T淋巴细胞内mTOR/S6途径在难治/复发再生障碍性贫血发病机制中的作用

Objective To explore the activation status of signal pathway of mTOR/S6 in bone marrow(BM) T lymphocytes of refractory/relapsed aplastic anemia patients(AA),and the effects of rapamycin (RAPA)and CTLA-4 immunoglobulin(CTLA-4 Ig)on this pathway.Methods BM was collected from 13refractory/relapsed AA patients,8 newly diagnosed severe AA(SAA)patients and 10 iron deficiency anemia (IDA)(as controls)patients,and cocultured with RAPA and CTLA-4 Ig.The expression of p-mTOR,p-S6 and Interferon γ(IFN-γ)in CD3+ T cells was measured by flow cytometry(FCM).Results ①The expression of p-mTOR,P-S6 and IFN-γ in CD3+ T cells in refractory/relapsed AA group were significantly higher than those in controls(P＜0.01).②The expression of P-mTOR and p-S6 in T cels in newly diagnosed SAA group,Was similar to those in controls(P＞0.05),but significantly lower than those in refractory/relapsed AA group(P＜0.01).The expression level of IFN-γ in T cells were significantly higher than that in controls (P＜0.01).③On exposure to RAPA,The levels of p-mTOR,p-S6 and IFN-γ in T cells in refractory/relapsed AA patients were significantly lower than those before the exposure(all P＜0.05).And so were when exposed to CTLA-4 Ig(all P＜0.01).Conclusion ①The mTOR/S6 signal pathway is activated in refractory/relapsed AA.②The expression of p-mTOR,p-S6 and IFN-γ in refractory/relapsed AA Can be suppressed by RAPA or CTLA-4 Ig.③The signal pathway of CD28/mTOR/S6/IFN-γ might take part in immune pathogenesis of refractory/relapsed AA.     

氢离子通过mTOR通路抑制CD8tT细胞功能

摘要:目的探讨氢离子(H*)对 CD8*T细胞功能及哺乳动物雷帕霉素( Rapamyein )靶蛋白( mammalian target of rapamycin ,mTOR)信号通路的影响。方法通过磁珠分 选的方法从人外周血单个核细胞( PBMC)中分选出CD8*T细胞,流式细胞术检 测CD8*T细胞的百分比并验证其纯度。根据细胞培养基的不同pH值将培养基分为对照组(pH为7.2~7.4) 、pH 6.7组和pH6.5组。细胞计数法检测不同pH分组中CD8*T细胞的增殖能力。流式细胞术检测经PMA/离子霉素刺激后不同pH分组CD8*T细胞中细胞因子TNF-a和IFN-γ的表达水平,并进一步分析在Rapanycin作用下, CD8*T细胞中TNF-a、IFN-γ水平以及S6蛋白磷酸化水平。qRT-PCR 检测不同pH分组中CD8*T细胞TNF-a和IFN-y mRNA的表达水平。Western blot 检测不同pH分组CD8*T细胞中mTOR信号通路相关蛋白AKT和S6的磷酸化水平。结果pH6.7组和pH6.5组中CD8*T细胞的增殖能力显著低于对照组(P<0.05 ) ;CD8*T细胞内细胞因子TNF-a和IFN-Yy mRNA水平显著低于对照组(P<0.05),其蛋白质表达水平与对照组相比亦显著降低(P<0.05), mTOR信号通路相关蛋白AKT和S6的磷酸化水平显著低于对照组( P<0.05)。经Rapamyein作用后,pH 6.5+Rapamyein组中CD8*T细胞S6蛋白磷酸化水平以及细胞因子TNF-ax、IFN-γ的表达水平均显著低于对照+Rapamyein组(P<0.05)。结论H*可 抑制CD8*T细胞的功能,且与mTOR信号通路相关。     

病理性瘢痕中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/核糖体40S小亚基S6蛋白激酶的表达

背景:近年研究表明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(mammalian target of rapamycin/P70S6K,mTOR/P70S6K)信号通路在某些肿瘤形成过程中具有一定作用.病理性瘢痕特别是瘢痕疙瘩具有某些肿瘤的性质,因此该信号通路在病理性瘢痕形成中可能具有重要作用.目的:观察mTOR/P70S6K信号通路在病理性瘢痕中的的作用.方法:采用免疫组织化学SP法检测磷酸化mTOR/P70S6K(p-mTOR和p-P70S6K)在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、非病理性瘢痕及正常皮肤组织中的表达水平.实验所取瘢痕组织来自临床上诊断明确的瘢痕患者.结果:瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织中p-mTOR和p-P70S6K阳性表达率高于非病理性瘢痕及正常皮肤组(P＜0.05).p-mTOR和p-P70S6K表达呈正相关(r=0.482,P＜0.05).结果提示mTOR/P70S6K信号通路的激活参与了病理性瘢痕的形成过程,且mTOR和P70S6K之间具有协同作用.     

电针通过AKT/mTOR/P70S6K通路促进大鼠局灶脑缺血/再灌注大脑缺血皮质区血管再生的研究

目的:观察电针对大鼠局灶脑缺血/再灌注大脑缺血皮质区p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K表达及CD34~+微血管密度变化的影响,探讨电针促进大脑缺血皮质区血管再生的机制。方法:140只雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、模型+电针组(电针组)、模型+电针+哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)组(抑制剂组);采用线栓法制备SD大鼠右侧局灶脑缺血/再灌注模型,缺血2h后将假手术组、模型组、电针组和抑制剂组各分为再灌注12h、24h、48h、72h、7d五个亚组;取大鼠"百会"穴(GV 20)及左侧"四关"穴(合谷LI 4/太冲LR 3)为电针刺激穴位,刺激时间30min/次,每日1次,最长持续7d;采用Western Blot检测各组大脑缺血皮质区磷酸化的蛋白激酶B(p-protein kinase B,p-AKT)、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、磷酸化的核糖体蛋白S6乳激酶(p-ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)蛋白的表达水平;免疫组化法检测大脑缺血皮质区VEGFR2蛋白、CD34~+微血管血管的表达;Longa法检测神经功能。结果:与假手术组相比,模型组p-AKT蛋白的表达在24h、48h和72h增加(P0.05),模型组p-mTOR和p-P70S6K的蛋白表达在48h、72h和7d增加(P0.05),与模型组相比较,电针组各个时间点p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K蛋白的表达均显著增加(P0.01),在RAPA的作用下,抑制剂组中各个时间点p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K蛋白的表达明显低于电针组(P0.05);与模型组相比,电针组再灌注72h和7d大脑缺血皮质区VEGFR2蛋白、CD34~+微血管的表达明显增多(P0.01),与电针组相比,抑制剂组再灌注72h和7d大脑缺血皮质区VEGFR2蛋白、CD34~+血管减少(P0.05);与模型组和抑制剂组相比,电针组再灌注72h、7d神经功能评分明显改善(P0.05)。结论:电针可提高大鼠局灶脑缺血/再灌注大脑缺血皮质区p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K的表达,可能通过AKT/mTOR/P70S6K通路促进大鼠大脑缺血皮质区血管的再生和神经功能的恢复。     

再生障碍性贫血外周血Th17和CD4~+ CD25~+ Treg细胞表达情况研究

本研究旨在探讨成人再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)外周血Th17和CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表达情况。45例初发AA患者分为轻型AA(n=25)和重型AA(n=25)两组,15例正常人作为对照。应用流式细胞术检测AA患者外周血中Th17和CD4+CD25+Treg的比例,ELISA检测血清及刺激后外周血单个核细胞(PBMNC)上清液中的白介素(IL-17)、γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,并与正常对照组比较。结果表明:重型AA(SAA)组外周血Th17细胞比例,血清中IL-17及IFN-γ表达高于轻型AA(MAA)和正常人组,而重型AA组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例降低。与轻型AA和正常对照相比,重型AA患者单个核细胞培养后上清液中IL-17及IFN-γ表达水平显著增加。AA患者血红蛋白计数与Th17细胞及血清IL-17表达呈负相关,与CD4+CD25+Treg表达成正相关。结论:重型AA患者外周血Th17细胞应答增强,而CD4+CD25+Treg细胞缺乏,贫血的严重程度与外周血Th17/Treg免疫应答失衡密切相关。     

多发性骨髓瘤患者Treg细胞、Th17细胞及相关转录因子mRNA的表达及临床意义

目的:探讨多发性骨髓瘤(MM)患者外周血及骨髓中调节性T细胞(Treg细胞)和辅助性T细胞17(Thl7细胞)的比率及其相应特异转录因子Foxp3、RORγt的mRNA表达水平,分析Treg/Thl7平衡的临床意义。方法:将46例MM患者分为初发组(n=20)、平台期组(n=16)、复发/难治组(n=10),以健康体检者(n=20)为正常对照组。用流式细胞术检测研究对象外周血及骨髓中Treg细胞、Th17细胞占CD4~+T细胞的比率及Treg/Th17比值的变化;RT-PCR检测转录因子Foxp3及RORγt mRNA的表达水平;同时分析患者血清IL-6及CRP水平变化。结果:初发组及复发/难治组患者外周血和骨髓Treg细胞比率较正常对照组及平台期组患者升高(P0.05);初发组及复发/难治组患者外周血和骨髓中Th17细胞比率与正常对照组及平台期差异均无统计学意义。初发组及复发/难治组患者外周血和骨髓中Treg/Thl7比值高于平台期组及正常对照组(P0.05)。各组外周血及骨髓中Foxp3和RORγt mRNA的变化趋势与Treg/Thl7一致。MM患者血清中IL-6、CRP水平与外周血及骨髓中Treg/Thl7比值变化一致。结论:MM患者活动期外周血及骨髓中Treg/Thl7平衡向Treg倾斜,Foxp3表达水平升高;血清中IL-6、CRP水平与Treg/Th17比值变化趋势一致,可用于预测MM患者预后。     

系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞CD28/CTLA-4分子表达的研究

目的探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血淋巴细胞CD28/CTLA-4分子和CD28/CTLA-4mRNA的表达。方法研究对象为SLE患者49例(活跃期30例、缓解期19例)及对照组23例。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)经梯度密度离心法分离后分佛波醇乙酯(PMA)(10ng/ml)及伊屋诺霉素(500ng/ml)刺激组和不加刺激剂组两组培养。将PBMCs分别培养24、48、72及96小时。应用流式细胞计量术(flow cytometry,FCM)检测外周血淋巴细胞培养前后CD28及CTLA-4分子的表达。采用RT-PCR方法检测CD28mRNA和CTLA-4mRNA的表达。结果刺激前后SLE患者CD3+及CD8+T细胞上CD28分子表达量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。刺激前活跃期SLE患者CD3+T细胞上CTLA-4分子表达量较对照组明显降低[(0.78±0.51)%vs(1.34±0.76)%,P<0.05]。刺激后72小时SLE患者CD3+T细胞及CD8+T细胞上CTLA-4分子表达量仍低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。刺激前后PBMCs中CD28mRNA及CTLA-4mRNA表达情况与刺激前后CD3+T细胞上CD28及CTLA-4分子变化情况相似。刺激前SLE患者CD3+T细胞上CTLA-4分子表达量与SLE活动指数(SLEDAI)呈显著的直线负相关关系(P<0.001)。结论 SLE患者T细胞CTLA-4分子存在表达及上调机制障碍,提示CD28分子及CTLA-4分子存在功能失衡,这种失衡可能通过一定的机制参与SLE的发病过程。     

动脉粥样硬化患者单个核细胞Siglec-1在促进CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖和分泌细胞因子中的作用

目的 探讨动脉粥样硬化(AS)患者单个核细胞(PBMC)唾液酸黏附素(Siglec-1)在刺激白细胞分化抗原(CD)4+和CD8+T淋巴细胞活化增殖中的作用.方法 实验研究.用磁珠分离长征医院18例急性冠状动脉综合征(ACS)和41例稳定型心绞痛(SA)患者及32名健康对照者CD14阳性PBMC后,用不同浓度α-干扰素(IFN-α,0、2、5、10 ng/ml)刺激Siglec-1高表达,或用小干扰RNA或抗Siglec-1单抗靶向抑制Siglec-1表达,再与1名第三方健康献血者CD4 +/CD8+T淋巴细胞共培养5d.然后,将实验分为11组:健康人CD14(1组),健康人CD14+ IFN-α5 ng/ml(2组),健康人CD14+ IFN-Ω 5 ng/ml+ anti-Siglec-1 2 μg/ml(3组),ACS CD14(4组),ACS CD14+ siRNA干扰对照组(Mock,5组),ACS CD14+ siRNA 679 40 nmol/L(6组),ACS CD14+ anti-Siglec-1 2μg/ml(7组),SACD14(8组),SA CD14+ Mock(9组),SA CD14+ siRNA 679 40 nmol/L(10组),SA CD14+ anti-Siglec-12 μg/ml(11组);每组测定10份标本.用CCK-8活细胞计数试剂盒检测共培养T淋巴细胞增殖,用ELISA检测共培养T淋巴细胞分泌白细胞介素(IL)-2、IL-10、IL-12、γ干扰素(IFN-γ).测定各组PBMC刺激T淋巴细胞分泌细胞因子的计量数据用中位数(四分位数)表示,采用非参数秩和检验.结果 靶向阻断Siglec-1后(6组),PBMC刺激CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的增殖能力减弱,PBMC刺激CD4+T淋巴细胞分泌IL-2、IL-12、IFN-γ分别为67.00(62.50～ 87.30)、0.86(0 ～1.63)、47.82(37.60 ～ 56.67) pg/ml,且分泌能力减弱;IL-10为56.00(46.25 ～67.40) pg/ml,且分泌能力增强;未处理组(4组)上述细胞因子分别为213.70(187.50 ～ 275.30)、6.87 (4.90 ～8.93)、114.90(89.50～167.40)、21.08(15.70～33.20) pg/ml,二者差异有统计学意义(U值分别为8.50、17.00、8.50、87.50,P均＜0.05).当健康对照组单核细胞经IFN-α刺激上调Siglec-1表达后(2组),刺激CD4+T淋巴细胞分泌IL-2、IL-12、IFN-γ分别为220.44(174.30 ～ 312.30)、7.90 (6.540 ～10.40)、143.75(78.20～210.00) pg/ml,且能力增强;IL-10为21.95(16.30 ～25.00) pg/ml,而能力减弱,与1组比较,差异有统计学意义(U值分别为89.50、98.00、100.00、0,P均＜0.05).抑制或增强Siglec-1对CD8+T淋巴细胞分泌的上述细胞因子无影响(P均＞0.05).结论 IFN-α可刺激Siglec-1表达增加,Siglec-1可通过促进CD4+/CD8+T淋巴细胞增殖或CD4+T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子参与AS发病过程.     

IL-23在单纯疱疹病毒Ⅱ型致病中的作用

目的 探讨IL-23在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)致病机制中的作用.方法 应用ELISA法检测HSV病毒感染复发患者外周血IL-23、IL-12、IFN-γ、IL-14、IL-10水平,以及细胞培养液中IFN-γ水平,流式细胞仪检测记忆性CD4+T细胞表达IFN-γ的水平,同时设立健康对照组进行比较.结果 生殖器疱疹复发患者(RGH)组血清IL-23、IL-12、IFN-γ水平明显低于健康对照组,IL-14、IL-10水平明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.01);IL-23剂量依赖性诱导患者单个核细胞(PBMC)产生IFN-γ,并刺激记忆性CD4+T细胞表达IFN-γ.结论 IL-23等Th1型细胞因子在RGH患者体内水平低下,Th1/Th2平衡失调,机体不能有效抑制病毒,是导致病情反复的重要原因;IL-23可能在体内同样刺激T细胞产生IFN-γ,发挥抗病毒效力.     

环孢菌素A对慢性再生障碍性贫血患者T-bet、GATA-3、相关信号分子、细胞因子及Th1/Th2的影响

本研究探讨转录因子T-bet、GATA-3及相关信号通路在慢性再生障碍性贫血(CAA)免疫发病中的作用,从Th细胞失衡、转录因子及相关信号通路水平研究环孢菌素(CsA)治疗慢性AA的免疫调节机理。采用实时荧光定量PCR(real-time FQ-PCR)检测慢性AA患者治疗前和CsA治疗6月后外周血单个核细胞(PBMNC)T-bet、GATA-3及STAT4、STAT6mRNA表达;采用流式细胞术、酶联免疫吸附法(ELISA)检测慢性AA患者治疗前和CsA治疗6月后外周血Th1、Th2比例及PBMNC培养上清IFN-γ、IL-12、IL-4水平,并与正常人进行比较。结果表明:慢性AA患者PBMNC T-bet、STAT4mRNA表达、T-bet/GATA-3比值、Th1比例、Th1/Th2比值、PBMNC培养上清IFN-γ、IL-12表达均明显高于正常组(p0.01),经CsA治疗6月后,患者T-bet、STAT4表达、T-bet/GATA-3比值、Th1比例、IFN-γ、IL-12表达均有所下降,但T-bet、STAT4、T-bet/GATA-3比值、Th1比例、IFN-γ表达仍未达到正常水平,GATA-3、STAT6mRNA表达、Th2比例、IL-4表达在治疗前后与正常人比较均无明显差异(p0.05)。结论:IFN-γ/T-bet、IL-12/STAT4通路的异常活化及Th平衡向Th1型偏移在AA免疫异常的发病过程中起到关键的作用;CsA能通过下调IFN-γ/T-bet、IL-12/STAT4通路的异常活化及纠正Th1过度极化而减轻AA异常亢进的细胞免疫,解除造血抑制。     

CD28/CTLA-4共刺激分子在再生障碍性贫血免疫发病机制中的作用

目的 研究CD28、CTLA-4在再生障碍性贫血（AA）免疫发病机制中的可能作用。方法 以流式细胞术分别分析23例发病期AA、10例恢复期AA患者和15名正常人骨髓细胞中CD3^＋CD4^＋T细胞上CD28、CTLA-4表达率，Th1、Th2细胞比例，评价CD28、CTLA4表达与Th1／Th2、中性粒细胞绝对值（ANC）之间的关系。结果 ①正常对照组CD3^＋CD4^＋T细胞上CD28、cTLA4表达率及CD28^＋／CTLA-4^＋比值分别为（31．40±10．83）％、（2．45±1．30）％、17．02±13．44，AA患者发病期分别为（39．84±10．89）％、（1．43±0．67）％、43．04±37．61，AA患者恢复期分别为（22．00±9．08）％、（3．46±2．26）％、10．49±7．80；与正常对照组比较，AA患者发病期CD28显著升高（P〈0．05），CTLA-4显著下降（P=〈0．01），CD28^＋／CTLA4^＋比值相应地亦显著升高（P〈0．05），而恢复期上述数值与正常对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。②正常对照组Th1、Th2细胞、Th1／Th2比值分别为（4．21±2．11）％、（1．99±1．27）％、2．46±1．28，AA发病期为（11．13±4．96）％、（2．46±1．65）％、5．20±1．98，恢复期分别为（5．39±4．29）％、（2．53±2．41）％、2．87±1．43；与正常对照组比较，AA发病期Th1增高，Th1、Th2平衡向Thl偏移（P值均〈0．01），恢复期与正常对照组比较，差异无统计学意义。③AA患者CD28^＋／cTLA4^＋比值与Thl／Th2比值呈正相关（P〈0．05），ANC与CD3^＋CD4^＋CD28^＋T细胞数呈负相关（P〈0．01），与CD3^＋CD4^＋CTLA-4^＋T细胞数呈正相关（P〈0．01）。结论 ①AA发病期患者骨髓CD4^＋T细胞表面共刺激分子表达异常，CD28升高，而CTLA-4下降，AA患者骨髓T细胞处于“预激活”状态；②CD28／CTLA-4比值与Th1／T12．比值呈正相关提示：CD28、CTLA-4表达失衡可引起Th细胞格局偏移，Th1型细胞增多。③ANC和CD28、CTLA-4间相关分析进一步说明CD28、CTLA-4与AA的发生、发展有关。     

再生障碍性贫血患者外周血Th 1/Th2水平测定及其临床意义

目的：探讨辅助性T(T helper,Th)细胞亚群数量和功能的变化在再生障碍性贫血(再障)患者发病机制中的作用，及这两种变化之间的关系；为再障的诊断及疗效预测提供实验依据。方法：流式细胞术检测再障患者及正常人外周血T细胞亚群、Th1和Th2细胞；RT-PCR法测定再障患者及正常人外周血中Th1，Th2型细胞因子基因表达；用ELISA法测定再障患者血浆中IFN-γ和IL-4的水平。结果：再障患者Th1/Th2显著失衡，Th1细胞显著增多，Th1型细胞因子IFN-γmRNA的阳性表达率和血浆IFN-γ浓度均较正常对照显著升高；再障患者Th1细胞百分数分别与IFN-γmRNA相对表达强度(RV)和血浆IFN-γ浓度呈正相关；Th1细胞百分比、IFN-γmRNA的RV及血浆IFN-γ的浓度在比值倒置型与比值超高型患者体内相近且均高于比值正常型患者。结论：Th细胞亚群失衡，Th1细胞数量增多及功能亢进可能是再障发病的重要免疫机制之一；Th1细胞数量及功能异常相互作用是再障患者疾病发生和发展的根本原因；CD4+T或CD8+T细胞相对变化可能是Th细胞在发挥免疫抑制作用后的外在表象。     

高血压心肌梗死与Th1／Th2类细胞因子变化

目的探讨高血压心肌梗死患者Th1／Th2类细胞因子变化。方法临床及冠状动脉造影确诊的高血压心肌梗死患者45例为A（病例1）组,非高血压心肌梗死患者42例为B（病例2）组,冠状动脉造影无心肌梗死的高血压患者48例为C（病例3）组,常规体验健康者20例为D（对照）组。采用放射免疫法检测血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）水平,ELISA法检测血清1干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）水平。结果①病例1、2、3组Ang-Ⅱ[（94．3±35．4）、（74．4±31．2）ng／L和（63．4±28．9）ng／L]及IFN-γ[（24．3±5．4）、（19．4±3．9）ng／L和（12．1±3．8）]ng／L]较对照组Ang-Ⅱ[（43．4±11．2）ng／L]及IFN-γ[（4．1±1．4）ng／L]水平升高（P〈0．05,P〈0．01）;②病例1组IL-4水平[（14．4±10．7）ng／L与2组[（12．4±2．9）ng／L]、3组[（12．3±6．6）ng／L]及对照组[（11．4±3．9）ng／L]比较差异无统计学意义（P〉0．05）;③病例1、2和3组IFN-1与IL-4比值（0．77±0．33）、（0．62±0．24）和（0．58±0．26）较对照组（0．36±0．19）增大（P〈0．01,P〈0．05）;④Ang-Ⅱ水平与IFN-γ呈正相关（r=0．52,P〈0．01）,而与IL-4水平无相关性（r=0．19,P〉0．05）。结论高血压和非高血压心肌梗死均具有较高的Ang-Ⅱ、IFN—γ及IL-4水平,但高血压心肌梗死Ang-Ⅱ、IFN-γ及IL4水平更高,这是辅助性T细胞亚群Th1／Th2功能失衡的表现;高血压心肌梗死与Th1／Th2失衡,Th1细胞功能亢进密切相关,系统免疫状态和炎性内环境的改变可能对疾病的进展起重要作用。     

IFN-γ对AKT基因激活的32D细胞的影响及作用机制探讨

目的 观察IFN-γ对AKT基因激活的小鼠髓系祖细胞系(32D细胞)的影响,探讨IFN-γ对造血细胞增殖和凋亡双向调节的可能机制.方法 用质粒转导技术使32D细胞高表达AKT基因,以IFN-γ作用32D细胞,用水溶性四氮唑(WST-1)细胞增殖检测法检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测磷酸化胞外信号调节激酶(p-Erk)1/2、信号转导和转录活化蛋白(Stat)3、p-Stat3的表达.结果 ①低浓度(100 U/ml)IFN-γ能促进32D细胞增殖、抑制凋亡,高浓度(1000 U/ml)IFN-γ则相反(100 U/ml处理24 h细胞密度为0.238±0.010;而1000 U/ml处理后为0.106±0.010,未处理组为0.170±0.010).②低浓度IFN-γ可使32D细胞内Stat3磷酸化水平升高(1124±13),高浓度时减低(601±13).③转染激活型AKT质粒的32D细胞(激活型细胞)较其他组细胞的增殖率显著增高、凋亡率明显降低[分别为0.287±0.010、(9.57±0.17)%](P＜0.05).④激活型32D细胞较其他组细胞p-Erk1/2蛋白表达明显减低(P＜0.05).结论 ①IFN-γ对32D细胞有双重作用,即低浓度促进细胞增殖、抑制凋亡,高浓度抑制细胞增殖、促进凋亡.②IFN-γ对32D细胞的双重效应可能是通过Stat3的磷酸化水平的增减实现的.③激活型AKT能明显促进32D细胞增殖、抑制凋亡,IFN-γ可通过调控AKT来调节细胞增殖及凋亡.④AKT激活后可以抑制Erk信号通路,可能是通过抑制Rafl的修饰实现的.     

γ-干扰素基因对大鼠脑胶质瘤细胞生长及生存期的影响

背景反转录病毒载体介导细胞因子杀伤恶性肿瘤细胞为目前肿瘤科研领域的热点,逆转录病毒介导γ-干扰素是否抑制大鼠脑胶质瘤细胞的生长及延长其生存期的作用尚无肯定性结论.目的观察反转录病毒载体介导的γ-干扰素对大鼠脑胶质瘤细胞的生长抑制作用,探讨与生存期的关系.设计以动物为研究对象,完全随机设计.单位一所大学附属医院的神经外科.材料实验于2002-07/2004-07在哈尔滨医科大学神经外科研究所完成,选择哈尔滨医科大学附属第一临床医学院动物实验中心提供的60只Wistar雄性大鼠.随机分为C6对照组、C6/PA317neo对照组及C6/PA317γ-干扰素治疗组,每组20只.干预应用反转录病毒载体将鼠γ-干扰素基因转入反转录病毒包装细胞PA317,通过G418抗性筛选,得到高滴度产毒PA317 γ-干扰素细胞株.3组大鼠右侧基底核区接种1×106C6细胞.C6对照组接种后不做其他处理;C6/PA317neo对照组接种4 d后原位注射1×106PA317neo细胞;C6/PA317 γ-干扰素治疗组接种4 d后原位注射1×106 PA317 γ-干扰素细胞.实验观察①各组大鼠生存期≤60 d的情况.②每组动物C6细胞接种后11 d及20 d后随机取5只处死,取出整个脑组织制备冰冻组织切片,采用SABC免疫组化方法检测肿瘤组织CD4和CD8 T淋巴细胞浸润情况.③显微镜下借助图像分析软件测量肿瘤体积.主要观察指标①各组大鼠生存时间.②肿瘤体积测量.③CD4,CD8淋巴细胞浸润情况.结果60只大鼠进入实验分析.C6对照组及C6/PA317neo对照组大鼠平均生存时间分别为(27.10±0.82)d及(26.60±0.93)d,治疗组平均生存时间为(49.30±4.17)d,有5只大鼠存活期超过60 d.两对照组间生存期差异P＞0.05,治疗组较对照组生存期明显延长,P＜0.01.C6对照组及C6/PA317neo对照组肿瘤体积差异P＞0.05,治疗组肿瘤体积显著小于对照组,P＜0.01.计数肿瘤组织CD4及CD8 T淋巴细胞浸润情况发现治疗组CD4+及CD8+T淋巴细胞显著多于对照组,P＜0.01,两对照组之间差异P＞0.05.免疫组化检测Brdu阳性细胞,结果移植后7 d发现有Brdu阳性细胞,移植后16 d未发现Brdu阳性细胞,对照组均未发现阳性细胞.结论PA317 γ-干扰素细胞瘤内注射能够诱导大鼠产生抗肿瘤免疫反应,反转录病毒介导的γ-干扰素抑制肿瘤细胞生长,可明显延长生存期.     

再生障碍性贫血患者血清对32D细胞凋亡及磷酸化蛋白激酶Cε表达的影响

目的 观察蛋白激酶Cε(PKCε)在再生障碍性贫血(AA)患者血清体外诱导小鼠髓系前体细胞(32D细胞)凋亡中的作用.方法 重型AA(SAA)患者血清、非重型AA(NSAA)患者血清及正常对照者血清分别与小鼠32D细胞孵育,用流式细胞术检测细胞凋亡指数,用蛋白免疫印迹法检测磷酸化PKCε(pPKCε)的表达.结果 血清孵育32D细胞0、12、24、36及48 h,饥饿4 h,SAA组和NSAA组pPKCε表达在24 h上升到最高水平,与正常对照组相比较,差异有统计学意义(P＜0.05),血清孵育32D细胞24 h饥饿4 h后,SAA组pPKCε表达水平(0.90±0.10)较NSAA组(0.64±0.08)和正常对照组(0.54±0.08)明显上调(P值均＜0.05),NSAA组较正常对照组pPKCε表达水平也明显增加(P＜0.05),SAA组细胞凋亡率[(4.05±1.05)%]较正常对照组[(2.45±0.51)%]明显增加(P＜0.05),NSAA组[(3.24±0.56)%]较正常对照组无明显增加(P＞0.05).SAA组经同一份血清孵育的细胞的凋亡率与pPKCε表达水平之间有明显相关性(r=0.869,P＜0.05).结论SAA和NSAA患者血清均可诱导32D细胞pPKCε的表达,前者可导致32D细胞凋亡,后者对32D细胞凋亡无明显影响.     

微小核糖核酸155对不稳定性心绞痛患者CD4+T淋巴细胞的调控作用

目的 探讨微小核糖核酸-155 (miRNA-155)对不稳定性心绞痛(UAP)患者外周血CD4 +T淋巴细胞的调控作用,从而阐明miRNA-155在UAP发病中的作用机制。方法 选取住院的UAP患者21例,同时以疑似不典型冠心病症状而冠脉造影正常的住院患者18例作为对照组。采用实时定量PCR检测外周血CD4+T淋巴细胞miRNA-155表达水平,酶联免疫法检测血清干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)表达水平。免疫磁珠法分选10例UAP患者外周血CD4 +T淋巴细胞,将分离的细胞分为对照组、miRNA-155组和miRNA-155抑制物组。对培养的细胞进行干预后,流式细胞术检测辅助性T细胞Th1和Th2数量,实时定量PCR及蛋白免疫印迹法检测IFN-γ受体α(interferon gamma receptor alpha,IFN-γRα)、T细胞表达T盒(T-box expressed in T cells,T-bet)、GATA结合蛋白3(GATA-binding protein 3,GATA-3)的mRNA及蛋白表达,酶联免疫法检测细胞培养液上清IFN-γ、IL-4的表达。结果 UAP患者外周血CD4+T淋巴细胞miRNA-155与血清IFN-γ表达较对照组差异具有统计学意义(P＜0.01),且miRNA-155的表达与血清IFN-γ呈显著正相关(r=0.842,P＜0.01)。与对照组比较,体外培养CD4 +T淋巴细胞miRNA-155组Th1数量、T-bet mRNA及蛋白、培养液上清IFN-γ表达显著增加,IFN-γRα蛋白表达降低,差异具有统计学意义(均P ＜0.01);Th2数量、GATA-3、IFN-γRα的mRNA、GATA-3蛋白表达及培养液上清IL-4无明显改变(均P＞0.05);miRNA-155抑制物可有效地阻断miRNA-155的上述作用。结论 miRNA-155主要通过影响Th1细胞的分化和功能,参与对CD4 +T淋巴细胞的调控,在UAP发病机制中具有重要的作用。     

间变性大细胞淋巴瘤中AKT、mTOR途径活化的研究

目的 研究间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)患者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)及磷酸化AKT(p-AKT)、mTOR(p-mTOR)、4E-BPI(p-4E-BPI)和p70S6K(p-p70S6K)的表达特点、临床意义及相互关系.方法 应用免疫组织化学EnVision法检测ALK蛋白及p-AKT、p-mTOR、p-4E-BP1、p-p70S6K蛋白的表达.结果 81例ALCL患者中有51例(63.0%)表达ALK蛋白,30例(37.0%)不表达,ALK阳性患者预后优于阴性患者(P<0.05).71例患者中54例(76.1%)表达p-AKT,p-AKT的表达与ALK表达相关(P<0.05);57例(80.3%)表达p-mTOR,p-mTOR的表达与ALK、p-AKT表达相关(P<0.05);64例(90.1%)表达p-4E-BP1,66例(93.0%)表达p-p70S6K,p-4E-BP1及p-p70S6K的表达与p-mTOR表达相关(P<0.05),与ALK、磷酸化p-AKT表达无关(P>0.05).p-AKT、P-mTOR、p-4E-BP1及p-p70S6K的表达与预后无关(P>0.05).COX比例风险回归分析表明ALK的表达、体质性症状对患者生存影响有统计学意义(P<0.05),其中,ALK的表达对生存的影响最大.结论 p-AKT、P-mTOR、p-4E-BP1和p-p70S6K在ALCL患者中均有表达,但在ALK阳性患者中表达率显著高于阴性患者.p-AKT、P-mTOR表达与ALK表达相关,提示在ALK阳性ALCL患者中存在AKT/mTOR通路的激活,但无明显的预后意义. 无关(P>0.05).p-AKT、P-mTOR、p-4E-BP1及p-p70S6K的表达与预后无关(P>0.05).COX比例风险回归分 表明ALK的表达、体质性症状对患者生存影响有统计学意义(P<0.05),其中,ALK的表达对生存的影响最大.结论 p-AKT、P-mTOR、p-4E-BP1和p-p70S6K在ALCL患者中均有表达,但在ALK阳性患者中表达率显著高于阴性患者.p-AKT、P-mTOR表达与ALK表达相关,提示在ALK阳性ALCL患者中存在AKT/mTOR通路的激活,但无明显的预后意义. 无关(P>0.05).     

地塞米松对系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中细胞因子分泌及T细胞亚群表达的影响

目的 探讨地塞米松对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中白细胞介素(IL)-17、干扰素(IFN)-γ分泌水平和Th17、Tc17、Th1、Tc1等T细胞亚群表达的影响.方法 SLE患者和健康对照者的PBMCs分空白孔、佛波酯(PMA)/离子霉素(Ionomycin)孔、PMA/Ionomycin+地塞米松(DEX)孔行体外培养,运用四色流式细胞术检测PBMCs表达Th17、Tc17、Th1、Tc1等T细胞亚群的百分比,采用酶联免疫吸附法测定SLE患者和健康对照者血浆及PBMCs培养上清中IL-17、IFN-γ的表达水平.结果 SLE组患者血浆IL-17[138.98(84.82～187.04)ng/L]、IFN-γ[21.92(15.95～27.09)ng/L]含量均高于正常对照组[57.21(47.78～72.12)ng/L,13.43(7.04～17.37)ng/L].无PMA刺激条件下,SLE患者PBMCs培养上清中细胞因子水平、PBMCs中各T细胞亚群的百分比与正常对照组相比差异均无统计学意义(P均＞0.05);加入PMA刺激后,SLE患者PBMCs上清中IL-17的水平[(26.43±10.04)ng/L]和外周血Th17[(2.49±1.49)%]、Tc1[(44.89±16.43)%]细胞的比例均显著高于正常对照组[(18.06±5.42)ng/L,(1.47±0.73)%,(31.41±9.05)%)(P均＜0.05),SLE患者Th1、Tc17细胞百分比与正常对照组相比,差异均无统计学意义(P均＞0.05);地塞米松能明显抑制活化状态下的PBMCs分泌IL-17的水平[(16.72±6.09)ng/L](P＜0.01),且显著下调Th17(1. 34±0.76)%、Tc1(34.62±17.25)%细胞百分比(P均＜0.05),而地塞米松对IL-17的抑制作用更强.结论 SLE患者体内T细胞亚群及其相应细胞因子的表达水平存在明显异常,地塞米松能干扰SLE患者体内细胞因子网络失衡的免疫病理过程,且对IL-17有明显的抑制作用,为临床使用糖皮质激素治疗SLE提供新的理论依据和实验室基础.