生物节律相关基因 Cry1与肝癌的相关性探讨

目的研究生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展的相关性.方法逆转录PCR、Northern blot和免疫组织化学方法检测Cry1在各种肿瘤细胞系、人正常组织及人肝癌与配对的癌旁组织中的表达.构建Cry1重组的真核表达质粒并转染肝癌细胞SMMC-7721.生长曲线和软琼脂克隆形成试验检测Cry1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖速度.逆转录PCR检测与Cry1相互作用的生物节律基因在Cry1过表达的SMMC-7721中的表达.结果Cry1在人各种正常组织中均有不同程度的表达.Cry1在人肝癌癌旁组织中的表达水平高于癌组织中的表达.过表达Cry1对SMMC-7721细胞的体外增殖没有明显影响.结论生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展可能有一定的相关性.     

新基因pp3774的亚细胞定位以及在肝癌细胞系和组织中的表达谱研究

目的探讨新基因pp3774在肝癌细胞系、人肝癌及癌旁肝、肝硬化以及正常肝组织中的表达差异及其生物学功能.方法脂质体转染-荧光观察pp3774-GFP融合蛋白的亚细胞定位;合成新基因pp3774特异性多肽,制备兔源性多克隆抗体;用RT-PCR、蛋白印迹、免疫细胞化学及免疫组化方法检测pp3774基因在7个肝癌细胞系及214例肝细胞癌、18例肝硬化及10例正常肝组织中的表达差异.流式细胞术检测转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡率.结果 pp3774蛋白主要定位于细胞质(内质网为主);RT-PCR检测结果表明pp3774 mRNA在肝癌细胞系BEL-7402、Huh-7、MHCC-97L及HepG2中高表达,SMMC-7721、MHCC-LM3及人永生化肝细胞系L-02中度表达,而在Hep3B中低表达;肝癌及癌旁组织中pp3774 mRNA的表达表现为癌旁高于癌(P<0.05);免疫组化结果显示pp3774蛋白表达程度依次为正常肝≥肝硬化≥癌旁肝组织>肝癌.转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡发生率高于对照组约10%.结论 pp3774基因是一个具有抑制肝癌细胞生长功能的新基因.     

反义寡核苷酸抑制survivin基因表达及肝癌细胞生长的研究

目的:采用反义寡核苷酸抑制肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的作用.方法:采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,Western blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测凋亡细胞比率,检测转染前后细胞贴壁率变化,并绘制细胞生长曲线.结果:survivin反义寡核苷酸转染后,肝癌细胞survivin蛋白及mRNA表达均显著降低,细胞贴壁率显著降低,细胞增殖活性明显受抑,细胞凋亡率显著增加.结论:survivin反义寡核苷酸转染可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.     

原发性肝癌组织中KruPPel样因子6(KLF6)的表达及其对肝癌细胞增殖的抑制作用

目的了解Kruppel样因子6（KLF6）基因在原发性肝癌组织中的表达水平及其对肝癌细胞增殖的抑制作用。方法分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Wstern blot检测原发性肝癌及其癌旁组织KLF6 mRNA及蛋白质的表达水平。构建KLF6真核表达质粒并转染肝癌细胞SMMC-7721,流式细胞仪及MTT试验观察KLF6基因对细胞周期及细胞增殖活性的影响。以Western blot技术检测外源KLF6基因对p21WAF1表达的影响。结果与对应的癌周组织比较,23例原发性肝癌组织中8例（34.8%）KLF6 mRNA,9例（39.1%）KLF6蛋白质水平明显下降。与对照组比较,转染KLF6基因的SMMC-7721细胞G0~G1期所占细胞的比例明显增高,转染KLF6基因SMMC-7721的增殖率明显下降。外源KLF6基因能上调肝癌细胞p21WAF1表达。结论KLF6基因表达水平的下降可能在原发性肝癌发病机制中起到一定作用。上调p21WAF1表达是KLF6基因抑制肝癌细胞增殖的重要途径.     

hAph2β和c-abl在肝细胞癌中的表达及其相互作用

目的:探讨hAph2β蛋白与c-abl蛋白在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的相互作用.方法:RT-PCR和Western 印迹法分析c-abl基因和hAph2基因在肝癌细胞株及永生化人肝细胞株中的表达.脂质体转染、免疫共沉淀和Western印迹法检测hAph2β与c-abl在SMMC-7721细胞中的相互作用.激光共聚焦-荧光显微镜观察hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中的定位.用组织芯片结合免疫组织化学法检测hAph2β和c-abl蛋白在肝癌和相应癌旁组织中的表达差异,统计学分析其表达差异的临床意义.结果:RT-PCR检测结果表明,c-abl mRNA在HepG2、L-02及MHCC-LM3细胞中高表达,在SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B和Chang's liver细胞中中度表达,而在Huh-7、MHCC-97L细胞中低表达.Western印迹法检测结果发现,hAph2总蛋白在HepG2、Huh-7、MHCC-LM3和MHCC-97L细胞中高表达,在BEL-7402、L-02细胞中低表达;c-abl蛋白在Huh-7细胞中低表达.免疫共沉淀观察发现SMMC-7721细胞中过表达的hAph2β-GFP和内源性c-abl相互作用.荧光免疫细胞化学检测发现hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中部分共定位.免疫组织化学检测结果表明,hAph2β/c-abl蛋白在人正常肝组织、硬化肝组织、癌旁肝及原发性HCC癌组织中的强阳性率分别为:100%/50%、91.7%/100%、100%/89.5%和50.9%/19.3%,其中hAph2β和c-abl在癌旁肝组织中的表达均明显高于肝癌组织(均P<0.001),2者在56.1%(32/57)的肝癌组织中同时高或低表达.结论:hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中相互作用,在原发性HCC及相关组织中共表达.     

TC21/R-Ras 2在肝癌中的表达、亚细胞定位及意义

目的:探讨TC21基因在肝癌细胞、肝癌及癌旁组织中的表达、亚细胞定位及意义。方法:用RT-PCR检测TC 21在肝癌细胞系及人肝癌及癌旁组织中mRNA水平的表达,用免疫组化及Western印迹检测TC21蛋白在肝癌相关组织中的表达差异,用组织芯片技术结合免疫组化检测TC21蛋白的亚细胞定位。结果:RT-PCR检测结果表明TC21 mRNA在SMMC-7721、BEL-7402、Huh-7、Hep3B、HepG2、MHCC-97L、MHCC-LM3 7个肝癌细胞系及L-02和Chang liver 2株永生化人肝细胞系、7对肝癌及对应癌旁肝组织中均有较高表达;Western印迹结果表明上述细胞系中TC21蛋白表达与mRNA表达一致,TC21在4对肝癌及癌旁组织中均呈较高水平的表达;免疫组化检测结果表明TC21在人原发性肝癌、癌旁组织、硬化肝组织与正常肝组织中的表达阳性率分别为84.2%、77.2%、41.7%、0%,肝癌与肝硬化、正常肝相比显著高表达(P<0.05,P<0.01),与癌旁组织比无统计学意义(P>0.05);统计学分析结果表明TC21蛋白表达与肿瘤大小呈正相关(P<0.05),与是否肝硬化呈负相关(P<0.05);肝癌组织中TC21主要定位于肝癌细胞核,部分定位于胞质,膜定位不明显,TC21蛋白在肝癌细胞中的核定位显著高于癌旁肝细胞(P<0.001)。结论:本研究首次揭示TC21蛋白在肝癌组织中的高表达及核定位预示其在肝细胞恶性转化及肝癌发生发展中发挥重要作用。     

肝癌及相关组织中NET-1基因与蛋白的表达

背景与目的:NET-1是最近发现的肿瘤相关基因,它在肝癌中的表达目前尚未见报道。本研究在胚胎肝、成人肝、肝癌及相应的癌旁组织中筛检和比较NET-1基因和蛋白表达,以探讨NET-1基因在肝癌表达的特征。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测3例胚胎肝、4例成人肝、4例验证肝癌组织和28例肝癌与相应癌旁组织中NET-1mRNA的表达,由四星图像分析系统软件检测NET-1基因mRNA的光密度。用基因生物工程方法制备NET-1多克隆抗体,并用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光细胞化学检测培养的人肝癌细胞系SMMC-7721中NET-1抗体的表达,免疫组化法检测28例肝癌与癌旁组织中NET-1蛋白的表达。结果:(1)正常成人和胎儿肝组织中NET-1基因mRNA不表达,4例验证肝癌组织中NET-1基因mRNA均呈阳性表达;肝癌与癌旁组织中NET-1基因mRNA高表达,阳性率均为85.71%(24/28)。肝癌组织中NET-1mRNA的平均光密度显著高于癌旁组织(0.64与0.47,P<0.05)。(2)经激光共聚焦显微镜观察SMMC-7721细胞中NET-1抗体的表达定位于胞浆。(3)免疫组化检测NET-1多克隆抗体在同组肝癌和癌旁组织中NET-1蛋白检出率分别为96.43%(27/28)和71.43%(20/28),两者差异具有显著性意义(P<0.05)。(4)RT-PCR方法和免疫组化方法检测肝癌和癌旁组织中NET-1基因mRNA表达与蛋白表达两者之间阳性率无显著性差异,并呈显著性正相关(癌中r=0.48,癌旁r=0.40,均P<0.05)。结论:NET-1基因表达可能是肝癌发生的早期分子事件,该基因在肝癌诊断中可能有一定的参考价值。     

TSA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用及其机制

目的:研究去乙酰化转移酶抑制剂TSA对肝癌细胞SMMC-7721的作用及其机理。方法:利用细胞计数,流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期,Tunel试验研究TSA对肝癌细胞SMMC-7721的作用;利用western研究TSA对肝癌细胞蛋白表达的影响。结果:TSA可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长,并可诱导细胞凋亡。可阻滞肝癌细胞SMMC-7721细胞周期于G0/G1期。可增加p53,p21,bax等基因的表达,降低BCL-2的表达。结论:去乙酰化转移酶抑制剂TSA可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长并诱导其凋亡,其主要通过调控一些肿瘤相关基因的表达起作用。     

TSA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用及其机制

目的：研究去乙酰化转移酶抑制剂TSA对肝癌细胞SMMC-7721的作用及其机理。方法：利用细胞计数,流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期,Tunel试验研究TSA对肝癌细胞SMMC-7721的作用;利用western研究TSA对肝癌细胞蛋白表达的影响。结果：TSA可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长,并可诱导细胞凋亡。可阻滞肝癌细胞SMMC-7721细胞周期于G0/G1期。可增加p53,p21,bax等基因的表达,降低BCL-2的表达。结论：去乙酰化转移酶抑制剂TSA可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长并诱导其凋亡,其主要通过调控一些肿瘤相关基因的表达起作用。     

棘霉素对肝癌SMMC7721细胞凋亡相关基因影响的研究

目的:探讨棘霉素诱导肝癌SMMC7721细胞的凋亡作用及对转录因子Twist、p53、Survivin和hTERT(人端粒酶)基因的影响.方法:采用MTT法测定棘霉素对肝癌细胞的生长抑制率;半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测与肝癌的发生和转移密切相关的转录因子Twist,与细胞增殖和凋亡联系紧密的p53、Survivin和hTERT的mRNA表达水平的改变;利用Western blot方法分析棘霉素治疗后上述基因的蛋白表达情况.结果:体外实验证实,棘霉素浓度＞10.0 ng/mL各组对细胞的生长抑制均显著增加,P<0.05,随棘霉素药物浓度增加,细胞抑制率明显增大.棘霉素抑制肝癌细胞株SMMC7721的作用呈剂量-时间依赖性. RT-PCR 方法证实,随着棘霉素剂量的增加,肝癌SMMC7721细胞株中Twist、Survivin和hTERT mRNA表达水平逐渐下调,P<0.01,p53 mRNA表达水平微弱上调,P<0.05.Western blot检测显示,Twist、 Survivin和hTERT蛋白的表达量呈递减趋势,P<0.01,p53蛋白的表达微弱上调,P<0.01.结论:随着棘霉素剂量的增加,细胞凋亡率显著增加.棘霉素能够抑制与肝癌生长密切相关基因的Twist、Survivin和hTERT mRNA表达,促进p53 mRNA表达上调,相应蛋白的表达呈下调和上调.棘霉素可能通过抑制肝癌细胞的生长、转移和促进肝癌细胞的凋亡起到抑制肿瘤生长的作用.     

靶向IGF1R的siRNA抑制人肝癌细胞SMMC7721裸鼠移植瘤的实验研究

背景与目的:利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制哺乳动物基因表达已成为研究基因功能的一种有效方法.本研究探讨人胰岛素样生长因子1类受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)的短发夹环RNA对人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤的抑制作用.方法:设计并合成特异性靶向IGFIR的siRNA片段,构建SMMC7721-IGFlR-siRNA表达质粒,将其转入SMMC7721细胞.通过G418筛选出稳定株,移植裸鼠成瘤.同时设立对照组.根据体积的均数值绘制肿瘤生长曲线,以HE染色法观察质粒处理后瘤组织的病理改变,Western blot检测肿瘤组织中IGF1R的表达变化,免疫组化SP法检测检测瘤组织内微血管密度,原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况.结果:SMMC7721-IGF1R-siRNA组肿瘤体积与SMMC7721-IGF1R-mutation组、SMMC7721组相比差异有统计学意义(P＜0.05).病理学检查及TUNEL检测发现,SMMC7721-IGF1R-siRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞凋亡指数[(50.2±6.4)%]明显高于SMMC7721.IGF1R-mutation 组[(5.4±1.0)%]和SMMC7721组[(6.0±2.1)%](P＜0.05).SMMC7721-IGF1R-siRNA组与SMMC7721-IGF1R-mutation 组、SMMC7721相比,瘤内IGFIR蛋白表达明显下调.SMMC7721-IGF1R-siRNA组微血管密度(11.3±4.4)与SMMC7721-IGF1R-mutation组(36.7±7.6)、SMMC7721组(28.4±6.5)相比明显下降(P＜0.05).结论:构建的SMMC7721-IGF1R-siRNA具有RNA干扰作用,能抑制SMMC7721细胞裸鼠移植瘤的生长.     

肝细胞癌差异表达基因P-02反义寡核苷酸抑瘤作用的体外实验研究

目的 :通过全硫代修饰的肝细胞癌差异表达基因P 0 2反义寡核苷酸对人肝癌细胞系SMMC 772 1增殖活性的影响 ,探讨P 0 2基因的功能。方法 :以脂质体为载体 ,采用MTT法、RT PCR、流式细胞术检测P 0 2AS ODN(antisenseoligonucleotide)对SMMC 772 1细胞生长、增殖、细胞周期的作用。结果 :脂质体介导的P 0 2基因反义寡核苷酸可抑制SMMC 772 1增殖 ,RT PCR结果显示P 0 2基因的扩增条带明显减弱 ,流式细胞术显示G1期细胞增多 ,M期及S期细胞数减少。结论 :脂质体介导的AS ODN可抑制SMMC 772 1的恶性表型 ,证实P 0 2基因在肝细胞癌的发生发展中可能有重要作用     

人DNA MTase反义基因转染诱导E-钙黏附蛋白高表达

目的：观察人DNA MTase反义基因转染后肝癌细胞系SMMC－7721 E－钙黏附蛋白表达的变化。方法：用基因重组技术构建包含人DNA MTase正,反义基因片段的真核表达载体,采用脂质体法将其转染人肝癌细胞系SMMC－7721,采用RT－PCR法观察DNA MTase基因mRNA,E-钙黏附蛋白基因mRNA表达变化;以甲基化特异的PCR法检测E－钙黏附蛋白基因启动子区域甲基化状态的改变,以免疫组化和流式细胞法检测E－钙黏附蛋白表达变化。结果：正、反义真核表达载体构建成功并转染入SMMC－7721细胞,其中DNA MTase基因mRNA表达减低,E－钙黏附蛋白基因mRNA表达上调,E－钙黏附蛋白基因启动子区域呈现去甲基化状态,E－钙黏附蛋白表达上调。结论：抑制DNA MTase基因的表达可使肝癌SMMC－7721细胞中E－钙黏附蛋白基因启动子区域去甲基化和表达增加,DNA MTase通过诱导启动子区域高甲基化,可使E－钙黏附蛋白基因低表达。     

下调UHRF1的表达在抑制肝癌进展中的作用

目的 探讨UHRF1的异常表达在肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）进展中的作用机制。方法 采用RT-PCR和Western blot法检测UHRF1在20例HCC标本中的mRNA和蛋白表达水平, Western blot法检测不同转移潜能的肝癌细胞HepG2、SMMC7721、MHCC97L和HCCLM3中的UHRF1 的表达水平;siRNA技术干扰HCCLM3细胞中UHRF1表达后,MTT法检测细胞增殖,Western blot 法检测BAX和BCL-2表达水平的改变,流式细胞术检测HCCLM3细胞周期和细胞凋亡的变化。结 果 UHRF1在肺癌组织中的表达水平较癌旁组织显著上调（P<0.05）,随着肝癌细胞转移潜能升高而UHRF1表达水平也依次升高（P<0.01）;siRNA技术干扰HCCLM3细胞中UHRF1表达后,HCCLM3细胞生长速度明显下降（P＜0.05）,HCCLM3细胞的促凋亡蛋白BAX表达水平明显上升,而抑凋亡蛋白BCL-2表达水平明显下降;UHRF1-siRNA干扰HCCLM3细胞48 h时,细胞周期分布无明显影响（P＞0.05）;但UHRF1表达下调有促凋亡作用,与对照组相比,干扰组的细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 UHRF1基因在肝癌组织中表达上调,下调UHRF1的表达能够抑制肝癌进展,可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。     

Pokemon基因在肝癌细胞中的表达及意义

目的探讨Pokemon在肝癌细胞中的表达及意义,进一步阐明肝细胞癌发生发展过程中的分子机制。方法选择肝癌细胞HepG2、SMMC7721和人胚胎肝细胞LO2细胞株,应用Western blot法检测Pokemon在不同细胞中的表达;应用基因沉默方法抑制Pokemon在肝癌细胞中的表达,应用流式细胞仪观察肝癌细胞的凋亡情况。结果Pokemon在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中的表达明显高于人胚胎肝细胞LO2;siRNA抑制Pokemon的表达后,肝癌细胞凋亡明显增加。结论原癌基因Pokemon在肝癌细胞中表达明显增高,Pokemon可能在肝癌的发生、发展过程中起重要作用。     

RNA干扰抑制BMP-2基因表达对人肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响

目的：设计并化学合成针对骨形态发生蛋白2（BMP-2）的siRNA分子片段,转染人肝癌SMMC7721细胞,观察其对SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响。方法：阳离子脂质体法瞬间转染SMMC7721细胞,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western印迹法检测转染BMP-2-siRNA后细胞BMP-2 mRNA水平和蛋白水平的变化,MTT法和流式细胞术检测转染BMP-2-siRNA后SMMC7721细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化。结果：3对特异性BMP-2-siRNA均有效地抑制了BMP-2基因的表达,以siRNA-B抑制效果最好。转染BMP-2-siRNA后SMMC7721细胞的增殖能力明显受到抑制( P <0.05)且明显促进了SMMC7721细胞的凋亡。结论：靶向BMP-2基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝癌SMMC7721细胞的增殖并促进其凋亡     

索拉非尼及PI3K、mTOR抑制剂对肝胆肿瘤细胞增殖及Ghrelin基因表达的影响

目的 探讨索拉非尼及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂对肝胆肿瘤细胞增殖及Ghrelin（GHRL）基因表达的影响。方法 收集体外常规培养的肝癌SMMC7721细胞和胆管癌QBC939细胞,经不同浓度（0、50、100、200 μmol/L）索拉非尼、LY294002（PI3K抑制剂）及Rapamycin（mTOR抑制剂）处理48 h后,采用MTS细胞活性检测试剂盒检测SMMC7721、QBC939细胞的增殖率,实时定量PCR（qPCR）检测SMMC7721、QBC939细胞中GHRL 基因的mRNA水平。结果与对照组相比,LY294002、索拉非尼和Rapamycin处理后的SMMC7721、QBC939细胞的增殖率均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,且随着药物浓度的增加,两种细胞的增殖率均降低（P＜0.05）。qPCR结果显示,经LY294002和索拉非尼处理48 h后的SMMC7721细胞中GHRL mRNA水平与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）;与对照组相比,随着Rapamycin作用浓度的升高,实验组SMMC7721细胞的GHRL mRNA水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;经LY294002、索拉非尼和Rapamycin处理的QBC939细胞中GHRL mRNA水平高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 三种药物均可以抑制肝癌和胆管癌细胞的增殖并促进QBC939细胞的GHRL表达,但仅Rapamycin能上调SMMC7721肝癌细胞的GHRL基因表达。GHRL基因表达与肝癌和胆管癌的发生可能有密切关系。     

人肝癌细胞差异表达基因纤维蛋白原γ-多肽的克隆与鉴定

背景与目的：肝细胞癌(肝癌)的发生、发展与基因的异常表达有关,但详细机制还不清楚,原因在于目前所知的遗传学信息尚欠充分;本研究旨在探索新的人肝癌细胞差异表达基因。方法：应用抑制性消减杂交技术获得肝癌细胞消减cDNA,以T／A方法进行克隆,通过DNA测序分析、Norahem印迹杂交、cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)和RT-PCR等方法加以鉴定。结果：在被克隆的消减cDNA之中,一个长度为787个核苷酸的差异表达cDNA片段经Northem印迹分析,发现其在两种人肝癌细胞株SMMC-772l和HepG2中的表达均明显高于正常肝细胞;经过RACE后获得一个长度为1597bp、具有3’端polyA结构的基因序列,它含有完整的开放阅读框,编码437个氨基酸,经同源性分析证实该基因为编码人纤维蛋白原γ-多肽(fibrinogen gamma polypeptide,FGG)的基因;RT-PCR分析证明癌组织中FGG mRNA表达水平较癌旁非癌组织明显增加,尤其是在肝癌转移灶中。结论：SMMC-772l和HepG2细胞中发现FGG高表达,FGG基因的上调表达是肝癌病理过程中一个重要分子事件。