重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF121)工程菌的高密度发酵工艺.方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化.结果采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF121的表达量达菌体蛋白总量的23%.结论该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF121的表达水平.     

人内皮抑素基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人内皮抑素基因并在大肠杆菌中表达。方法 采用PCR技术进行内皮抑素基因的克隆，并使基因定向插入表达载体PGEME－1中经IPTG诱导获取表达。结果 经DNA序列分析，人内皮抑素基因序列完全正确，经SDS－PAGE分析，出现一条特异性蛋白质条带，大小与基因10和人内皮抑素蛋白的大小的总和相符合。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得融合表达。     

人血管抑素cDNA在酿酒酵母中的表达和分泌

目的：在酿酒酵母中表达和分泌人血管抑素。方法：应用ＤＮＡ重组技术构建重组质粒;质粒ＤＮＡ转化酵母用醋酸锂法;以纤溶酶原抗血清为第一抗体,采用ＥＬＩＳＡ方法检测表达产物。结果：将ＭＦα１信号肽和人血管抑素融合基因序列插入酵母表达载体ｐＭＡ９１的Ｂｇ１Ⅱ位点,构建了重组表达质粒ｐＭＡＡ２,转化酿酒酵母ＧＲＦ１８后获得工程菌ＧＲＦ１８（ｐＭＡＡ２）,其培养上清液ＥＬＩＳＡ分析阳性。结论：人血管抑素在ＧＲ     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的 建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF₁₂₁)工程菌的高密度发酵工艺。方法 采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化。结果 采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF₁₂₁的表达量达菌体蛋白总量的23%。结论 该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF₁₂₁的表达水平。     

基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白

在摇瓶条件下对基因工程菌Pichia pastoris的发酵条件进行了实验，并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在分批发酵时，接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为20左右时，细胞生长的延迟期约为2.11h，细胞生长光密度与培养时间的关系模型为：y=0.7841e^0.2319t（线性相关系数r=0.9936）；在补料发酵时细胞浓度可达115g/L-160g/L（干重），在120h重组人血清白蛋白表达量达3.6g/L。     

重组人血管抑素基因K(1-3)腺病毒载体的构建

目的 构建携带血管抑素（angiostatin，AG）基因K（1—3）重组复制缺陷型腺病毒表达载体。方法 将人血管抑素K（1—3）cDNA插入穿梭载体pShuttle产生重组质粒pShttle-AG（K1—3），经双酶切与骨架载体pAdeno—X重组产生pAdeno-X—AG（K1—3），转染293细胞制备重组腺病毒。结果 对pShuttle—AG（K1—3）进行酶切鉴定及测序证实插入片断为AG（K1—3）。PCR鉴定pAdeno—X—AG（K1—3），扩增出318bp特异性片断。线性pAdeno—X—AG（K1—3）转染293细胞，成功包装出重组腺病毒。结论 成功构建了携带人anglostatin（K1—3）重组腺病毒栽体，可在体外表达具有生物学活性的人angiostatin（K1—3），为进一步研究奠定了基础。     

人内皮抑素cDNA克隆和初步表达

目的：克隆人内皮抑素基因,获得初步表达产物,为进一步研究打下基础,方法：用RT－PCR方法从中国汉族人正常肝组织扩增出内皮抑素cDNA,T／A插入puCm-T载体,测序,,再插入表达载体pKPL-3a,转化大肠杆菌POP2136,42度诱导表达,SDS－PAGE分析表达蛋白,结果：中国人内皮抑素cDNA开放阅读框架全长552bp,编码184个氨基酸,其85位谷氨酸和98位天冬氨酸密码子的第三位碱基出现改变,但编码的氨基酸不变,结论：构建了中国人内皮抑素的克隆载体和表达载体,初步表达了约20kD人重组内皮抑素。     

表达屋尘螨Ⅰ类变应原Der p 1的基因工程菌的发酵条件探讨

目的 探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组屋尘螨Ⅰ类变应原(Der p 1)的影响.方法 应用摇瓶发酵试验观察不同诱导时间和不同诱导时机对Der p 1表达量的影响.结果 (1)Der p 1基因在E.coli BL21(pBVDP8)菌密度A600 nm0.6左右时,42℃最佳诱导时间为4 h.(2)工程菌E.coli BL21(pBVDP8)在30℃培养至A600 nm为0.5～0.7时,42℃诱导4 h Der p 1表达量最高.结论 确定了最适诱导时间和诱导时机,初步形成了一套高表达Der p 1的发酵技术.     

重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究

目的：研究大肠杆菌表达重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB－UreB)融合基因工程菌BL21的发酵工艺，方法：采用德国B.Brau公司C－10型15L发酵罐发酵，对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化，结果：在优化的条件下，15L发酵罐发酵工程菌，菌体收获量可达52．2g/L，目的蛋白表达量约占总蛋白的27％，结论：此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达。     

血管抑素基因和内皮抑素基因治疗裸鼠肺癌的初步研究

恶性肿瘤的发生、发展和转移均依赖于血管生成,以新生血管为靶点,抑制肿瘤血管生成已成为近年来癌症治疗的新策略。肿瘤血管生成是一个多步骤的复杂过程,并由多种血管生成因子和血管生成抑制因子共同调控所决定的。在血管生成抑制因子中,血管抑素（angiostatin）及内皮抑素（endostatin）起重要作用,两者均能强烈、特异性抑制血管内皮细胞增殖,阻断肿瘤的血管生成［1］。本研究应用人肺腺癌细胞系A549接种裸鼠成瘤,然后分别用血管抑素基因和内皮抑素基因瘤内注射进行治疗,以观察肿瘤生长受抑制情况。1 材料和方法1） 肺癌裸鼠模型…     

重组SOD的摇瓶发酵条件研究

目的:对含PTD-SOD重组质粒的工程菌进行诱导表达。方法:通过SOD活性和SDS-PAGE电泳分析,考察了诱导时间和诱导剂浓度对PTD-SOD表达量的影响。同时考察了诱导温度对产物表达形式的影响。结果:表达条件为IPTG浓度0.5mM,诱导时间4h,诱导温度20℃。结论:在上述条件下重组SOD在摇瓶中的表达效果最好。     

重组人血管抑素的纯化和生物活性鉴定

目的：纯化大肠杆菌表达的重组人血管抑素（ｒｈＡＧＮ）并鉴定其抗血管生成生物活性。方法：通过超声破碎、包涵体洗涤、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ 凝胶过滤层析等步骤初步纯化ｒｈＡＧＮ,Ｌｏｗｒｙ法测定蛋白浓度,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析观察其纯度;应用 ＭＴＴ法观察在终浓度为 ０．１～３．０ ｍｇ／Ｌ范围内 ｒｈＡＧＮ对 １０ μｇ／Ｌ ＥＧＦ刺激的人真皮微血管内皮细胞系ＨＤＭＥＣ的增殖抑制活性;以ＰＢＳ为对照（ｎ＝５）,应用原位鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）技术观察１００ μｇ／只（ｎ＝５）和２００ μｇ／只（ｎ＝５）ｒｈＡＧＮ作用７２ ｈ对３０ｎｇ ｂＦＧＦ 诱导的鸡胚ＣＡＭ毛细血管生成的抑制作用。结果：①ｒｈＡＧＮ电泳纯度达到 ９６％,总回收率为 ６１．７％;②ｒｈＡＧＮ对 ＨＤＭＥＣ细胞增殖的最大抑制剂量约为 ２．０ ｍｇ／Ｌ,抑制率约９２．３％．半数最大抑制剂量在１．０ ｍｇ／Ｌ附近;③１００ μｇ／只和２００ μｇ／只ｒｈＡＧＮ组鸡胚ＣＡＭ 载样滤纸片下毛细血管数目分别为７９±２３条和３７±１１条,两组间比较差异显著（Ｐ＜０．０５）;与对照组（１４５±３６条）相比,均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。结论：ｒｈＡＧＮ达到了较高的电泳纯度,     

γ干扰素工程菌发酵工艺研究

在摇瓶培养及恒化培养研究的基础上,对含温度敏感型质粒γ干扰素工程菌高密度、高表达的发酵工艺作了探讨。摇瓶培养结果表明,菌体的良好生长状态对外源基因表达起着重要作用,工程菌于对数后期升温,干扰素滴度最高。以葡萄糖为限制性基质的恒化培养,得出了工程菌细胞生长得率与比生长速率之间的关系,同时表明工程菌升温表达前的比生长速率对表达后干扰素的比活有影响,比生长速率在0.10～0.15h~(-1)时比活最大。通过碳、氮、镁的间歇流加培养与连续流加培养,均使工程菌达到高密度与高表达,但以控制比生长速率为目的的连续流加培养较间歇流加比活提高近4倍,棕1.1×10~(10)IU/L。     

重组人血管抑素对荷人CNE-1鼻咽癌裸鼠抑制作用的初步研究

目的:观察重组人血管抑素(recombinant human angiostatin, rhAGN)对荷人CNE-1鼻咽癌皮下移植瘤生长的抑制作用。方法:建立CNE-1鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型,皮下注射不同剂量rhAGN,治疗30d后,观察肿瘤体积和重量变化,计算其抑瘤率。结果:rhAGN处理剂量为50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)和200mg/(kg·d)时,肿瘤体积分别为(4961±384)mm~3、(2449±276)mm~3和(488±52)mm~3,与对照组相比,治疗组的体积和重量明显减小(P<0.01,P<0.001);其抑瘤率分别为32.3％、64.0％和83.2％。结论:rhAGN能显著抑制CNE-1鼻咽癌移植瘤的生长,且作用呈剂量依赖性。     

人神经营养素-3成熟区基因在大肠杆菌内的表达

【目的】应用基因工程方法制备人神经营养素 3(hNT 3)蛋白 ,为探讨其对阿尔茨海默病等中枢神经退行性疾病的治疗作用提供材料。【方法】将通过序列分析确定的hNT 3成熟区基因重组至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,构建了重组表达载体 pBV/mhNT 3 ,在大肠杆菌中表达后 ,SDS PAGE法测定表达蛋白的相对分子质量 ,鸡胚背根节培养法检测其生物学活性。【结果】pBV/mhNT 3可在大肠杆菌中表达出一相对分子质量为 15× 10 3 的新蛋白 ,与hNT 3蛋白相对分子量相符。表达蛋白主要以包涵体形式存在 ,经纯化复性后 ,可明显促进鸡胚背根节的生长。【结论】人神经营养素 3成熟区基因可在大肠杆菌内高效表达hNT 3。     

人胸腺素α1原核表达重组体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：以基因工程方法获得人胸腺素α1（Tα1）多肽产品。方法：通过PCR扩增人工合成模板的方法获得人Tα1基因，然后将其克隆入原核细胞表达载体pGEMEX1，用重组体转化大肠杆菌，并从mRNA和蛋白质水平检测重组体在大肠杆菌中的表达情况。结果：构建人Tα1克隆重组体pUC18-Tα1，经序列分析证实对码、序列无误；成功构建了人Tα1原核细胞表达重组体pGEMEX1-Tα1;从mRNA水平证实pGEMEX1-Tα1在大肠杆菌JM109（DE3）中能够转录；转化大肠杆菌JM109（DE3），经IPTG诱导，能产生-36kD左右的融合蛋白。结论：构建成功重组体pGEMEX1-Tα1，并在大肠杆菌中得以表达。     

传染性喉气管炎病毒糖蛋白gC在原核系统中的高效表达

目的　分析传染性喉气管炎病毒 (ILTV)gC蛋白的免疫活性。方法　设计引物扩增编码gC蛋白主要免疫原性区域cDNA ,将其克隆到原核表达载体pGEX_6P_1的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间 ,构建重组质粒r_pGEX_gC。将r_pGEX_gC转化到大肠埃希菌BL2 1(DE3)株中。结果　经IPTG诱导后 ,GST gC融合蛋白在重组菌株获得表达 ,表达产物相对分子质量为 6 5× 10 3,与预计相对分子质量大小一致。融合蛋白的表达含量占整个菌体含量的 2 7 8%。West ern_blot结果表明gC蛋白具有良好的反应活性。结论　本研究为传染性喉气管炎诊断抗原研制奠定基础。     

基因工程抗体anti-HBsAgFab原核表达体系大规模培养条件的实验研究

目的 探讨含anti-HBsAg Fab/pBAD表达载体的工程化大肠杆菌的大规模培养条件。方法 在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律,摸索最佳的培养模式及诱导表达条件。后根据摇瓶发酵结果于发酵罐中行补料高密度发酵试验,确定最佳补料模式。结果 由摇瓶发酵获得的数据表明,以培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点、在25 ℃条件下以0.2% 阿拉伯糖诱导12 h,Fab的得率最佳,采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大D₆₀₀达到55.2,相当于湿菌含量110 g/L水平;同时,经证实Fab的抗原结合活性良好。结论 初步确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺路线,为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础。