色体 17p13.1区的p5 3基因的TP5 3位点标志的LOH情况 ,发现从D17S5位点至D17S34位点间的各个标志都有较高LOH ,频率 >6 3%。而从D17S5位点起、近着丝粒方向的 3个标志LOH率都较低或无LOH。染色体17p13.1的TP5 3标志只有 31%的LOH ,低于染色体 17p13.3区的D17S5至D17S34位点间各标志的LOH率。有 2例肝癌样品在近端粒的D17S34、D17S186 6位点和近着丝粒的D17S5、D17S15 74位点均无LOH ,但在D17S849至D17S15 74间的各位点上均呈LOH或为纯合子。在缺失范围内 ,共筛选了 18个位点的基因组克隆 ,获得了相对应的阳性基因组克隆 ,经过检测各位点对基因组克隆的反应性 ,构建了覆盖 9个标     

鼻咽癌染色体11q13等位基因杂合性缺失的研究

目的：对鼻咽癌中染色体11q13上的4个位点进行微卫星多态性分析,明确这些位点染色体位基因杂合性丢失的情况。方法：采用显微切割的方法获取较纯的肿瘤组织,然后用PCR的方法以PYGM、D11S4946、D11S449和INT－2为引物,对38例鼻咽癌进行微卫生序列分析。结果38例鼻咽癌组织中,至少有一个位点出现杂合性缺失者36例,占94．7％。其中D11S4946杂合性缺失的频率最高,占78．8％（26／33）,其余的引物分别为：INT－2占51．5％（17／33）,PYGM占45．5％（15／33）,D11S449占45．7％（16／35）。结论鼻咽癌染色体11q13区发生高频率杂合性缺失,提示缺失区域可能存在与鼻咽癌发生有关的抑癌基因。     

肺癌相关基因HLCDG1的克隆和表达分析

背景与目的：比较基因组杂交和微卫星多态性位点全基因组扫描结果显示肺癌患者在染色体3p、5q、6q、9p、10q、llp、13q、17p、19p等区域存在高频率的杂合性缺失,提示可能有多个未知的易感基因或抑癌基因与肺癌的发生、发展相关。本研究选用在mRNA差异显示研究中获得的在肺癌组织中表达下调且代表新基因的表达序列标签(expressed sequence tag,EST)LXDDl为进一步研究对象,克隆其全长cDNA。方法：采用Northern杂交验证LXDDl在肺癌中的表达差异。并用MTN(Multiple Tissue Northern Blots^TM)膜检测其在正常组织中的表达及其所代表基因的转录本大小;克隆其全长cDNA,并利用生物信息学对该序列进行初步分析;用差异RT-PCR检测新基因在肺癌组织、配对癌旁非癌组织、肺癌细胞系和其它肿瘤细胞系中的表达。结果：成功地克隆了一个在肺癌中表达下调的新基因。HLCDGl(human lung carcinoma deleted gene 1),GenBank登录号为AF447582,全长cDNA为3．113kb,预测其开放阅读框编码一个含166个氨基酸的跨膜蛋白质。通过电子-聚合酶链反应(electric-polymerase chain reaction,e-PCR)将该基因定位于5q33。结论：HLCDGl基因是一个在肺癌中表达下调的新基因。这提示HLCDGl可能与肺癌的发生、发展相关。     

乳腺浸润性导管癌染色体1p36杂合性缺失的初步研究

目的 探讨染色体1p36可能存在的与非特殊类型乳腺浸润性导管癌发生、发展有关的肿瘤抑制基因,为发现和定位肿瘤抑制基因提供线索和热点位点.方法 选取1号染色体8个微卫星多态位点标志物,采用新鲜和石蜡组织基因组DNA抽提-PCR扩增-变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳-银染法-全自动凝胶成像系统分析,检测80例浸润性导管癌及癌旁正常组织基因组DNA的杂合性缺失（LOH）频率.应用x2检验对实验结果进行综合分析.结果 80例浸润性导管癌中有45例（56.3％）至少在一个位点出现LOH,其中D1S1310微卫星位点频率最高,为35.7％（25/70）.结论 乳腺浸润性导管癌染色体1p36发生高频率LOH,提示1p36.23 ～ 33区间可能存在与乳腺癌发生、发展有关的抑癌基因.     

肝细胞癌基因组5q13.2与8p23.1位点的杂合性缺失分析

[目的]分析肝细胞癌(HCC)中5q13.2和8p23.1位点的杂合性缺失(LOH)情况,以探索新的抑癌基因.[方法]应用聚合酶链反应—非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法对83例HCC患者基因组DNA中的5q13.2和8p23.1位点的LOH进行检测,并将其与临床参数进行关联分析.[结果] 83例HCC患者基因组中,36.1％(30例)存在5q13.2位点LOH,在该位点存在OCLN、SMN2、SERF1A、SMN1、NAIP和GTF2H2基因;8p23.1的D8S503和D8S1130位点分别存在68.4％和61.3％的LOH.[结论]HCC患者基因组中存在较高频率的5q13.2和8p23.1位点LOH,这些位点中可能存在与HCC发生密切相关的基因.     

肝癌抑制基因-1与转运功能相关的451 bp序列区的确定

背景与目的:肝癌抑制基因-1(HCCS1)是一种潜在的肝癌抑制基因,并且在细胞内蛋白分拣运输中也发挥着重要作用,其抑癌作用有可能是通过其蛋白转运的功能而发挥的,本文以寻找HCCS1序列中与转运相关的最小功能序列区域为目的.方法:通过亚克隆技术,构建以pEGFP-C2为载体的含不同长度HCCS1cDNA片段的亚克隆,将构建的亚克隆转染子宫颈癌HeLa细胞,通过免疫荧光共聚焦显微镜观察不同长度HCCS1蛋白的分布,以及与6-磷酸甘露糖受体(M6PR)的共定位.结果:成功构建了以pEGFP-C2为载体的10个含有不同长度HCCS1片段的亚克隆;HCCS1cDNA从3'端向5'端逐渐缺失的片段中:2 100 bp片段至778 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白呈颗粒状分布于核周的胞质内,其中2 100 bp片段至1 571 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白均呈颗粒状、极性分布于核周的胞质内,且与M6PR有共定位;而1 120 bp片段至778 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白虽然也呈颗粒状分布于核周,但极性分布消失,且与M6PR共定位消失;HCCS1cDNA片段678 bp片段至339 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白呈散点状弥散分布于胞质以及胞核内.结论:确定了HCCS1cDNA 1 571 bp片段的3'端451 bp的序列为与HCCS1转运功能相关的最小区域范围.     

染色体17p13.3肿瘤杂合性缺失区域内外显子的分离

目的 在染色体１７ｐ１３．３杂合性缺失区域内进行表达的分离。方法 采用外显子搏获法对位于１７ｐ１３．３杂合性缺失区域内的ＢＡＣ基因组克隆进行外显子的分离。结果 在获得的克隆中,４个克隆为已知基因的外显子,另４个史隆属于３个上显子（２个克隆中的外显子片段序列一致）。结论 在染色体１７ｐ１３．３杂合性缺失区域内获得了一些表达序列。     

3p213区域鼻咽癌相关基因--BLU的抑癌功能

背景与目的：染色体3p21.3区域的杂合性丢失是鼻咽癌细胞中高发和早期的细胞遗传学变异,提示缺失区域内可能存在与鼻咽癌发生相关的抑癌基因。BLU基因定位于3p21.3,蛋白质结构中含有MYND功能域。已有研究表明,BLU基因在鼻咽癌细胞中发生高频率的启动子甲基化和表达缺失。本研究构建了野生型BLU基因和其突变体的表达载体,分析BLU基因对鼻咽癌细胞恶性增殖的可能抑制作用。方法：用RT－PCR方法钓取BLU基因全长cDNA;用定点突变技术分别构建缺失MYND结构域的突变体、携带Ser402Phe点突变及缺失第405位Cys和第406位Ser的突变体、以及携带Gly160Arg点突变的BLU基因突变体的表达载体。将野生型BLU基因和MYND缺失型突变体转染鼻咽癌细胞CNE1和CNE2,用TUNEL方法检测、观察细胞凋亡情况;通过细胞计数和克隆形成实验分析稳定转染细胞的生长特性;分析稳定转染BLU基因的载体对CNE2细胞裸鼠致瘤性的影响。结果：瞬时转染野生型或MYND缺失突变型BLU基因不能诱导CNE2细胞凋亡;外源表达BLU基因对CNE2的细胞凋亡以及对CNE1、CNE2的细胞增殖和克隆形成能力均无明显影响;BLU基因对CNE2细胞的裸鼠成瘤能力也没有明显抑制作用。结论：尽管BLU基因在鼻咽癌中发生高频率变异,但其对鼻咽癌细胞的恶性增殖并没有明显抑制作用,因此该基因是否是抑癌基因,以及其在鼻咽癌发生中的作用机制和功能仍有待进一步探讨。