冈田酸诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白的过度磷酸化

目的 观察冈田酸（0A）对SH—SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响。方法 MTT比色法观察OA对SH—SY5Y细胞代谢率的影响，免疫细胞化学法和蛋白免疫印迹法观察OA对SH—SY5Y细胞磷酸化tau蛋白水平的影响。结果 40nmol／LOA孵育SH—SY5Y细胞24h可显著降低细胞代谢率，其效应随着OA浓度的增加和孵育时间的延长而增强。OA作用于细胞3～48h，蛋白免疫印迹显示Ser-396位点磷酸化tau蛋白水平逐步升高，24h达高峰，之后下降。免疫细胞化学法显示，OA作用于细胞24h，Ser-396位点磷酸化tau蛋白水平较对照组细胞增强。结论 OA增强SH—SY5Y细胞tau蛋白Ser-396位点磷酸化水平。     

泛素C末端水解酶L1活性对皮层神经元中tau蛋白磷酸化的影响

目的:在细胞水平探讨泛素C末端水解酶L1(UCH-L1)活性抑制对微管相关蛋白tau的磷酸化影响。方法:使用UCH-L1特异性抑制剂LDN-57444处理原代培养皮层神经元后检测UCH-L1酶活性,tau蛋白磷酸化水平采用免疫印记法检测。结果:LDN-57444对UCH-L1酶活性的抑制呈浓度依赖性和时间依赖性关系(P<0.01);伴随UCH-L1酶活性的显著抑制,tau蛋白Ser199、Ser202和Ser396位点磷酸化水平均明显升高(P<0.01),而总tau水平无明显改变(P>0.05)。结论:UCH-L1抑制可诱发神经元过度磷酸化tau蛋白的聚积,UCH-L1活性失调可能参与了阿尔茨海默病的病理过程。     

冈田酸诱导SH-SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化与PTEN蛋白水平的变化

目的 研究冈田酸（OA）诱导SH—SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化程度和PTEN蛋白水平的变化。方法 40nmol／LOA孵育SH—SY5Y细胞不同时间（0，3，6，12，18，24，36，48h）后，倒置显微镜观察细胞的形态变化，免疫印迹检测各时间点tau蛋白ser^396。位点的磷酸化及PTEN蛋白水平的变化。结果 SH-SY5Y细胞随OA孵育时间的延长逐渐出现细胞胞体变圆，突起回缩，悬浮生长至死亡。细胞tau蛋白ser^396位点磷酸化水平于OA作用3h开始升高，18h达高峰，随后逐渐下降，48h低于基础水平；而PTEN蛋白水平于OA作用3h开始升高，6h达高峰，之后逐渐下降，18h开始低于基础水平。结论 OA诱导SH—SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化水平和PTEN蛋白水平均呈先上升后降低的变化趋势。     

冈田酸诱导SH-SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化与PTEN蛋白水平的变化

目的 研究冈田酸(OA)诱导SH-SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化程度和PTEN蛋白水平的变化.方法 40nmol/L OA孵育SH-SY5Y细胞不同时间(0,3,6,12,18,24,36,48h)后,倒置显微镜观察细胞的形态变化,免疫印迹检测各时间点tau蛋白ser396位点的磷酸化及PTEN蛋白水平的变化.结果 SH-SY5Y细胞随OA孵育时间的延长逐渐出现细胞胞体变圆,突起回缩,悬浮生长至死亡.细胞tau蛋白ser396位点磷酸化水平于OA作用3h开始升高,18h达高峰,随后逐渐下降,48h低于基础水平;而PTEN蛋白水平于OA作用3h开始升高,6h达高峰,之后逐渐下降,18h开始低于基础水平.结论 OA诱导SH-SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化水平和PTEN蛋白水平均呈先上升后降低的变化趋势.     

人参皂苷Rg1通过ODK5途径减轻Aβ25-35诱导的神经元tau蛋白磷酸化

目的探讨在Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化中，人参皂苷Rg1对tau蛋白过度磷酸化及周期依赖性蛋白激酶5（CDK5）的激动亚基p35的影响。方法通过蛋白免疫印迹法检测胎鼠皮层神经元CDK5的两个亚基cdk5和p35／p25的蛋白水平，以及CDK5的磷酸化底物tau蛋自在Thr205和Ser404位点的磷酸化水平。结果凝聚态Aβ25-35（20μmol／L）作用于皮层神经元12h，皮层神经元中p35裂解成p25的数量增多，tau蛋白在Thr205和Ser404位点的磷酸化水平增高，对cdk5亚基表达水平的影响不明显。人参皂苷Rg1和calpain特异性抑制剂calpeptin可稳定皮层神经元的p35蛋白，减少p25生成，人参皂苷Rg1和CDK5特异性抑制剂roscovitine可减轻凝聚态Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化。结论CDK5可能参与人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ25-35诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化。     

雌激素对SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响

目的研究雌激素对冈田酸诱导的人神经母细胞瘤系(SH-SY5Y)细胞tau蛋白磷酸化的影响。方法四甲基偶氮唑盐观察冈田酸对SH-SY5Y细胞活力的影响,模拟AD时tau蛋白过度磷酸化细胞模型;Western blot检测冈田酸及雌激素对Thr231 tau蛋白磷酸化的影响。结果四甲基偶氮唑盐结果表明,当冈田酸浓度>40 nmol/L时,细胞活力受到明显抑制,<40 nmol/L的冈田酸对细胞活力没有明显的影响;Western blot结果表明,SH-SY5Y细胞经冈田酸处理后,tau蛋白磷酸化的水平明显增加,这种作用可被雌激素所抑制。结论雌激素抑制了冈田酸诱导的SH-SY5Y细胞的tau蛋白磷酸化水平。     

Effect of electromagnetic radiation on tau protein phosphorylation in primarily cultured cortical neurons

目的 研究电磁辐射对原代培养皮层神经元tau蛋白磷酸化的影响.方法 原代培养大鼠皮层神经元分为假辐照组和辐照组,辐照组采用平均功率密度为90 mW/cm2的电磁波辐照10 min,分别于辐照后0、1、3、6、12 h取材.采用CCK-8检测电磁辐射辐照后神经元活性,Western blot检测tau蛋白磷酸化位点ser199/202、ser396、ser404磷酸化变化,同时观察细胞周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5,CDK5)抑制剂Roscovitine、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)抑制剂氯化锂(LiCl)和钙激活蛋白酶(calpain)抑制剂PD150606对电磁辐射暴露后tau蛋白磷酸化水平的影响.结果 电磁辐射辐照后6h和12 h,原代培养大鼠皮层神经元细胞活性明显降低[与假辐照组比较,分别下降19％ (P ＜0.05)和30％ (P ＜0.01)].电磁辐射辐照后1h和3h,原代培养大鼠皮层神经元tau蛋白ser404位点磷酸化程度一过性增强[与假辐照组比较,分别升高89％(P＜0.01)和46％(P＜0.05)],而ser199/202、ser396位点磷酸化程度变化不明显(P＞0.05).Roscovitine、LiCl和PD150606对电磁辐射引起的tau蛋白ser404位点过度磷酸化有显著抑制作用(P＜0.01).结论 电磁辐射可引起原代培养的皮层神经元tau蛋白ser404位点过度磷酸化,CDK5、GSK-3β和calpain参与其中.     

脑脊液tau蛋白和磷酸化tau蛋白测定在阿尔茨海默病诊断中的应用价值

目的探讨脑脊液tau蛋白和磷酸化tau（p-tau）蛋白检测在阿尔茨海默病（AD）诊断中的应用价值。方法选取2012年4月~2014年4月在中国人民解放军第309医院和佳木斯大学附属医院接受治疗的AD患者（AD组）、血管性痴呆患者（VD组）及非神经系统疾病患者各50例为研究对象,检测并分析患者脑脊液tau蛋白和p-tau蛋白的含量。结果 AD组患者脑脊液p-tau蛋白含量为（190.3±83.1）pg/mL,显著高于VD组患者的（73.4±36.2）pg/mL和非神经系统疾病组的（55.4±35.2）pg/mL（P〈0.05）;VD组患者脑脊液中p-tau蛋白含量与非神经系统疾病组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。以tau蛋白含量≥370pg/mL为AD诊断标准时,灵敏度、特异度、检验可靠性和与VD患者鉴别率分别为89.6%、78.8%、82.4%和66.8%;以p-tau蛋白含量≥120pg/mL为AD诊断标准时,灵敏度、特异度、检验可靠性和与VD患者鉴别率分别为93.5%、89.9%、91.7%和82.6%。结论脑脊液p-tau蛋白可作为临床鉴别诊断AD患者的辅助指标。     

非神经源性细胞中tau蛋白的稳定表达及磷酸化

目的建立稳定表达tau蛋白的稳转细胞系,并观察tau蛋白的过度磷酸化对稳转的非神经源性细胞形态和活性的影响。方法构建pEGFP-C1-tau真核细胞表达质粒,建立稳转和表达融合蛋白GFP-tau的293T细胞系,并用不同浓度的蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(OA)处理细胞以诱导其过度磷酸化,通过荧光显微镜观察细胞形态的变化,用MTT法监测细胞的活性及免疫印迹法检测tau蛋白的表达及磷酸化水平。结果成功地建立了稳定表达GFP-tau蛋白的非神经源性稳转细胞系,该细胞系在稳转后3~4周,细胞生长状态良好,细胞形态和突起生长基本正常。用OA处理后,细胞突起消失、变圆,贴壁性能差,死亡的细胞数量也增多,这些变化随着OA作用时间的延长或浓度的增加更加明显;MTT法显示细胞的增殖活性明显下降;免疫印迹法提示,100nmol/LOA作用8h后,磷酸化tau水平增加。结论对于稳定表达tau蛋白的非神经源性细胞,OA可降低其增殖活性,该作用可能与OA抑制细胞内去磷酸化过程有关。     

阿尔茨海默氏症中tau蛋白磷酸化与去磷酸化

阿尔茨海默病（alzheimer＇s disease,AD）是一种中枢神经系统退行性病变,是老年痴呆最常见的类型。其特征性的病理变化之一为脑神经元内因为异常过度磷酸化的tau蛋白聚集而形成的神经元纤维缠结（neuro fibrillary tangle,NFT）,     

外源性脑源性神经营养因子通过抑制tau蛋白磷酸化减少细胞凋亡

目的 观察外源性脑源性神经营养因子(BDNF)对tau蛋白过磷酸化及神经元凋亡的影响,探讨其可能的作用机制.方法 将培养的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)分为正常对照组;冈田酸(OA)组:浓度为40 nmo/L的OA处理24 h;BDNF组:OA处理24 h后加入浓度为50 ng/mL的BDNF处理15 min;LY294002组:OA处理24 h后加入BDNF(50 ng/mL)及LY294002(40 nmol/L)共同处理15 min;K252a组:OA处理24 h后加入BDNF(50 ng/mL)及K252a (40 nmol/L)共同处理15 min.通过MTT检测细胞存活率、流式细胞仪检测细胞凋亡率、Western blot检测Ser199/202、pSer199/202及bcl-2表达.结果 MTT 实验显示OA组、LY294002组及K252a组细胞存活率较正常对照组及BDNF组明显减低(P＜0.01);BDNF组与正常对照组无明显差异(P＞0.05).流式细胞仪检测显示OA组、LY294002组及K252a组细胞凋亡率较正常对照组及BDNF组明显增加(P＜0.01);BDNF组与正常对照组之间无统计学差异(P＞0.05).Western blot显示OA组、LY294002组及K252a组pSer199/202表达较正常对照组及BDNF组明显增多(P＜0.01),Ser199/202及bcl-2表达较对照组及BDNF组明显减少(P＜0.01),BDNF组与正常对照组比较无统计学差异(P＞0.05).结论 外源性BDNF可通过抑制tau蛋白磷酸化减少细胞凋亡.     

胆囊收缩素对神经元蛋白磷酸化的实验研究

目的探讨CCK8对神经元蛋白质磷酸化修饰的影响,为研究CCK8在神经系统中的信号转导提供线索。方法培养乳小鼠神经元,32P-NaH2PO4(2.03×105Bq/mL)掺入2h后,实验组加入终浓度为10-7mol/L的CCK8,对照组加入无磷培养基,37℃孵育0、5、20、60和120min后,液氮终止反应,提取蛋白,测定蛋白含量,分离蛋白后,放射自显影获得磷酸化蛋白质的图谱,采用PDQuest2D分析软件进行图像分析。结果放射自显影图谱显示,与对照组比较,CCK8刺激后,神经元磷酸化蛋白质斑点有明显改变;采用PDQuest2D软件进行差异蛋白质分析显示,与CCK8信号转导相关的磷酸化蛋白质包括了多种蛋白激酶、细胞膜受体、胞内信号分子、转录因子等。结论根据磷酸化蛋白质组分析的结果推测CCK8在皮质神经元的信号转导途径可能包括肌醇磷脂信使系统、cAMP-PKA途径、MAPK途径等。     

早老蛋白-1过度表达对神经母细胞瘤NG-108的tau蛋白磷酸化的影响

目的观察早老蛋白-1（Presenilin-1,PS1）的过度表达对tau蛋白磷酸化的影响。方法在NC-108细胞上转染不同的PS1质粒,利用免疫双标,免疫印记,免疫细胞化学,MTT,Western blot等方法,观察早老蛋白-1的过度表达对tau蛋白磷酸化的影响。结果免疫双标显示,在散发性AD（sporadic Alzheimer disease）患者脑内,PS1主要分布于神经元,并与磷酸化tau蛋白部分共存。免疫印迹显示,与空质粒组相比,转染野生型PS1组和转染一种家族性AD（familial Alzheimer disease,FAD）突变型早老蛋白-1（mPS1）质粒组的NG-108细胞中磷酸化的tau蛋白均增加。MTT方法未检测到这两组的转染细胞与对照组有显著差异。用Confocal显微镜观察PS1-EGFP质粒转染组,发现在转染后早期12h,PS1-EGFP主要分布在细胞膜表面或细胞器上,随后PS1-EGFP主要在细胞浆中弥散分布。同时,免疫细胞化学检测显示,部分PS1-EGFP转染细胞中有明显的tau蛋白磷酸化,并且这些磷酸化tau蛋白能与PS1-EGFP蛋白一起形成聚集体。在给予磷酸酯酶抑制剂岗田酸后,PS1-EGFP转染细胞比未转染细胞含有更多的磷酸化的tau蛋白。结论野生型PS1可能参与了散发性阿茨海默氏病中的tau蛋白的病理改变。     

Effect of Truncated-ApoE4 Overexpression on tau Phosphorylation in Cultured N2a Cells

Apolipoprotein(apo)E4isamajorriskorsusceptibilityfactorforAlzheimerdisease(AD)[1].However,themechanismsthroughwhichtheApoE4geneanditsApoE4proteinproductsconferthisincreasedriskarelargelyunknown.Neurofi brillarytangles(NFTs)mainlyconsistingofthehyperphosphorylatedmicrotubule associatedpro teintauarethedefiningpathologicalcharacteristicsofAD[2].ApoE4undergoesproteolyticcleavagebyachymotrypsin likeserineproteaseinADbrainsandinculturedneuronalcells,resultingintheac cumulationofcarboxyl termi…     

β-Secretase inhibitor increases amyloid-β precursor protein level in rat brain cortical primary neurons induced by okadaic acid

Background Senile plaques and neurofibrillary tangles （NFTs） represent two of the major histopathological hallmarks of Alzheimer＇s disease （AD）. The plaques are primarily composed of aggregated amyloid β （Aβ） peptides. The processing of amyloid-β precursor protein （AβPP） in okadaic acid （OA）-induced tau phosphorylation primary neurons was studied. Methods Primary cultures of rat brain cortical neurons were treated with OA and β-secretase inhibitor. Neurons＇ viability was measured. AβPP processing was examined by immunocytochemistry and Western blotting with specific antibodies against the AβPP-N-terminus （NT） and AβPP-C-terminus （CT）. Results Ten nmol/L OA had a time-dependent suppression effect on primary neurons＇ viability. The suppression effect was alleviated markedly by pretreatment with β-secretase inhibitor. After OA treatment, both AβPP and β-C-terminal fragment （βCTF） were significantly increased in neurons. AβPP level was increased further in neurons pretreated with β-secretase inhibitor. Conclusions In OA-induced tau phosphorylation cell model, inhibition of β-secretase may protect neurons from death induced by OA. Because of increased accumulation of AβPP in neurons after OA treatment, more AβPP turns to be cleaved by β-secretase, producing neurotoxic βCTF. As a potential effective therapeutic target, β-secretase is worth investigating further.     

不同年龄大鼠神经系统tau蛋白的表达特性

通过研究不同年龄组大鼠脑组织中微管相关蛋白tau的表达特性和磷酸化位点的差异,为阿尔茨海默病（AD）脑组织中tau蛋白的研究提供资料。将大鼠分为胎鼠、新生鼠、成年鼠和老年鼠4组,取各组大鼠的脑组织制成匀浆,用免疫印迹法检测各组tau蛋白的分子量范围及磷酸化状态。结果发现非磷酸化依赖性抗tau抗体R134d的免疫显色结果显示胎鼠和新生鼠主要含低分子量（14.2～28.8ku）tau蛋白;成年鼠除在脊索中显示高分子量tau（67.5～96.6ku）外,大脑灰质和白质中的tau蛋白主要集中在中分子量（28.8～42.7ku）范围;老年鼠的灰质、白质和脊索中均含高分子量tau蛋白,且在灰质和白质组分中中分子量tau的含量比成年组显著增高。Tau-1的显色性质与R134d相似。PHF-1和M4只在胎鼠和新生鼠显带。认为大鼠神经系统tau蛋白的表达性质及其磷酸化状态随年龄增长而显著不同。     

神经生长因子对局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质tau蛋白磷酸化的影响

目的探讨外源性神经生长因子(NGF)对局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质神经元tau蛋白过度磷酸化的影响。方法用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型,应用免疫组织化学SABC法、Western Blotting和图像分析方法检测大鼠缺血侧顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化程度和总tau蛋白表达。结果缺血再灌注组顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化水平和总tau蛋白表达比假手术组显著升高(P<0.05);NGF组大鼠顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化水平显著低于缺血再灌注组和高于假手术组,NGF组总tau表达也下降但仍高于假手术组(P<0.05)。结论NGF明显减轻局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质tau蛋白磷酸化程度,NGF可能通过降低tau蛋白磷酸化水平对缺血神经元起保护作用。     

蛋白激酶A在培养胎鼠皮层神经元缺氧凋亡中的作用

目的：探讨培养神经元缺氧后蛋白激酶A（PKA）活性变化及其与神经元凋亡的关系。方法：建立体外培养大鼠皮层神经元及培养神经元缺氧模型，用3种不同浓度的PKA抑制剂（Rp-cAMP）在不同的缺氧时相点观察神经元下述指标的改变神经元细胞和细胞质中PKA的活性，caspase-3(CPP32)和TUNEL表达（细胞凋亡）的规律。结果：随着缺氧时间的延长，培养神经元细胞膜PKA的活性显著增加，同时caspase-3和TUNEL荧光染色阳性率及平均荧光强度均显著升高，而应用Rp-cAMP后细胞凋亡，且该作用是通过caspase-3信号转导途径实现的；（3）PKA的激活在缺氧诱导的神经元凋亡中起促发作用。