肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导喉癌凋亡的实验研究

目的:研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导喉鳞状细胞癌Hep-2细胞凋亡的作用机制。方法:应用不同浓度的TRAIL作用于喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,应用噻唑蓝比色法绘制细胞的生长曲线,计算生长抑制率;应用流式细胞仪检测细胞凋亡率;应用透射电镜观察细胞的微观形态学改变。结果:TRAIL能抑制体外培养的喉癌Hep-2细胞生长,其抑制作用存在着明显的浓度依赖性,随着TRAIL浓度的不断增加,喉癌Hep-2细胞的生长抑制率也增加,经TRAIL(100μg/L)处理24h,喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长抑制率达到(62.75±1.00)%。流式细胞仪检测结果显示喉鳞状细胞癌Hep-2细胞凋亡发生率随TRAIL浓度增加而明显增加,在TRAIL浓度为1、10、100μg/L时凋亡发生率分别为(11.49±0.36)%、(22.31±0.82)%和(59.64±1.10)%,与对照组凋亡发生率为(3.13±0.12)%相比,差异均具有统计学意义(均P<0.01)。透射电镜观察发现,应用100μg/L TRAIL处理后的Hep-2细胞发生凋亡改变,可见细胞出现核碎裂,核仁消失,染色质固缩,电子密度增高,线粒体肿胀...     

靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响

目的观察赛来昔布靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响。方法用不同浓度的赛来昔布处理喉癌细胞Hep-2,通过MTT法检测赛来昔布对喉癌细胞的生长抑制率的影响。用浓度为15μmol/L的赛来昔布处理Hep-2细胞,通过流式细胞学检测药物处理前后细胞周期、凋亡率的差异,运用Western blot检测药物处理前后相关蛋白EGFR和COX-2表达的差异。结果赛来昔布处理后的Hep-2细胞与药物浓度成比例地出现生长抑制率增高;赛来昔布干预组细胞G1期比例大于对照组（P〈0.01）,凋亡率明显升高（P〈0.05）;与对照组相比,赛来昔布干预组出现明显的p-EGFR,COX-2表达降低（P〈0.05）。结论赛来昔布能抑制喉癌细胞株Hep-2生长,增加Hep-2细胞G1期阻滞,降低肿瘤细胞增殖能力和诱导细胞凋亡;赛来昔布可抑制喉癌细胞COX-2的表达和EGFR的磷酸化。提示COX-2抑制剂可能作为喉癌靶向治疗的新方法。     

肺腺癌转移相关转录本-1沉默对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的　探讨RNA干扰技术（RNAi）沉默肺腺癌转移相关转录本-1（MALAT-1）基因对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路影响。方法  体外培养人喉癌细胞Hep-2、正常永生化表皮细胞Hacat,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中MALAT-1mRNA表达水平。采用RNAi技术将MALAT-1阴性对照质粒、si-MALAT1分别转染至Hep-2细胞,命名为si-NC组、si-MALAT1组,未处理组作为空白对照组,分别检测三组Hep-2细胞中MALAT-1及B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bax、caspase-3 mRNA表达水平、Bcl-2、Bax、caspase-3、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）及其磷酸化蛋白（p-PI3K）、Akt及其磷酸化蛋白（p-Akt）蛋白表达情况以及细胞增殖及凋亡情况。结果　与正常细胞相比,喉癌Hep-2细胞中MALAT-1 mRNA表达水平（3.24±1.02）升高（P＜0.05）;与空白对照组、si-NC组相比,si-MALAT-1组Hep-2细胞中MALAT-1 mRNA表达水平（0.47±0.08）及Bcl-2 mRNA（0.56±0.09）及蛋白（0.31±0.05）表达降低,细胞增殖抑制率及凋亡率[（20.48±3.41）%]均升高,Bax、caspase-3mRNA（3.02±0.50、2.58±0.43）及蛋白表达（0.86±0.14、0.94±0.16）均升高,p-PI3K、p-Akt蛋白表达（0.57±0.10、0.51±0.08）均降低（P 均＜0.05）。结论　MALAT-1沉默可抑制人喉癌细胞系Hep-2细胞增殖并提高其凋亡率,推测可能通过影响Akt信号通路诱导癌细胞凋亡。     

抑制水通道蛋白1对Hep-2细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察水通道蛋白1(AQP-1)对喉癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用MTT法、流式细胞仪及原位末端标记(TUNEL)法、免疫组织化学SABC方法多种技术分别检测AQP-1的抑制剂乙酰唑胺对细胞生长抑制率、凋亡率和细胞内AQP-1蛋白表达的影响。结果:乙酰唑胺在5×10-5mol/L浓度下对Hep-2细胞内AQP-1蛋白表达有明显的抑制作用,细胞生长抑制率和细胞凋亡率均随时间延长而增大,呈时间依赖性。并且TUNEL法检测的细胞凋亡率与免疫组织化学SABC方法检测的AQP-1蛋白抑制率呈明显正相关(r=0.784,P<0.05)。结论:乙酰唑胺在一定浓度下对AQP-1的抑制可显著诱导喉癌Hep-2细胞凋亡,提示AQP-1可能成为治疗喉癌新的靶点。     

喉癌细胞诱导活性T淋巴细胞凋亡的机制探讨

目的:观察人喉癌Hep-2细胞Fas和FasL的表达,探讨Fas/FasL途径在人喉癌细胞免疫逃避中的作用.方法:应用RT-PCR、流式细胞仪检测Hep-2细胞表面Fas/FasL的mRNA及蛋白表达;Hep-2细胞与Jurkat细胞共培养,MTT比色法描绘Jurkat细胞生长曲线,应用流式细胞术及Hoechst染色荧光显微镜观察及检测Jurkat细胞凋亡.结果:流式细胞仪检测Hep-2细胞表面Fas及FasL表达的平均荧光强度分别为32/91±5.6和25.57±7.1.Hep-2细胞(密度为1×109/L)分别与Jurkat细胞(密度为1×108/L、5×108/L)共培养24 h,流式细胞仪检测Jurkat细胞凋亡率为(38.95±0.11)%和(13.28±0.14)%.而Jurkat细胞单独培养的凋亡率为(7.53±0.17)%.MTT比色法检测显示共培养后Jurkat细胞生长受到明显抑制;当共培养体系中加入FasL中和性抗体后,Jurkat细胞凋亡率显著下降(P<0.01).结论:人喉癌细胞株Hep-2表面表达的FasL通过诱导活化T淋巴细胞Jurkat细胞产生凋亡而使肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视.     

肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体与放化疗联用对喉癌细胞的协同杀伤效应及机制

目的 探讨人喉癌Hep-2细胞对肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)诱导凋亡的敏感性,TRAIL与顺铂、紫杉醇、放射线联合应用对Hep-2细胞的杀伤效应及其调控机制.方法 采用活细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测TRAIL、顺铂、紫杉醇对Hep-2细胞的生长抑制率以及caspase-8、caspase-9抑制剂对其作用的影响;流式细胞仪检测Hep-2细胞凋亡率及TRAIL受体表达量;蛋白质印迹法检测联合用药后caspase-8、caspase-9、caspase-3及TRAIL受体表达变化.结果 TRAIL对Hep-2细胞的24 h半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为596.92μg/L;顺铂、紫杉醇、放射线分别与TRAIL联合应用时Hep-2细胞凋亡率显著高于单药应用(P值均<0.05);caspase-9抑制剂Z-LETD-FMK使TRAIL、顺铂、紫杉醇对Hep-2细胞的生长抑制率显著下降(P值均<0.05);联合用药组caspase-8、caspase-9表达量显著升高,TRAIL死亡受体(DR4,DR5)表达量显著上调(P值均<0.05).结论人喉癌Hep-2细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡不敏感,TRAIL通过内源性途径诱导Hep-2细胞凋亡;TRAIL死亡受体的表达上调可能增强了Hep-2细胞对TRAIL的敏感性,可能是联合用药对Hep-2细胞发挥协同效应的重要机制.喉肿瘤;癌,鳞状细胞;TNF相关凋亡诱导配体;细胞凋亡;药物协同作用;     

TrkB通过调控PI3K/AKT途径诱导喉癌Hep-2细胞上皮间质化发生的作用机制研究

目的　观察TrkB如何通过PI3K/AKT通路诱导喉癌Hep-2细胞上皮间质化发生的作用机制并探讨其意义。方法　分别用含0、100、500、1000 nmol/L抑制剂K252a作用于Hep-2细胞,CCK-8法检测细胞的增殖活性,划痕法检测细胞的迁移能力,Transwell小室法检测细胞的侵袭能力,同时用Western-blot检测Hep-2细胞中p-Akt、p-c-Src、E-cadherin蛋白的表达情况。结果 100 nmol/L组在各时间点对Hep-2细胞增殖的抑制率分别为17.8%、20.5%、19.7%;500 nmol/L组在各时间点对Hep-2细胞增殖的抑制率分别为48.2%、46.8%、45.9%;1000 nmol/L组在各时间点对Hep-2细胞增殖的抑制率分别为51.3%、83.0%、81.5%;K252a（1000 nmol/L）组迁移率及穿膜细胞数分别为21%及46,对照组迁移率及穿膜细胞数分别为69%和221,差异均具有统计学意义（t =1.235、t =3.416,P 均<0.01）;与对照组比较,K252a（1000 nmol/L）组Hep-2细胞中p-Akt及p-c-Src蛋白表达量显著降低,分别为0.93±0.12、0.21±0.05、0.72±0.09、0.14±0.02,差异均有统计学意义（t =3.578、2.634,P 均<0.01）;且对照组中E-cadherin蛋白表达量为0.14±0.02,K252a（1000 nmol/L）组Hep-2细胞中E-cadherin蛋白表达量为0.75±0.08,差异有统计学意义（t =2.852,P <0.01）。结论 TrkB可能通过激活PI3K/Akt信号通路来诱导喉癌细胞EMT的发生。     

人喉癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的:探讨紫杉醇诱导筛选的喉癌Hep-2耐药细胞的多药耐药特性,为逆转喉癌的多药耐药提供理论依据。方法:以浓度逐渐递增法诱导筛选喉癌Hep-2细胞的耐药细胞株Hep-2T,比较2种细胞的形态和倍增时间。以ATP酶检测法确定细胞的IC50和细胞的耐药倍数。流式细胞仪检测2种细胞的周期分布情况、细胞凋亡以及2种细胞内的罗丹明聚集情况。以实时定量RT-PCR法检测MDR1和MRP1基因,Western-botting法检测相应的蛋白表达情况。结果:耐药细胞株的耐药倍数是非耐药株的104倍。耐药株对多柔吡星、吉西它宾、5-Fu及顺铂的耐药倍数分别是非耐药株的46.78,1.95,2.50和1.05倍。与非耐药株比,耐药细胞G0/G1期的细胞较后者升高(P<0.05),而G2/M和S期细胞则较后者明显降低(P<0.05)。当作用于Hep-2的IC50浓度时,Hep-2细胞的凋亡细胞数较Hep-2T明显高。罗丹明染色显示,Hep-2细胞内的罗丹明较Hep-2T明显增高。Hep-2T细胞MDR1/GAPDH表达在基因和蛋白水平明显高于Hep-2细胞。MRP1/GAPDH在基因和蛋白水平的表达前者亦高于后者,但增高程度不如MDR1/GAPDH明显。结论:在寻找逆转喉癌多药耐药的方法时,应着重于MDR1/P-gp,当应用化疗药时,应考虑非P-gp作用底物的药物。并选择应用周期特异性作用的药物。     

质粒载体介导CD基因对喉癌细胞的杀伤作用研究

目的构建含酵母菌自杀基因CD的质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,并利用该载体进行喉癌Hep-2细胞株转染研究,体外实验观察前体药物5-FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞株的杀伤作用.方法通过RT-PCR从酵母菌RNA内扩增出CD基因全长CDS序列,将其定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV中,重组体质粒经XhoI/HindⅢ双酶切鉴定,并对重组体中的CD基因片段进行序列分析,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD运用电穿孔法转入喉癌Hep-2细胞中.经300～600 μg/mlG418正筛选14 d和10 μg/ml前体药物5-FC负筛选,获得稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞株,提取该细胞株细胞的总RNA,经RT-PCR鉴定CD基因的表达.MTT法观察不同浓度5-FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞及转染空白载体pcDNA3.1(-)CMV的对照组喉癌Hep-2细胞的杀伤作用.结果阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD经XhoI/HindⅢ双酶切后获得5353 bp的片段及496 bp的插入片段,DNA自动序列分析证明重组体质粒含完整的477 bp长的CD基因CDS序列.RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出453 bp的预期片段.当添加不同浓度的5-FC时,表达CD基因的Hep-2细胞不同程度地被杀死,而对照组的细胞几乎未受到影响,两组细胞的相对生存率具有显著差异性(P<0.05).结论成功构建了质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,建立了稳定表达酵母菌CD基因的喉癌表达CD基因的Hep-2细胞株,表达CD基因的Hep-2细胞可以被5-FC杀死.     

沉默survivin抑制喉癌细胞Hep-2生长的实验研究

目的 探讨沉默survivin对喉癌细胞Hep-2生长的影响.方法 将重组质粒(psi-survivin)和阴性对照质粒(psi-scramble)用脂质体包裹转染人喉癌细胞株Hep-2,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)从mRNA和蛋白水平检测survivin的表达.四甲基偶氮唑蓝(MTT)观察喉癌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.建立裸鼠喉癌移植瘤模型,将psi-survivin和psi-scramble注射于肿瘤周围,观察其抗肿瘤的效果.免疫组化法和Western blot法检测重组质粒对肿瘤Survivin蛋白表达的影响.末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术(Tunel)观察肿瘤细胞的凋亡.结果 psi-survivin不仅在mRNA水平(抑制率为54.4%),而且蛋白水平也抑制Survivin表达,抑制率为37.0%.MTT证实psi-survivin明显抑制喉癌细胞的增殖,抑制率达71.7%.流式细胞仪结果显示psi-survivin组细胞凋亡明显增加,凋亡率达(13.05±0.56)%((-x)±s,下同).体内实验表明,质粒注射后第32天,盐水组瘤体积为(1443.9±230.5)mm3,psi-scramble组为(1348.5±198.4)Rim3,而psi-survivin组为(624.6±188.4)mm3,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-5.917,P＜0.01).psi-survivin能明显抑制肿瘤survivin的表达,抑制率为41.8%,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-80.343,P＜0.01).Tunel染色结果显示psi-survivin组肿瘤组织中出现较多凋亡细胞,而对照组未见凋亡细胞.结论 沉默survivin能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长.     

丙戊酸钠对Hep-2细胞增殖和凋亡的影响及机制的研究

目的:探讨丙戊酸钠(VPA)对体外培养的人喉癌Hep-2细胞凋亡的影响及其机制。方法:不同浓度VPA处理人喉癌Hep-2细胞不同时间后,采用MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测凋亡率,RT-PCR检测凋亡抑制蛋白Survivin mRNA表达的变化。结果:VPA对人喉癌Hep-2细胞的生长具有明显的增殖抑制作用,其作用表现为剂量依赖性和时间依赖性(P<0.01)。流式细胞仪检测发现:以3 mmol/L的VPA处理Hep-2细胞后,其凋亡率呈时间依赖性上升(P<0.01)。RT-PCR检测发现人喉癌Hep-2细胞Survivin mRNA表达呈时间依赖性下调(P<0.01)。结论:VPA对人喉癌Hep-2细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用,其作用机制与下调Survivin表达比例有关。     

榄香烯联合热疗对Hep-2细胞周期进程及凋亡率的实验观察

目的观察榄香烯联合热疗对体外培养的Hep-2细胞株（人喉癌细胞株）增殖抑制作用。方法应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同组别对Hep-2细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测Hep-2细胞周期进程的变化及凋亡率,透射电子显微镜观察Hep-2细胞亚细胞水平变化。结果单纯榄香烯组、单纯热疗组及榄香烯联合热疗组,对Hep-2细胞增殖抑制率分别为28.8%、25.7%和47.1%,榄香烯联合热疗组能显著提高Hep-2细胞增殖抑制率。细胞周期进程发生明显改变：G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,凋亡率上升。透射电子显微镜下可见线粒体肿胀,核染色质趋边凝集及凋亡小体。结论榄香烯联合热疗能够抑制Hep-2细胞增殖,抑制Hep-2细胞G1期向S期转化进程,诱导Hep-2细胞凋亡。     

葫芦素B对喉癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:体内外观察葫芦素B对人喉癌细胞系Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用并探讨其作用机制,为临床应用提供实验依据.方法:用0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24、48和72 h, MTT法检测细胞增殖.用0.1、1.0和10.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24 h或10 μmol/L葫芦素B作用8、12和24 h,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,荧光显微镜观察细胞凋亡.Western blot检测p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.建立喉癌裸鼠移植瘤模型,观察葫芦素B的体内抑瘤作用.结果:MTT结果显示葫芦素B对Hep-2 细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测发现随着葫芦素B浓度增高或作用时间延长,处于G2/M期细胞的比例逐渐升高,同时伴有G0/G1期细胞减少,细胞凋亡率逐渐升高,经统计学分析,各实验组之间及其与对照组之间的均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);荧光显微镜观察可见典型细胞凋亡;Western blot检测显示葫芦素B可剂量依赖性抑制p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.体内实验发现低、中、高剂量组的抑瘤率分别是32.43%、43.24%和70.27%.结论:葫芦素B通过抑制STAT3活化,抑制cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达,引起喉癌细胞G2/M期阻滞、增殖抑制和凋亡,发挥对喉癌的抗癌效应.     

草苁蓉多糖提取物对喉癌细胞增殖、迁移及程序性死亡分子1/程序性死亡配体-1水平的研究分析#br#

目的　探究草苁蓉多糖提取物（BRP）对喉癌细胞增殖、迁移及程序性死亡分子1（programmed death-1receptor,PD-1）/程序性死亡配体-1（programmed cell deathligand1,PD-L1）水平的影响。方法 人喉癌Hep-2细胞分组,根据BRP浓度分为YY组（100 mg/L）、EY组（200 mg/L）、SY组（400 mg/L）及WY组（无药物干扰）。采用qRT-PCR、克隆、MTT法、Transwell小室及Western blot检测检测4组Hep-2细胞中的PD-1/PD-L1 mRNA表达、细胞复制、细胞活力、迁移能力及PD-1/PD-L1蛋白变化。结果　WY组Hep-2细胞表现为船形,生长较快,细胞分布密集。YY组细胞生长速度减慢,EY组/SY组细胞体积缩小、固缩及碎裂。YY组、EY组、SY组Hep-2细胞抑制率升高,克隆细胞及迁移数量均降低,相比WY组有差异（P 均<0.05）;相比WY组,YY组、EY组、SY组Hep-2细胞中的PD-1/PD-L1表达均降低（P 均<0.05）。结论　BRP能够通过降低PD-1/PD-L1表达抑制Hep-2细胞增殖和迁移,并且药效的发挥随时间和浓度增加而增大。     

RNAi沉默SOX2表达增强Hep-2化疗药物敏感性作用研究

目的：研究SOX2表达对人喉癌上皮细胞Hep-2化疗敏感性的影响。方法：设计合成RNAi-SOX2序列,瞬时转染Hep-2细胞,Westernblot法筛选沉默效率最好的RNAi-SOX2构建pGCsi-H1-SOX2质粒,并构建其对照质粒pGCsi-HI-NC,分别转染Hep-2细胞建立稳定沉默SOX2表达细胞株psiSOX2-Hep-2及其对照细胞株psiNC-Hep-2。CCK-8法检测SOX2表达沉默对Hep-2细胞对化疗药物敏感性的影响;Hoechst染色法检测SOX2表达沉默对化疗药物诱导Hep-2细胞凋亡的影响;Westernblot法检测SOX2表达沉默对凋亡相关基因Survivin、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3表达的影响。结果：成功获取SOX2表达沉默细胞株psiSOX2-Hep-2及其对照psiNC-Hep-2细胞株,与psiNC-Hep-2细胞相比,psiSOX2-Hep-2中SOX2表达下降78％。SOX2表达沉默后,psiSOX2-Hep-2细胞对5-FU和紫杉醇的敏感性均增强,psiSOX2-Hep-2细胞48h的IC50值分别下降到8．12ug／ml和5．16ug／ml;同时,psiSOX2-Hep-2细胞凋亡数增多;抗凋亡基因Survivin、Bcl-2表达下降明显,凋亡基因Bax、cleaved caspase-3表达显著上升。结论：RNAi沉默SOX2表达将显著增强人喉癌上皮细胞Hep-2对5-FU和紫杉醇的敏感性。     

Bmi-1基因RNAi对喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的:构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对喉癌细胞Hep-2增殖、侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL2GFP,构建Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1。实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测稳定转染vshRNA-Bmi-1后喉癌细胞中Bmi-1mRNA及蛋白的表达;克隆形成实验及小室侵袭实验检测喉癌细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:稳定转染vshRNA-Bmi-1后Hep-2细胞Bmi-1mRNA表达均明显下降,Hep-2细胞中Bmi-1蛋白表达明显下降。抑制率分别为79%及88%。Bmi-1干扰后Hep-2细胞增殖减慢、侵袭能力减弱。结论:成功构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1mRNA和蛋白在喉癌细胞Hep-2中的表达。Bmi-1基因的RNAi能抑制喉癌细胞Hep-2的增殖和侵袭能力。     

DRB对人喉癌Hep-2细胞系中PK-CK2 mRNA表达的影响及其与细胞凋亡的关系

目的探讨5,6-二氯-1--βD-呋喃核糖苯并咪唑(DRB)对人喉癌Hep-2细胞系中蛋白激酶CK2(PK-CK2)mRNA表达的影响及其与细胞凋亡的关系。方法不同浓度的DRB作用于人喉癌Hep-2细胞后,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平的变化,采用流式细胞术检测Hep-2细胞凋亡率的变化。结果随着DRB浓度的增加或作用时间的延长,Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平呈下降趋势,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),流式细胞术检测二倍体峰前出现凋亡峰,5、10、20、40、80μmmol/L DRB与Hep-2细胞共育2h后的细胞凋亡率分别为0.68%、1.17%、7.25%、10.40%、22.66%。结论DRB可下调Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平,诱导细胞凋亡,这些可能是DRB抗癌作用的重要机制之一。     

人喉鳞癌组织中c-myc蛋白的表达及c-myc siRNA下调喉癌Hep-2细胞中c-myc的表达对细胞增殖的影响

目的:检测喉鳞状细胞癌组织中c-myc的表达及利用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制喉癌Hew2细胞中c-myc的表达对细胞增殖及抗凋亡的影响,探讨在喉癌治疗中将c-myc作为基因治疗靶点的价值.方法:免疫组织化学法检测80例喉鳞状细胞癌和30例声带息肉组织中的c-myc和Rb蛋白的表达;利用RNAi技术将c-myc siRNA转染到喉癌Hep-2细胞中,Western Blotting法检测c-myc蛋白的表达,RT-PCR法检测c-myc mRNA的表达;MTT法检测转染c-myc siRNA 24、48、72 h后,或转染不同浓度的c-myc siRNA(25、50、75 nmol/L)培养72 h,或在转染后加入不同浓度的5-Fu培养48 h,细胞增殖情况;流式细胞仪检测c-myc siRNA与5-Fu联合应用对喉癌细胞凋亡的影响.结果:免疫组织化学结果显示c-myc蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达增强,Rb蛋白表达下降,二者存在负相关;Hep-2细胞转染c-myc siRNA后,c-myc蛋白和tuRNA的表达水平逐渐下调;MTT结果显示随着转染c-myc siRNA浓度的增加,Hep-2细胞的存活率受到明显的抑制,具有浓度依赖性;当转染c-myc siRNA(50 nmol/L)后Hep-2细胞的抑制效率随时间的延长而增加,具有时间依赖性;当联合使用5-Fu时,在同一浓度5-Fu作用下,转染c-myc siRNA组细胞的增殖活性明显受到抑制;凋亡检测结果显示,当c-myc siRNA与5-Fu联合使用时,可明显提高Hep-2细胞对5-Fu的敏感性,在较低剂量时凋亡细胞显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:喉鳞状细胞癌组织中存在c-myc的高表达,c-myc siRNA可以特异性地下调Hew-2细胞中c-myc的表达,抑制喉癌细胞的增殖,增加细胞对5-Fu的敏感性,表明c-myc或许可以成为喉癌基因治疗中一个重要的分子靶点.     

Stat3反义核苷酸通过调节凋亡相关因子诱导喉癌细胞凋亡

目的:探讨反义Stat3基因诱导喉癌细胞凋亡的机制。方法:将设计好的已证实能诱导人喉癌细胞凋亡的Stat3反义寡核苷酸序列,应用脂质体瞬时转染法转染人喉癌Hep-2细胞,应用Western blot、PCR检测Hep-2细胞中Bcl-2,Bax及C-Myc基因及蛋白的表达情况。结果:Western blot和RT-PCR结果显示转染Stat3反义寡核苷酸细胞组,Bax的表达随反义寡核苷酸浓度增加,表达增强,而Bcl-2及C-Myc的表达则减弱。结论:反义Stat3寡核苷酸通过上调Bax,下调Bcl-2及C-Myc基因表达来参与其诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡的过程。     

靶向封闭survivin诱导喉癌细胞凋亡及抑制其增殖的体外实验

目的：探讨靶向抑制survivin表达对喉癌细胞凋亡和增殖的影响。方法：构建survivin反义RNA表达载体。用脂质体转染技术将重组质粒转染人喉癌细胞株Hep-2,利用G418（300g／L的维持浓度）筛选,获得稳定转染株（HpEGFP／survivin）。用Western-blot检测survivin反义RNA封闭survivin后蛋白表达效果。吖啶橙染色和流式细胞仪、四唑盐（MTT）和软琼脂集落形成实验分别检测HpEGFP／surivin的凋亡和增殖状态的改变,并与Hep-2和转染空载体的细胞（HpEGFP-C1）进行比较。结果：Western-blot结果表明,构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制了Hep-2 survivin蛋白的表达。转染反义survivin RNA载体的HpEGFP／survivin较Hep-2和HpEGFP-CI凋亡增多,其凋亡率较空载体对照组增加1．81倍,而其增殖力下降（P〈0．01）,软琼脂集落形成能力也明显下降（Pd0．05）。结论：构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制survivin蛋白的表达,并拮抗了survivin基因的抗凋亡作用,抑制喉癌细胞体外增殖能力和生存能力。