DNA拓扑异构酶的研究进展

DNA拓扑酶广泛存在于生物体细胞核内,能调节核酸空间结构动态变化,是控制核酸生理功能的关键酶。其参与DNA的重组、修复、转录及复制过程。本文就拓扑异构酶的结构,功能,生物学特性进行综述。1DNA拓扑异构现象在生物体的整个生命过程中,细胞遗传物质DNA起着十分重要的作用,DNA分子中核苷酸的排列顺序构成DNA的一级结构;双螺旋结构构成其二级结构;真核生物DNA分子很大,     

中国人线粒体DNA基因文库的构建

作者从中国人新鲜胎盘组织中提取并用氯化铯-溴乙啶超离心纯化线粒体DNA。用限制性内切酶分别消化线粒体DNA和λ噬菌体EMBL3载体。混合两者的消化产物并用连接酶连接,获得重组DNA分子。将重组DNA分子转化用氯化钙致敏的大肠杆菌Q359,形成噬菌斑,筛选单克隆的重组 DNA分子,并让其在非限制性寄主大肠杆菌K802中扩增。借助载体EMBL3,将完整的线粒体DNA分子克隆到大肠杆菌Q359中,从而构建了中国人线粒体DNA的基因文库。     

蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体构建

目的构建蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体.方法运用Cre-LoxP重组酶系统,通过DNA重组技术,将L-蛋氨酸-γ裂解酶基因(L-Methioneγ-Lyase Gene)与供体载体pDNR-CMV重组,获得含有Metase重组基因的供体载体pDNR-Metase-CMV.将pDNR-Metase-CMV片段与真核腺病毒载体PLP-Ade-X-CMV进行重组,获得pLP-Ade-Metase-CMV重组分子.结果获得了重组腺病毒载体pLP-Ade-Metase-CMV,并证实该重组腺病毒载体中有Metase Gene.结论采用LoxP/Cre体外重组法成功地构建了含蛋氨酸酶基因的真核表达重组腺病毒载体.     

分子生物学技术在蚤类分类学研究中的应用

蚤类是重要的医学昆虫,是鼠疫的重要传播媒介,鼠疫也是我国法定的甲类传染病之首。随着分子生物学技术的不断发展,蚤类基因组DNA的提取方法也日渐成熟,研究蚤类分子系统学的方法手段也取得了革命性的进展,DNA重组、基因克隆、限制性内切酶的应用以及DNA测序等技术使得对蚤类的核酸分子系统学研究成为可能,而后产生的聚合酶链反应技术以及DNA测序成本的逐步降低更是大大促进了蚤类核酸分子系统学的进展。分子生物学的发展为传统意义上的蚤类系统学研究提供了新的技术手段,有着广阔的应用前景。     

EMBL3DNA用于构建肝豆状核变性患者基因组文库

以EMBL 3 DNA为载体,构建肝豆状核变性(HLD)患者的基因组文库。从HLD患者白细胞提取高分子量DNA,经Sau 3A部分酶解,电泳回收15～23kb DNA片段,EMBL 3 DNA用BamHI及EcoRI进行双酶解,两者经T_4 DNA连接酶连接成重组DNA分子。从E.coli溶原菌BHB2688及BHB2690用冻融法及超声破碎法提取包装蛋白,包装效率为1～8x10~7pfu/μg EMBL 3 DNA。连接分子用包装蛋白体外包装,获得了9.2×10~6个重组子,达到建库要求。     

乙型肝炎病毒(adw_2)亚型全基因组的分子克隆

应用基因克隆技术,使高纯度的HBV DNA(adw_2)的EcoRI酶切片段分别与经同种限制性内切酶切割的PBR322和pUC18质粒DNA片段重组,转化到相应的E.coli受体菌中,经筛选和鉴定,得到了含有完整HB V(adw_2)基因组的分子克隆。     

嵌合跨膜型人CD55基因的重组逆病毒表达质粒的构建

目的 构建嵌合跨模型CD55基因的重组逆病毒表达质粒。方法 采用PCR技术扩增编码CD155信号肽及成熟蛋白胞外区（-34-304aa)的DNA片段，双侧引入EcoRI、SspI位点，与编码CD46分子的跨膜区及膜内区（270～350aa)的DNA片段的5′未端自身的Stu I位点连接，构建嵌合跨模型CD55 DNA片段，序列测定后将此嵌合CD55片段与pLXSN逆病毒载体连接构建重组表达质粒，酶切鉴定插入片段的方向。结果 DNA序列测定证实所构建的嵌合跨膜型CD5 DNA阅读框完整、连接部位序列正确；Hind Ⅲ酶切鉴定得到了正向插入的CD55TM-pLXSN重组表达质粒。结论 我们成功构建了嵌合跨膜型CD55 DNA片段及含此片段的重组逆病毒表达载体CD55TM-pLXSN，为进一步在真核细胞中表达嵌合分子，比较研究GPI锚固型CD55分子与细胞活化信号转导的关系建立良好对照并为应用跨膜型的CD55分子对PNH进行基因治疗奠定了分子生物学基础。     

采用集合转化的方法构建HIV-1蛋白酶区和反转录酶区T-A克隆载体

DNA重组技术是将两个或多个单独的DNA片段连接起来产生一个能在特定宿主中自主复制的DNA分子。重组DNA分子最简单的构建方法是将基因片段克隆到质粒或噬菌体等克隆载体上。常用的质粒载体有pBR322、pUC和pGEM等。这些载体含有不同的多克隆位点,适于将含有不同酶切位点的DNA片段连接起来[1]。     

医学生物学名词解释

Receptor-受体:为细胞表面蛋白质,可与特异性分子(配体)结合并传送信号。Recombinant DNA-重组DNA:有不同来源的DNA片段参加所构成的DNA分子。应用在特殊碱基序列处切割DNA的限制性酶切割产生的DNA片段与载体如环形细菌性质粒相连,     

基因工程疫苗及活性多肽的研究、开发、预测及对策

基因工程是七十年代在分子遗传学基础上发展起来的。它是应用酶学的方法将不同来源的遗传物质在体外合成重组DNA分子,后者在细胞内可以增殖繁衍,成为一个纯系。从1970年人工合成酵母丙氨酸转移核糖核酸的结构基因算起,基因工程技术至今虽然只有十五年历史,但已取得不少重大进展与医药学领域的成就(表1)。除疫苗外,国外用重组DNA技术生产的、可作药品的多肽还有很多,它们处于     

乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗的构建与鉴定

目的采用基因重组技术,将乙肝病毒4段小基因与协同刺激分子CD80基因嵌合,构建成嵌合乙肝小基因DNA疫苗。方法①根据文献选择和设计HBV的一段pres2、三段core表位编码小基因,以人工合成DNA片段P1~P10,通过退火、连接成为含约170bp的嵌合基因,用HindⅢ酶切;②提取和纯化pcDNA3-CD80,用HindⅢ酶切和去磷酸化;③将酶切小基因定向插入pcDNA3-CD80载体的HindⅢ位点之间,构建成pcHBV-CD80小基因质粒;④pcHBV-CD80转入E.coli JM109扩增、提取质粒,测序鉴定。结果①各DNA小片段经退火、连接,成功嵌合为一大小约170bp之目的基因;②pcDNA3-CD80提取、酶切均成功;③170bp之目的基因定向克隆到载体上,构建了重组质粒pcHBV-CD80,经测序鉴定均构建正确。结论乙肝病毒小基因与协同刺激分子CD80嵌合DNA疫苗构建成功。     

可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达

目的构建以塞姆利基森林病毒复制子载体为基础的可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,验证其在人胚肾293T细胞及免疫小鼠肌肉组织内的表达情况。方法首先用NheI酶切既往构建的pVAX1-2PFcGB重组质粒,补平酶切后的粘末端,然后再用限制性内切酶BssHII继续酶切该线性化质粒,补平粘末端后即获得含有编码Survivin及hCGβ-CTP37肿瘤抗原的融合基因片段2PFcGB,接着利用DNA重组技术将该片段克隆入基于塞姆利基森林病毒复制子载体改造的PSCK载体,筛选阳性重组质粒。接着,利用阳离子脂质体介导法将其瞬时转染入人胚肾293T细胞,利用流式细胞术及免疫荧光法检测融合抗原在293T细胞中的表达;利用电脉冲基因导入仪将该重组质粒递送至BALB/C小鼠股四头肌,利用免疫组化法验证肿瘤抗原在小鼠体内的表达。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小与预期一致,流式细胞术检测该重组质粒瞬时转染的293T细胞,可见大量的阳性荧光细胞,其IRES序列上游融合肿瘤抗原分子阳性表达率为5.70%,下游佐剂分子阳性表达率为19.75%;同时,利用两种肿瘤抗原特异抗体在免疫小鼠股四头肌组织切片上均检测到了相应表达。结论成功构建了可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,该重组质粒在体内外均能高效表达外源肿瘤抗原及佐剂分子,这些结果为该抗肿瘤DNA疫苗进一步的抑瘤活性及免疫学作用机制的研究奠定了坚实的实验基础。     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。     

牛雄性DNA特异的限制性片段研究

牛基因组DNA经PstI酶解后,以与性别有关的雌性蛇的小卫星DNA组份一BKm序列(p184)为探针进行分子杂交,回收4.4kb牛雄性DNA片段,以pUC_(19)为载体亚克隆,重组质粒经菌落原位杂交和Southern blot分子杂交鉴定。将此雄性DNA片段检测牛基因组DNA,观察到由于性别的不同而出现不一样的杂交模式。实验结果表明,用来自牛雄性DNA特异的限制性片段的重组质粒作探针,Southern blot分子杂交方法可以鉴定牛的性别。     

CD59基因的亚克隆

目的"构建pUC18-α珠蛋白DNA-CD59cDNA重组分子. 方法"采用人心肌组织作为RNA的来源,经RT-PCR扩增得到CD59基因的cDNA片段.以pUC18质粒为载体;人α-珠蛋白DNA为启动子,并提供polyA+尾巴;以编码全部CD59蛋白质的核苷酸序列的cDNA作为目标基因,三者拼接成重组分子. 结果"经酶切鉴定,重组分子拼接成功. 结论"该重组分子可作为转基因构件,经微注射输入供体动物受精卵细胞内,建立人CD59转基因动物模型.     

用分子杂交技术检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA

本世纪七十年代末,Galibert等应用DNA重组技术(DNA recombinat technology)将乙型肝炎病毒(HBV)的基因克隆成功,标志着对HBV的研究进入分子生物学的新阶段。目前,对HBV分子生物学研究的一个最重要的方法就是分子杂交技术,该技术的主要原理     

携带HR-GFP报告基因的DNA损伤同源重组修复检测系统的建立及初步应用

目的 建立DNA损伤同源重组修复检测系统（Ⅰ-Sce I-HR）,应用该系统制备DNA双链断裂（DSB）的人骨肉瘤细胞（U2OS）模型,探索细胞DNA损伤后的修复特性奠定基础.方法 通过分子克隆构建携带Ⅰ-Sce I归位内切酶识别序列的真核表达载体pcDNA3-HR-GFP,将该质粒转染入U2OS细胞中,经G418稳定筛选.随后分别瞬时转染入携带归位内切酶Ⅰ-Sce I的表达质粒pCBASCEI,以及体外经Ⅰ-Sce I线性化pcDNA3-HR-GFP.48小时后用免疫荧光方法检测DNA双链损伤效应分子-DH2AX,同时观察EGFP荧光信号;72小时后用Western blot检测报告蛋白EGFP的表达,评估DNA双链断裂后同源重组修复情况.结果 酶切鉴定和测序证实pcDNA3-HR-GFP真核表达载体构建成功;Ⅰ-Sce I-HR系统引入U2OS细胞中后,γ-H2AX表达明显上调,荧光显微镜和Western blot均显示EGFP表达.结论 DSB细胞同源重组修复模型构建成功,Ⅰ-Sce I-HR系统能够成功地诱导U2OS细胞株产生DSB,并出现同源重组修复,为进一步研究DNA同源重组信号传导提供了有效的研究工具.     

重组PCR—一种快速体外基因重组技术

重组PCR是一种用于体外进行基因重组的简单、高效、快速技术,在基因重组过程中,不受载体和待连接DNA片段内部自身酶切位点的制约,连接时不依赖于限制性内切酶和连接酶,具有传统的DNA重组技术无法比拟的优势。     

大肠杆菌表达EB病毒特异性DNA酶基因的研究Ⅰ:重组DNA克隆的建立

本研究用基因重组技术,试图由大肠杆菌表达EB病毒特异性DNA酶基因.从而获得EB病毒特异性DNA酶,以用于进一步临床研究.     

人α珠蛋白基因的次级克隆及高比活~(32)中标记人α珠蛋白基因探针的制备(简报)

利用DNA分子重组技术,将质粒pRBα_1用Pst酶解,得到含人完整α_1珠蛋白基因的1.5 kbp片段。与克隆载体 M_(13)mp_7、M_(13)mp_8(均经PstⅠ酶切)重组,强化克隆,得到无色噬菌斑。用扩增后斑点杂交法筛选到两株含人α_1珠蛋白基因的阳性克隆:M_(13)mp_7α_1,