良性胆管狭窄形成机制的研究

目的 探讨良性胆管狭窄的形成机制。方法 用28只犬建立犬胆总管损伤修复的动物模型,分别于术后3d、1周、3周、3月、6月取材行光镜、电镜观察及免疫纵化观察巨噬细胞、转化生长因子（TGF-β1）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在胆管愈合过程不同时期组织中的表达强度、阳性细胞数和组织分布。结果 光镜及电镜显示:在整个胆管修复过程中炎性渗出期较长,胆道粘膜上皮愈合较慢,瘢痕组织细胞持续增生活跃,细胞外基质过度沉积,胶原纤维排列致密杂乱。肌成纤维细胞（MFB）功能活跃,持续存在于整个愈合过程中。免疫组化:巨噬细胞、TGF-β1、α-SMA在胆管愈合过程中表达较强,且持续较长时间。MΦ阳性主要表达于胆道粘膜下固有层;TGF-β1主要表达于肉芽组织、成纤维细胞、MΦ由及血管内皮细胞胞浆和细胞膜;α-SMA表达于MFB胞浆、平滑肌组织。MΦ、TGF-β1及α-SMA的表达呈正相关。结论 ①胆管愈合方式属于过度愈合。②肌成纤维细胞功能活跃,持续存在,是导致胆管瘢痕性挛缩的重要原因。③MΦ、TGF-β1及α-SMA高表达是造成胆管愈合过程中成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质过度沉积、胆管瘢痕性挛缩的重要因素。     

良性胆管狭窄形成机制的实验研究

目的：探讨良性胆管狭窄形成机制。方法：通过制作犬胆管损伤修复模型,术后采用免疫组化SP法法对巨噬细胞（MΦ）、TGF－β1及α－SMA在胆管愈合过程不同时期组织中的表达和分布进行研究。结果：MΦ、TGF－β1及α－SMA愈合过程中表达较强,且持续较长时间。MΦ阳性表达于粘膜固有层;TGF－β1主要表达于肉芽组织、成纤维细胞、MΦ及血管内皮细胞。α－SMA表达于肌纤维细胞胞浆。结论：MΦ、TGF－β1及α－SMA高表达是造成胆道愈合过程成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质过度沉积、胆道瘢痕性挛缩的重要因素。     

良性胆管狭窄形成机制的研究

目的：探讨良性胆管狭窄的形成机制。方法：用28只犬建立犬胆总管损伤修复的动物模型，分别于术后3d、1周、3周、3月、6月取材行光镜、电镜观察及免疫组化观察巨噬细胞、转化生长因子（TGF-β1）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在胆管愈合过程不同时期组织中的表达强度、阳性细胞数和组织分布。结果：光镜及电镜显示：在整个胆管修复过程中炎性渗出期较长，胆道粘膜上皮愈合较慢，瘢痕组织细胞持续增生活跃，细胞外基质过度沉积，胶原纤维排列致密杂乱。肌成纤维细胞（MFB）功能活跃，持续存在于整个愈合过程中。免疫组化：巨噬细胞、TGF-β1）、α-SMA 在胆管愈合过程中表达较强，且持续较长时间。Mφ阳性主要表达于胆道粘膜下固有层；TGF-β1主要表达于肉芽组织、成纤维细胞、Mφ及血管内皮细胞浆和细胞膜；α-SMA 表达于MFB胞浆、平滑肌组织。Mφ、TGF-β1及α-SMA的表达呈正相关。结论：①胆管愈合方式属于过度愈合。②肌成纤维细胞功能活跃，地、持续存在，是导致胆管瘢痕性挛缩的重要原因。③Mφ、TGF-β1及α-SMA高表达是造成胆管愈合过程中成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质过度沉积、胆管瘢痕性挛缩的重要因素。     

巨噬细胞及转化生长因子-β1在肝外胆管损伤修复过程中的表达及其意义

目的　观察巨噬细胞 (MΦ)及转化生长因子 β1(TGF β1)在胆道愈合过程中的表达和分布 ,探讨其在良性胆管狭窄形成过程中的作用及意义。方法　通过制作犬胆管损伤修复模型 ,术后分为 1周组、3周组、3个月组、6个月组。采用免疫组织化学过氧化酶标记的链霉卵白素 (SP)法对MΦ、TGF β1在各组中的表达和分布进行研究。结果　MΦ 1周时表达 ,与其他各期比较差异有显著性(P <0 .0 5 ) ,3周～ 6个月表达差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;TGF β1愈合过程中持续表达较强 ,各期比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。MΦ主要表达于粘膜固有层 ;TGF β1主要表达于肉芽组织、成纤维细胞、MΦ及血管内皮细胞。结论　MΦ、TGF β1高表达是造成胆道愈合过程成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质过度沉积、瘢痕增生的重要因素。     

FAK对增生性瘢痕成纤维细胞中信号转导因子表达的影响

目的了解FAKSiRNA对于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞中与瘢痕增生相关因子整合素α1、TGF-βR、黏着斑激酶（Focalad hesivekinase，FAK）及α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α—SMA）表达的影响，探索治疗增生性瘢痕的基因治疗方法。方法设计特异性探针合成FAKSiRNA片段，脂质体法转染体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，并用荧光定量PCR法（FO—PCR）检测、比较转染前后成纤维细胞内以上各因子的mRNA表达量的变化。结果转染48h后，FAK mRNA、整合素α1 mRNA、TGF—BR mRNA、α-SMA mRNA的表达明显下降（P〈0．05）。结论FAK SiRNA可能通过抑制增生性瘢痕成纤维细胞中整合素α1、TGF—βR、FAK和α-SMA的表达，从而抑制瘢痕的增生与挛缩。     

增生性瘢痕中CD90表达与TGF-β1和α-SMA表达的相关性分析

目的 研究CD90、转化生长因子β1(TGF-β1)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在增生性瘢痕中的表达,并分析CD90表达与TGF-β1、α-SMA表达的相关性.方法 自2008年9月至2009年6月,随机选取18例增生性瘢痕患者,应用免疫组化技术分别检测CD90、TGF-β1、α-SMA在18例增生性瘢痕(A组)、18例增生性瘢痕与正常皮肤交界处(B组)、18例正常皮肤(C组)标本中的表达水平,并行统计学分析.结果 免疫组化结果 显示,CD90、TGF-β1、α-SMA在A、B组中有较高的阳性表达,两组相比其差异无统计学意义(P>0.05);而在C组中仅有少量的阳性表达,与A、B两组相比其差异均有统计学意义(P<0.05);统计显示,在A组中CD90的表达和与TGF-β1、α-SMA的表达具有显著正相关性.结论 CD90可能是瘢痕异常增生的特异表型,且CD90与TGF-β1、α-SMA在增生性瘢痕中存在一定的正相关性.     

瘢痕防治讲座(五)

6.3生长因子、生物活性因子与病理性瘢痕 6.3.1关于TGF-β的研究 (1)检测TGF-β1,2,3在增生性瘢痕(HS)和成熟瘢痕中的表达,发现在HS中TGF-β1,2、α-SMA(平滑肌肌动蛋白)均有较强表达,与成熟瘢痕有非常显著的差异;TGF-β3在成熟性瘢痕和女性患者以及病程1年以上的HS中有较强表达;结论:TGF-β1,2、α-SMA的表达与瘢痕的增生及挛缩有关,TGF-β3与瘢痕缓解有关.抑制TGF-β1,2或促进TGF-β3表达,有利于防止瘢痕增生和挛缩.     

人巨噬细胞极化对小鼠周细胞-肌成纤维细胞转分化的体外作用研究

目的探究巨噬细胞极化对周细胞-肌成纤维细胞转分化及移植肾间质纤维化形成中的作用。方法分别收集5例2010～2015年在南京医科大学第一附属医院确诊慢性移植物失功(CGD)受者的移植肾组织和正常肾组织(对照组), 采用常规染色和免疫荧光染色的方法检测M1型和M2型巨噬细胞在肾组织中的表达与分布, 并用聚合酶链式反应(PCR)法检测样本中CD68、CD206和iNOS mRNA;采用转化生长因子-β1(TGF-β1)体外刺激小鼠血管周细胞系, 采用免疫印迹、细胞荧光的方法检测周细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)的表达;分别构建血管周细胞与M1型或M2型巨噬细胞联合培养模型, 采用免疫印迹、细胞荧光、PCR等方法检测周细胞中α-SMA和PDGFR-β的表达。结果在CGD受者的移植肾组织中观察到显著的CD68+iNOS+的M1型巨噬细胞浸润, 而CD68+CD206+细胞未显著浸润, 且CD68、iNOS、CD206 mRNA在CGD组中的表达均高于对照组(P<0.05);在CGD移植肾组织中, α-SMA和PDGFR-β的蛋白表达升高(...     

TNF-α对兔胆管成纤维细胞P311/TGF-β1/α-SMA通路的影响及川芎嗪的干预作用

目的:探讨TNF-α对兔胆管成纤维细胞P311/TGF-β1/α-SMA通路的影响及川芎嗪的干预作用。方法:分离、培养正常家兔胆管成纤维细胞并鉴定,将胆管成纤维细胞分别给予TNF-α、TNF-α联合不同浓度的TMP(0.08、0.4、2.0 mg/m L)干预48 h,以无处理的胆管成纤维细胞为空白对照,用CCK-8法检测细胞增殖水平;real-time PCR检测细胞P311、TGF-β1、α-SMA m RNA表达;Western blot检测细胞TGF-β1、α-SMA蛋白表达。结果:与空白对照比较,胆管成纤维细胞经TNF-α处理后,增殖明显增强,P311、TGF-β1、α-SMA m RNA以及TGF-β1、α-SMA蛋白表达明显上调(均P0.05);TMP对TNF-α的上述效应有抑制作用,并且呈现浓度依耐趋势,其中0.4、2.0 mg/m L的TMP有明显作用(均P0.05)。结论:TNF-α可能通过调控P311/TGF-β1/α-SMA信号通路促进胆管成纤维细胞增殖,TMP能抑TNF-α对该通路的活化,故可能对良性胆道狭窄有防治作用。     

α—平滑肌肌动蛋白在瘢痕成纤维细胞中的表达

目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的诱导作用。方法 以5例增生性瘢痕为实验组,3例正常瘢痕为对照组,采用成纤维细胞二维培养和三维培养体系及LSAB免疫组织化学染色技术,观察在不同TGF-β1浓度作用下,来源于实验组和对照组的成纤维细胞表达α-SMA的情况。结果 实验组的成纤维细胞,三维培养体系中α-SMA含量明显低于二维培养体系,不同浓度TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-SMA的作用不同,以5ng/ml的TGF-β1作用最有效;与对照组的成纤维细胞相比,实验组的成纤维细胞在表达α-SMA方面,对TGF-β1的反应更为敏感。结论 在体外,TGF-β1诱导α-SMA在瘢痕成纤维细胞中的表达作用存在着浓度差异;实验组与对照组中的成纤维细胞在细胞性状方面存在差异,对TGF-β1敏感性不同;细胞外基质成分可能会降低TGF-β1的诱导作用,使α-SMA的表达减少。     

肌成纤维细胞在胆道愈合过程中的表达及意义

目的探讨肌成纤维细胞在医源性胆管狭窄形成过程中的作用及意义。方法通过制作犬肝外胆管损伤修复模型，分别于术后1周、3周、3个月、6个月取材行透射电镜观察和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫组织化学染色观察。结果肌成纤维细胞功能活跃，持续存在于整个胆道愈合过程，细胞外基质过度沉积。α-SMA表达于肌成纤维细胞胞浆，术后1周至6个月表达均较强,与正常对照比较差异有显著性（P<0.01）,术后各期表达差异无显著性（P>0.05）。结论肌成纤维细胞是导致胆道瘢痕性挛缩和管腔狭窄的主要原因。     

术后狭窄胆管转化生长因子-β1的表达及意义

目的　观察转化生长因子 β1(TGF β1)在术后狭窄胆道中的表达和分布 ,探讨其在良性胆管狭窄形成过程中的作用及意义。方法　采用免疫组织化学streptavidin biotincomplex(SABC)法检测了 12例术后 3～ 6个月狭窄胆道组织中TGF β1的的表达和分布情况 ,并与 5例正常胆道组织进行对照研究。结果　狭窄胆道组织中TGF β1主要表达于肉芽组织、成纤维细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞。正常胆管壁纤维组织表达较弱 ,阳性细胞均数为 12 .45± 6.2 4;TGF β1在术后狭窄胆道组织中的表达较强 ,本组 12例标本中 10例表达 ,2例表达 ,阳性细胞均数为5 9 .5 2± 8.3 3 ,与正常胆管比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。结论　TGF β1高表达是造成胆道狭窄过程中成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质过度沉积、瘢痕增生的重要因素。     

阿利吉仑抑制转化生长因子-β_1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用研究

目的探讨阿利吉仑对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导人近端肾小管上皮细胞(HKC)转分化的作用及其对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养HKC,然后分为4组。阴性对照组HKC未做任何处理,阿利吉仑组HKC以阿利吉仑(1.0×10~(-7)mmol/L)单独处理24 h,TGF-β_1组HKC以TGF-β_1(8 ng/ml)单独处理24 h,研究组HKC以同一浓度的TGF-β_1加阿利吉仑共同处理24h。应用免疫细胞组织化学、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察阿利吉仑对TGF-β_1诱导的HKC转分化的作用及对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、PDGF-BB、VEGF表达的影响。结果阴性对照组HKC有少量的PDGF-BB和α-SMA表达,有微量的VEGF表达。在TGF-β_1干预24 h后HKC有大量α-SMA、PDGF-BB的表达,与阴性对照组有显著差异(P0.05);有少量的VEGF的表达,与阴性对照组无差异(P0.05)。阿利吉仑单独作用于HKC 24 h后α-SMA、VEGF及PDGF-BB的表达与阴性对照组无显著差异(P0.05)。TGF-β_1加阿利吉仑组比TGF-β_1组诱导的HKCα-SMA、PDGF-BB的表达明显降低(P0.05),VEGF的表达无显著差异(P0.05)。结论 TGF-β_1诱导肾小管上皮细胞转分化24 h可使PDGF-BB的表达明显增加,但对VEGF无明显改变。阿利吉仑对TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞转分化可能通过下调PDGF-BB的表达起抑制作用,但对VEGF的影响尚不明确,为阿利吉仑在肾间质纤维化的临床应用提供理论依据。     

褪黑素对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的调控

目的 探讨褪黑素对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的调控.方法 分离培养增生性瘢痕成纤维细胞,采用四氮唑复合物/硫酸酚嗪甲酯(XTT/PMS)法检测细胞增殖活性,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中β1转化生长因子(TGF-β1)含量和荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原Ⅰ和胶原ⅢmRNA表达,评价褪黑素和褪黑素受体拮抗剂(luzindole)对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的影响.结果 褪黑素抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,抑制效果呈浓度依赖性(P＜0.05);高浓度褪黑素(10-3 mmol/L)可降低增生性瘢痕成纤维细胞产生TGF-β1 (P＜0.05)和α-SMA mRNA、胶原Ⅰ mRNA的表达(P＜0.05);褪黑素受体拮抗剂能阻断褪黑素对细胞产生TGF-β1和α-SMA、胶原Ⅰ mRNA表达的抑制作用(P＜0.05);但褪黑素对该细胞胶原ⅢmRNA表达无影响(P＞0.05).结论 褪黑素可通过与受体结合调控增生性瘢痕成纤维细胞的生物学活性.     

粘着斑激酶在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达和意义

目的探讨粘着斑激酶(FAK)在增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB)中的表达和意义。方法运用细胞免疫组化技术,测定HSFB和正常皮肤成纤维细胞(NSFB)中的FAK、整合素α1、转化生长因子受体1(TGF-βR1)及α肌动蛋白(α-SMA)的表达;同时将HSFB分别用抗FAK、整合素α1、TGF-βR1及α-SMA抗体进行阻断培养,并测定培养前后整合素α1、TGF-βR1、α-SMA及FAK的表达。结果与NSFB相比,HSFB中的FAK、整合素α1、TGF-βR1、α-SMA的表达增高,差异具有显著意义(P<0.05)。分别用抗整合素α1、TGF-βR1、α-SMA抗体进行阻断培养后,HSFB中的FAK表达下降(P<0.01);阻断FAK表达也可分别导致了整合素α1、TGF-βR1、α-SMA的表达降低(P<0.01)。结论FAK对整合素α1、TGF-βR1及α-SMA的蛋白合成具有重要的调控作用,与增生性瘢痕的发生、发展关系密切。减少FAK在成纤维细胞中的过度表达,可能是抑制瘢痕增生、软化瘢痕的新途径。     

β1转化生长因子对瘢痕成纤维细胞纤维粘连蛋白及其受体α5β1整合素表达的影响

目的　研究 β1转化生长因子 (TGF β1)对瘢痕成纤维细胞纤维粘连蛋白 (FN)及其受体α5β1整合素表达的影响 ,探讨TGF β1、FN及其受体α5β1整合素在增生性瘢痕形成发展中的作用。方法　采用细胞培养、ELISA法、免疫组织化学、图像分析技术 ,观察浓度分别为 0、5、10、2 5、5 0、10 0 μg/L的TGF β1作用下 ,瘢痕成纤维细胞FN及其受体α5β1整合素表达的变化。结果　TGF β1浓度在 10～ 5 0μg/L之间时 ,可明显刺激瘢痕成纤维细胞FN及其受体α5β1整合素的表达 ,与对照组相比较 ,两者差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ,其作用呈一定的剂量效应关系 ,随着TGF β1浓度增加 ,促合成作用也随之增加 ,浓度在 10 0 μg/L时 ,作用达到饱和。 结论　TGF β1作用下FN及其受体α5β1整合素在成纤维细胞中的过度表达可能与增生性瘢痕形成有关。     

TGF-β1及α-SMA在积水肾盂组织中的表达及其相关性研究

目的：检测转化生长因子β1(TGF-β1)和α－平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在肾积水肾盂肌层的表达，以探讨TGF－β1对积水肾脏的保护作用。方法：应用免疫组织化学方法对30例积水肾盂和5例正常肾盂标本进行染色观察。结果：积水肾盂标本TGF－β1和α-SMA的表达较正常肾盂标本均增高（P＜0．01），且二者存在显著正相关关系（γ=0.71,P＜0．05）。结论：TGF－β1通过促进肾盂肌层肥厚在肾积水的病理生理过程中发挥保护作用。     

胆管良性瘢痕组织中前列腺素F2α受体及前列腺素合酶2的表达及意义

目的探讨前列腺素F2α受体(PTGFR)和前列腺素合酶2(COX-2)在胆管良性瘢痕组织中的表达及意义,并研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对胆管成纤维细胞中PTGFR表达的影响。方法收集2008～2010年西安交通大学第一附属医院肝胆外科收治的18例肝外胆管瘢痕性狭窄患者的胆总管组织,另收集6例来自异体肝移植供体的正常胆总管组织作为对照。采用免疫组织化学SABC法分别检测PTGFR及COX-2在两种组织中的表达情况,然后用不同浓度(0、10、20及30ng/ml)TGF-β1作用于胆管成纤维细胞后24h,用半定量RT-PCR法以及ELISA法检测胆管成纤维细胞中PTGFR的mRNA及蛋白表达。结果 PTGFR和COX-2在胆管良性瘢痕组织中的表达阳性率分别为88.9%(16/18)和83.3%(15/18),正常胆总管组织中其表达阳性率分别为33.3%(2/6)及0(0/6),PTGFR及COX-2在前者均分别明显高于后者(P<0.05)。TGF-β1作用于胆管成纤维细胞后24h,随着TGF-β1浓度增高,可上调PTGFR mRNA及蛋白在胆管成纤维细胞中的表达,并且呈浓度依赖性(P<0.05)。结论胆管良性瘢痕组织中PTGFR和COX-2高度表达是造成胆管瘢痕过度增生的重要因素,TGF-β1可诱导胆管成纤维细胞中PTGFR的表达增高,并呈浓度依赖性,调节胆管瘢痕的形成。     

机械牵张力加载时间对诱导正常皮肤成纤维细胞向增生性瘢痕成纤维细胞转化过程的影响研究

目的:探究机械牵张力不同加载时间对诱导正常皮肤成纤维细胞(Normal skin fibroblasts,NSFB)向增生性瘢痕成纤维细胞(Hypertrophic scar fibroblasts,HSFB)转化的影响。方法:同一人体NSFB和HSFB分别设实验组和对照组,实验组加载0.1Hz、10%拉伸幅度的机械牵张力3d、5d、7d,对照组细胞均不加力。CCK-8法检测细胞增殖能力;SYBR Green q PCR法检测细胞p130Cas、Integrin-β1、转化生长因子-β_1(TGF-β_1)、Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)m RNA表达水平;ELISA法检测细胞上清液TGF-β_1和Ⅰ型胶原含量;Western-blot法检测细胞Integrin-β_1、p130Cas、α-SMA蛋白表达水平。结果:机械牵张力加载5d时,NSFB实验组与HSFB对照组比较,细胞增殖水平及p130Cas、Integrin-β_1、TGF-β_1、Ⅰ型胶原、α-SMA表达水平相近,差异均无统计学意义(P0.05);加载3d、7d时,以上指标检测结果差异显著,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:0.1Hz、10%拉伸幅度的机械牵张力加载5d可使NSFB表现出HSFB的部分生化特征,机械牵张力对NSFB向HSFB转化过程有明显的诱导作用。     

整合素和转化生长因子β受体在瘢痕组织中表达相关性的定量研究

目的　了解整合素与TGF - β受体在增生性瘢痕形成过程中的相互关系。 方法　采用荧光定量PCR法 ,分别测定经原代细胞培养后 ,瘢痕成纤维细胞中整合素α1、β1与TGF - βRmRNA的表达量 ,并对两者间的表达强度进行相关分析。结果　整合素α1和β1与TGF - βRⅠ间在表达的强度上 ,均成正 相关的关系 (r =0 .74、0 .6 8,P <0 .0 5 )。结论　整合素和TGF - β受体在瘢痕形成的过程中 ,可能存在着相互协同和促进的作用。