慢病毒载体靶向介导p66shc基因沉默

目的：构建p66shc基因重组慢病毒表达载体,并将之转染至293T细胞,通过RNA干扰致使p66shc基因沉默,为进一步研究p66shc基因功能奠定基础。方法筛选3个RNA靶点,命名为p66shc‐shc1、p66shc‐shc2、p66shc‐shc3,与双酶切后的pLenR‐绿色荧光蛋白（GPH）（含有GFP表达）连接,转化入感受态的DH5α细胞,挑取阳性克隆测序正确后,与pRsv‐REV、pM‐Dlg‐pRRE、pMD2G一起转染293T细胞,于倒置荧光显微镜下检测GFP的表达,证实病毒包装成功。使用荧光定量PCR及Westernblot技术检测p66shc在基因及蛋白水平的表达,选取有效沉默p66shc基因的p66shc‐shc1靶点,为后续试验做准备。结果成功构建表达p66shc的shRNA慢病毒载体并转染至真核生物细胞内,通过荧光定量PCR及Westernblot技术检测其通过RNA干扰导致细胞内p66shc基因沉默。结论靶向表达p66shc的shRNA慢病毒载体,转染入真核生物细胞内可通过RNA干扰在分子及蛋白水平导致p66shc基因沉默。     

PCBP1 RNAi重组慢病毒包装及筛选其稳定感染的神经细胞系

目的 PCBP1是真核细胞内的一种桥梁蛋白,具有多种生物学功能。本研究以慢病毒质粒构建PCBP1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,并筛选其稳定感染的神经细胞系,为进一步通过该载体系统探讨PCBP1的具体功能提供有力手段。方法设计合成针对人及小鼠的PCBP1基因的siRNA茎环结构的正反义序列,退火形成双链,与pLenti-Lox3.7载体的双酶切产物连接,以质粒PCR、酶切和DNA测序等方法,对重组克隆进行鉴定以确认目的片段的插入。之后,采用脂质体转染,将慢病毒载体系统的核心载体pLentiLox3.7和包装质粒共转染293T细胞,收获病毒颗粒,分别感染SH-SY5Y细胞,再通过流式分选获得感染不同病毒颗粒的细胞,提取RNA检测PCBP1 mRNA水平。结果检测结果显示PCBP1 siRNA茎环结构序列正确插入pLentiLox3.7载体,并且成功构建PCBP1基因敲低的神经细胞系。结论 PCBP1基因siRNA表达载体及其基因敲低稳定细胞系的成功构建,为进一步研究该基因在相应细胞中的功能奠定了基础。     

慢病毒载体介导的人肝癌HepG2细胞BC047440基因沉默

目的构建BC047440基因RNAi慢病毒干扰载体,并检测其对人肝癌细胞系HepG2细胞中BC047440基因的沉默效果。方法针对已经筛选确定的BC047440基因RNAi有效靶序列,合成BC047440基因特异性shRNA序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-iRNA载体连接产生pFU-GW-shBC047440慢病毒载体,PCR、DNA测序鉴定阳性克隆。用脂质体转染法将pFU-GW-shBC047440、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞,产生具备感染能力的慢病毒。以293T细胞中绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度,并测定其对人肝癌细胞株HepG2细胞最适感染复数(MOI)。以最适MOI感染HepG2细胞,分BC047440-shRNA组、control-shRNA组和HepG2组;RT-PCR和Western blot检测各组细胞BC047440 mRNA及蛋白的表达差异。结果经PCR鉴定,成功构建BC047440基因RNAi慢病毒载体。测定慢病毒滴度为5×108TU/ml,其在HepG2细胞中最适MOI为20;RT-PCR和Wes...     

CD47-shRNA慢病毒载体构建及其介导Hep-2细胞CD47基因沉默效应鉴定

目的构建CD47靶向shRNA慢病毒干扰载体,并观察其对Hep-2细胞CD47基因的抑制效应。方法设计CD47靶点特异性的寡核苷酸序列,利用酶切反应合成含特异性系列线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒并行滴度测定,再转染人喉癌Hep-2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western Blotting检测重组慢病毒对CD47靶基因在mRNA和蛋白水平上的沉默抑制情况。结果阳性克隆PCR及测序证实针对CD47基因shRNA慢病毒干扰载体构建成功,RT-PCR及Western Blotting检测载体在mRNA和蛋白水平上可抑制喉癌Hep-2细胞的CD47表达。结论成功构建针对CD47基因的慢病毒干扰载体,为进一步行喉癌CD47基因功能研究提供了较好的实验工具。     

慢病毒载体介导RNA干扰抑制大肠癌细胞HT29的酪氨酸激酶受体RON基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)对大肠癌细胞RON基因的干扰效率,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株。方法应用实时聚合酶链反应(PCR)检测大肠癌细胞DLD-1、HCT116、LOVO、RKO、SW480、HT29的RONmRNA表达情况,筛选出表达丰度能满足RNAi的大肠癌靶细胞HT29。根据人RON基因序列,构建4种慢病毒载体质粒pGCSIL/RON-短发夹RNA(shRNA),转染包装细胞293T,获得4种重组慢病毒pGCSIL/RON-shRNA,分别感染HT29细胞。应用实时PCR检测各组HT29细胞RONmRNA表达情况,筛选出RON干扰效率最高的一种shRNA慢病毒载体质粒,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株HT29/RON-shRNA。结果 DLD-1、HCT116、RKO、SW480、HT29细胞RON表达丰度能满足RNAi的需要,选择HT29细胞作为RNAi的靶细胞。阴性对照病毒感染的细胞样品相对正常未感染病毒的细胞目的基因的相对表达水平为(94±5)%,RONshRNA-1靶点病毒感染的细胞为(86±5)%,RONshRNA-2靶点病毒感染的细胞为(67±6)%,RONshRNA-3靶点病毒感染的细胞为(63±6)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞为(30±8)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞的表达水平显著低于其他细胞(P值均<0.01),其对目的基因的沉默效果达到(70±8)%。结论慢病毒介导RNAi能显著抑制大肠癌细胞HT29的RON基因的表达,慢病毒载体介导的RNAi是一种高效的"基因沉默"的手段。     

慢病毒介导的稳定沉默MyD88基因的胰腺导管细胞株的建立

目的 建立稳定沉默髓样分化因子88基因(MyD88)的大鼠胰腺导管细胞株ARIP.方法 设计并构建编码MyD88 mRNA的短发卡样RNA(shRNA)质粒表达载体,并用三质粒包装系统包装成慢病毒,分别命名为Lenti-shMyD88-1和Lenti-shMyD88-2.将ARIP分为未处理组、Lenti-Non Ta...     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

慢病毒载体对HIF-2α基因沉默效率的研究

目的 构建有效抑制HIF-2α基因表达的siRNA序列,并找到最佳病毒载体浓度.方法 设计针对HIF-2α mRNA作用的4条siRNA的序列,分别插入慢病毒载体中,获得较高滴度的慢病毒后,运用RT-PCR和Werstern blot方法检测HIF-2α mRNA及蛋白质水平,筛选出对HIF-2α基因沉默作用较强的干扰序列及病毒载体剂量.结果 4条siRNA序列均能干扰HIF-2α基因表达,其中KD2序列对HIF-2α基因的干扰作用最强(P<0.05).两种不同剂量的慢病毒载体比较,高剂量慢病毒载体的干扰效果更明显(P＜0.05).结论 KD2序列能有效沉默HIF-2α基因;高剂量的慢病毒载体对HIF-2α基因的沉默效果更强.     

慢病毒RNAi载体的制备及滴度测定方法的建立

目的构建可用于神经系统基因功能研究和基因治疗的慢病毒RNAi载体系统,并建立一种方便、快捷的慢病毒滴度测定方法。方法三质粒系统：PLK0.1-puro、△8.2、水疱性口炎病毒G糖蛋白（VSV-G）共转染293T细胞,产生慢病毒RNAi载体颗粒,超速冷冻离心浓缩;将病毒颗粒进行系列稀释后感染Eca9706细胞,采用嘌呤霉素最小致死量筛选病毒感染细胞的方法,进行慢病毒滴度测定。结果完成了慢病毒RNAi载体的包装及浓缩,确定了嘌呤霉素对Eca9706细胞的最小致死浓度为2.7μg/ml,并应用该浓度测得病毒颗粒的滴度为10^7TU/ml。结论成功构建了一种慢病毒RNAi载体，并建立了一种可行的慢病毒滴度测定方法。     

慢病毒介导稳定敲低Smurf1细胞株的构建及对细胞迁移的影响

目的构建慢病毒介导稳定敲低Smurf1的HeLa和A549细胞株并检测敲低Smurf1细胞迁移的影响。方法将包装好的Smurf1敲低慢病毒感染HeLa和A549细胞,7 d后进行嘌呤霉素抗性筛选阳性细胞,Western blot和qPCR检测敲低效果,并进行Transwell检测Smurf1敲低对细胞迁移的影响。结果利用干扰慢病毒系统成功构建稳定敲低Smurf1的HeLa和A549细胞株,稳定敲低Smurf1抑制细胞的迁移速率。结论敲低Smurf1抑制细胞迁移。     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立

摘要：目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,
建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水
平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上
清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting 和Real-time
PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成
功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了
干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。
     

稳定沉默GLI1基因的人胰腺癌细胞株的建立

目的建立稳定转染GLI1siRNA表达质粒的人胰腺癌细胞株,并鉴定其干扰效率。方法采用荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测5株人胰腺癌细胞中GLI1基因的表达,筛选出GLI1基因表达量最高的细胞作为目标转染细胞。脂质体转染法将构建好的3个干扰质粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3分别转染入目标细胞,G418抗性筛选阳性克隆,荧光显微镜下观察转染效率。采用qRT-PCR法和蛋白质印迹法检测各组稳定转染细胞中GLI1mRNA及蛋白的表达水平,鉴定干扰效率。结果筛选出GLI1基因表达量最高的Panc-1细胞株作为目标转染细胞;3个干扰质粒均成功转染Panc-1细胞,G418筛选后获得稳定转染细胞Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3,荧光显微镜下可见3个质粒的转染效率均在80%以上;qRT-PCR及蛋白质印迹检测证实Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3细胞中GLI1mRNA和蛋白的表达水平均显著低于阴性对照质粒(Panc-1/siControl)转染细胞及空白对照细胞(P<0.05),其中Panc-1/GLI1siRNA-1细胞表达量最低。结论成功构建了稳定沉默GLI1基因表达的胰腺癌细胞株Panc-1/GLI1siRNA-1,为后续研究奠定了基础。     

Establishment and gene expression profiling of LKB1 stable knockdown lung cancer cell line

Background  Lung cancer is the leading cause of cancer-related death in China. Mutation analysis reveals that LKB1 inactivation is present in 30% of non-small-cell lung cancer (NSCLC), indicating its role as a tumor suppressor. However, the molecular mechanism is still not clear. Our study attempted to establish LKB1 stable knockdown NSCLC cell line, detect alterations in gene expression and identify the genes regulated by LKB1.

Methods  LKB1 stable knockdown H1299 cell line was established using a lentiviral short hairpin RNA. To identify the knockdown effect, LKB1 mRNA and protein expression level were evaluated with quantitative real-time PCR and Western blotting. We treated the cell lines with 2-deoxyglucose to determine if LKB1 protein function was impacted. Gene microarray analysis was performed to detect the gene expression alterations in LKB1 stable knockdown H1299 cells.

Results  LKB1 mRNA and protein expression were significantly suppressed in LKB1 stable knockdown H1299 cell line. 2-DG treatment had little impact on the phosphorylation of AMPK, which is the downstream target of LKB1, indicating the loss of function of LKB1. The microarray data showed that LKB1 knockdown resulted in expression alterations of 1243 kinds of genes, including those involved in cell migration, cell proliferation and cell apoptosis.

Conclusions  The establishment of LKB1 stable knockdown H1299 cell line provides us with a great tool to investigate various genes regulated by LKB1 through microarray. The discovery of cell proliferation and migration-related genes regulated by LKB1 is critical for unraveling molecular mechanisms of LKB1’s role in the development and metastasis of lung cancer.

     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

p53基因诱导表达可调控细胞系的构建

ｐ5 3基因是被广泛关注的抑癌基因 ,5 0 %以上人类癌症中都检测到ｐ5 3基因突变[1 ,2 ] 。ｐ5 3基因研究已取得很大进展 ,但有关其作用的具体生理生化通道还不十分清楚 ,解决这个问题的关键是进行ｐ5 3下游基因的克隆 ,了解下游事件 ,弄清信息传递途径。ｐ5 3基因过度表达导致细胞生长停滞或程序性死亡 ,很难获得足够的能表达ｐ5 3基因的细胞作为克隆其下游基因的材料。本研究采用哺乳动物基因诱导表达系统———Ｔｅｔ ＯｎＴＭ基因表达系统[3] ,构建ｐ5 3基因诱导表达可调控细胞系 ,为直接克隆ｐ5 3下游基因并对其功能研究奠定了基础。1　材料与方法1.1　材料　 (1)生物学材料     

稳定表达人CD14细胞系Hela-CD14的建立

目的:建立稳定表达人CD14分子的Hela-CD14细胞系,为研究CD14分子及CD14相关性疾病提供研究材料。方法:以人CD14mRNA为模板,通过RT-PCR法扩增CD14基因,T-A克隆后测序核实CD14基因序列。通过EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切和体外连接法将人CD14基因连接到真核表达载体pcDNA 3.1(+)中,通过转化、克隆得到阳性重组质粒pcDNA 3.1(+)/CD14。将pcDNA 3.1(+)/CD14转染人宫颈癌Hela细胞,经G418筛选、定量PCR(qPCR)和免疫荧光检测CD14基因和蛋白的表达,筛选出稳定表达人CD14阳性的Hela-CD14细胞系。结果:测序显示,扩增到的人CD14基因序列正确,双酶切质粒结果表明,CD14基因成功克隆到pcDNA 3.1(+)载体中;免疫荧光结果显示,人CD14主要以膜蛋白形式在Hela细胞上成功表达。结论:本研究建立了稳定的以膜蛋白形式表达人CD14抗原的细胞系Hela-CD14。     

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。     

定量诱导表达PRDM1永久细胞系的建立

目的建立可定量诱导表达PRDM1的永久细胞系,为进一步研究PRDM1的功能创建平台。方法将野生型PRDM1基因的cDNA全长克隆到pMEP4表达质粒中,电穿孔法将pMEP4-PRDM1瞬时转染到细胞系SALT3,经潮霉素B筛选后挑选可增殖的单克隆细胞并大量扩增,在不同浓度的硫酸镉（CdSO4）诱导下检测PRDM1蛋白的表达状况。结果成功构建了pMEP4-PRDM1表达载体,在最佳电穿孔条件下将其转染到SALT3细胞,经潮霉素B筛选后扩增出6个细胞克隆。CdSO4诱导后运用免疫印迹法验证了PRDM1蛋白的表达与诱导剂CdSO4存在量效关系。结论运用pMEP4载体可建立定量诱导表达目的基因PRDM1的永久细胞系,为进一步研究PRDM1的功能奠定了基础。     

稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株的建立

目的 建立稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株。方法 使用阳离子脂质体分别将真核表达载体pCMV-Cdx2-HA或空载体pCMV-HA转染至人胃癌细胞MGC-803中,G418筛选出阳性克隆后扩大培养。RT-PCR和Western Blot技术检测各组胃癌细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达情况,将挑选出的稳定株命名为MGC-803/Cdx2细胞（转染组）和MGC-803/EV细胞（空载体组）;流式细胞仪检测MGC-803细胞（未转染组）、MGC-803/EV细胞和MGC-803/Cdx2细胞的细胞周期和凋亡情况。结果 成功筛选出稳定过表达Cdx2基因的MGC-803胃癌细胞,即MGC-803/Cdx2细胞;与MGC-803细胞和MGC-803/EV细胞比较,MGC-803/Cdx2细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达明显增加（P<0.05）,而且细胞周期G0/G1期比例和凋亡率也明显增加（P<0.05）。结论 成功构建了稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株,而且Cdx2过表达使细胞周期停滞、凋亡增加。