巨噬细胞内表达的人颗粒溶素对胞内结核分枝杆菌的杀菌活性

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)的真核表达质粒并探讨其表达后对巨噬细胞RAW264.7内结核分枝杆菌的杀菌能力.方法利用套式PCR从同种异型抗原激活的人CTL中扩增出GLS基因,并克隆入pBudCE4.1载体,构建重组质粒.将其转染至感染结核分枝杆菌H37Rv的巨噬细胞株RAW264.7中,套式PCR、免疫荧光检测GLS表达;转染96 h后裂解细胞作抗酸染色及菌落计数,检测GLS细胞内直接杀菌活性.数据行t或t'检验.结果成功构建携带GLS的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS;在转染的已感染H37Rv巨噬细胞株RAW264.7中,从转录和翻译水平都检测到目标基因GLS的表达产物;转染96 h,佛波酯+pBudCF4.1/GLS组、佛波酯+pBudCE4.1组与未激活初始巨噬细胞荷菌量分别为(1.44±1.25)、(3.16±0.20)和(3.59±0.21)个,两两比较,差异均有统计学意义(t=2.403,t=2.854,均P＜0.05).结论携带人GLS的真核表达质粒在巨噬细胞表达后具有明显的杀菌活性,为进一步作为结核基因治疗疫苗的应用提供了实验依据.     

科罗索酸对SMMC-7721细胞生长抑制作用的初步研究

目的研究中药猫人参中提取的三萜化合物科罗索酸（CRA）对人肝癌SMCC-7721细胞生长的影响。方法 MTT法检测不同浓度下细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MitoCapture染色观察CRA作用后细胞线粒体膜电位的改变,并进一步用Western blot法检测线粒体对细胞色素C释放情况及Bax、Bcl-2表达情况的影响。结果 35μmol/L的CRA可明显抑制SMMC-7721细胞存活并具有凋亡诱导作用;CRA可使线粒体膜电位耗散,使细胞色素C由线粒体内释放入胞质;CRA可增加Bax表达而对Bcl-2表达无明显影响。结论猫人参提取物CRA可能经由线粒体途径及上调Bax表达、增加Bax/Bcl-2比率诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡。     

抗人VEGF发卡状核酶基因的构建及其对肝癌细胞VEGF蛋白表达的影响

利用计算机辅助设计合成针对人VEGF的发卡状核酶（RZ）,定向亚克隆于真核表达载体pcDNA3．1^＋中,转染肝癌细胞SMMC-7721,RT—PCR鉴定。ELISA法和MTT法检测SMMC-7721细胞对照组、SMMC-7721／pcDNA3．1^＋空载体对照组和SMMC-7721／RZ基因转染组细胞VEGF表达和增殖情况,流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡情况。结果为SMMC-7721／RZ基因转染组细胞VEGF表达水平和细胞增殖速率显著低于SMMC-7721细胞对照组和SMMC-7721／pcDNA3．1’空载体对照组。MC-7721／RZ基因转染组细胞出现凋亡峰,其凋亡率达11．O％,而细胞对照和空载体细胞对照均末出现。认为SMMC-7721／RZ转基因细胞株的成功构建和生物学特性的初步研究为进-步建立裸鼠人肝癌模型及评价RZ对体内肝癌生长的抑制作用奠定了-定的基础。     

羟基喜树碱诱导SMMC-7721细胞凋亡时线粒体凋亡诱导因子的转位研究

目的研究羟基喜树碱诱导肝癌细胞株SMMC-7721凋亡时线粒体凋亡相关蛋白凋亡诱导因子表达及从线粒体发生核转位的变化.方法用80 μg/ml羟基喜树碱作用于肝癌细胞株SMMC-7721后,用吖啶橙/溴化乙啶染色法观察细胞凋亡现象;用电子显微镜观察线粒体超微结构;分别用逆转录聚合酶链反应、Western blot检测凋亡诱导因子在mRNA与蛋白质水平表达的变化;用激光共聚焦显微镜观察凋亡诱导因子在细胞凋亡时从线粒体到核的迁移变化.结果 80μg/ml羟基喜树碱作用SMMC-7721细胞后,吖啶橙/溴化乙啶荧光双重染色可见细胞体积缩小、细胞皱缩、核碎裂等典型细胞凋亡形态学改变;超微结构观察发现线粒体肿胀;细胞凋亡时凋亡诱导因子在mRNA与蛋白质水平上的表达与对照组细胞相比没有明显变化,但凋亡诱导因子发生了从线粒体到核的迁移. 结论羟基喜树碱可以通过线粒体途径诱导人肝癌细胞发生凋亡;在线粒体凋亡途径中,线粒体凋亡相关蛋白凋亡诱导因子从线粒体释放并发生核转位可能与羟基喜树碱诱导细胞凋亡密切相关.     

αB-晶状体蛋白与凋亡相关蛋白相互作用抑制C2C12细胞凋亡

目的 探讨aB-晶状体蛋白抗心肌细胞凋亡的分子机制。方法构建带6个串联组氨酸的aB-晶状体蛋白表达质粒(pcDNA3.1一aBC)，经测序证实后，转染C2C12肌原细胞株，筛选稳定高表达aB-晶状体蛋白的细胞株。采用H2O2(0.5mmol/L)诱导细胞凋亡，检测线粒体细胞色素C释放率和细胞膜磷脂酰丝氨酸细胞色素荧光     

沉默热休克蛋白70-2基因经线粒体依赖通路介导肝癌细胞凋亡

目的 探讨沉默热休克蛋白(HSP)70-2对肝癌细胞生长、凋亡的影响,以及诱导肝癌细胞凋亡的详细作用机制. 方法 Westem blot、免疫细胞化学法检测HSP70-2在4种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达.设计合成针对HSP70-2基因的特异性短发夹状RNA(shRNA),构建真核表达载体HSP70-2 shRNA1和HSP70-2 shRNA2.转染肝癌细胞后,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖,膜联蛋白/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡情况,罗丹明染色检测细胞线粒体跨膜电位变化,Western blot检测多聚ADP-核糖聚合酶、caspase-3、caspase-9蛋白切割情况,以及细胞色素C、Bax,Bcl-2蛋白的表达变化. 结果 HSP70-2在4种肝癌细胞中均高表达,在L02细胞中仅有微量表达.HSP70-2 shRNA1、shRNA2均能有效抑制肝癌细胞中HSP70-2的表达.沉默HSP70-2基因显著抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,转染48 h后,shRNA1和shRNA2诱导HepG2细胞的凋亡指数分别为55.8%±1.8%和57.1%±1.6%,诱导Huh细胞凋亡指数分别为54.9%±1.1%和60.2%±2.6%,与对照组相比,差异均有统计学意义,P值均＜0.01.转染HSP70-2 shRNA 48 h后,肝癌细胞线粒体跨膜电位显著下降,细胞色素C从线粒体释放到胞质中,caspase-3、caspase-9激活,多聚ADP核糖聚合酶被剪切降解,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达明显增加.结论 沉默HsP70-2能通过激活线粒体凋亡通路导致肝癌细胞凋亡.     

survivin反义寡核苷酸对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响.方法 人工合成survivin基因ASODN和正义ODN(SODN),并行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径转染SMMC-7721;分别用RT-PCR和Western blot检测survivin mRNA和蛋白表达;用MTT法检测ASODN对SMMC-7721增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡率;倒置显微镜观察细胞形态变化.结果 SMMC-7721可强表达survivin mRNA和蛋白;ASODN呈浓度依赖性抑制survivin mRNA和蛋白表达及SMMC-7721增殖,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M期.SODN对survivin mRNA和蛋白及SMMC-7721的增殖、细胞周期无明显抑制作用.结论 脂质体介导转染survivin ASODN可抑制细胞增殖、使细胞阻滞于G2/M期,从而促进细胞凋亡.     

生存素反义核酸诱导肝癌细胞株SMMC-7721凋亡和增加其对抗肿瘤药物敏感性的研究

背景：生存素是凋亡抑制蛋白家族的重要成员，生存素基因有可能成为肿瘤反义基因治疗的理想靶基因。目的：研究生存素反义核酸诱导肝癌细胞株SMMC-7721凋亡和增加其对常用抗肿瘤药物敏感性的作用，探讨生存素反义核酸用于肿瘤基因治疗的可能性。方法：应用基因重组技术构建pEGFP-C1-生存素反义核酸重组质粒，以脂质体转染法转染SMMC．7721细胞，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测生存素mRNA的表达，用流式细胞仪检测细胞凋亡。将生存素反义核酸分别与7种常用抗肿瘤药物共同作用于SMMC-7721细胞，用四唑蓝(MTT)比色法测定细胞杀伤率。结果：生存素反义核酸可抑制SMMC-7721细胞中生存素mRNA的表达，从而导致细胞凋亡增加，其作用呈剂量依赖性。生存素反义核酸可增加SMMC-7721细胞对7种常用抗肿瘤药物的敏感性，明显增强药物的杀伤作用。结论：生存素反义核酸能靶向抑制野生型生存素基因的表达，提高肝癌细胞对常用抗肿瘤药物的敏感性，有可能成为肿瘤基因治疗的新方法。     

原癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:克隆大鼠原癌基因pim-3并构建真核表达重组质粒pEGFP-N2／pim-3,观察他在真核细胞SMMC-7721中的表达情况以及对细胞凋亡的影响．方法:利用TRIzol从液氮保存的大鼠骨骼肌组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获取pim-3 cDNA,并构建重组质粒pEGFP-N2／pim-3,转化用CaCl2法制备的大肠杆菌JM-109菌株,酶切以及测序鉴定．将重组质粒通过脂质体介导转染肝癌SMMC-7721细胞后利用倒置荧光显微镜观察基因表达情况,并利用流式细胞术及MTT比色实验对转染细胞的生物学行为进行检测．结果:将RT-PCR产物全部用于低熔点琼脂糖凝胶电泳、回收,在DL 2000 Marker 1000 bp附近可见清晰条带,与实验设计符合;阳性克隆质粒的酶切电泳和测序结果表明,大鼠pim-3 cDNA的克隆和重组质粒pEGFP-N2／pim-3的构建成功;重组质粒pEGFP-N2/pim-3转染组凋亡细胞占3．5％,质粒pEGFP-N2转染组凋亡细胞占10．7％,而仅加入转染液的空白组凋亡细胞占11．0％,重组质粒转染组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0．05);倒置荧光显微镜可以观察到pim-3在SMMC-772 1细胞中的正常表达;MTT比色实验显示原癌基因pim-3能够明显抑制细胞凋亡．结论:真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3构建成功;原癌基因pim-3能明显抑制肝癌细胞凋亡．     

羟基喜树碱诱导SMMC-7721细胞线粒体跨膜电位耗散的蛋白质组分析

目的比较蛋白质组,分析羟基喜树碱诱导肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡前后的线粒体蛋白质表达谱。方法用羟基喜树碱诱导肝癌SMMC-7721细胞发生线粒体跨膜电位耗散,提取线粒体并用Western blot法对线粒体纯度进行鉴定；用二维凝胶电泳分离溶解度不同的3种蛋白质组分并对蛋白质进行银染色；利用PDQuest图像分析软件分析比较凝胶结果,获得差异蛋白质；采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定部分差异蛋白质,并用Western blot法对部分差异蛋白质进行进一步的鉴定。结果羟基喜树碱成功地诱导线粒体发生跨膜电位耗散,并获得纯度很高的线粒体；通过PDQuest图像分析软件发现,线粒体发生跨膜电位耗散前后比较约有39个蛋白质点表达有差异,对其中28个差异蛋白质斑点进行了肽质指纹图分析,鉴定出20种可能的蛋白质。结论获得了羟基喜树碱诱导线粒体凋亡前后差异蛋白的相关信息,为从蛋白质水平进一步研究羟基喜树碱诱导癌细胞发生凋亡的机制奠定了基础。     

人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒的构建及其在RAW264.7细胞中的表达

目的构建人天然颗粒溶素（Granulysin，GLS）和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM02并在RAW264．7细胞中进行表达。方法将人GLS和小鼠单链IL-12基因同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4．1中，得到真核共表达质粒pZM02，以pZM02转染小鼠巨噬细胞株RAW264．7，通过RT-PCR、免疫细胞化学和ELISA的方法检测目的基因的表达。结果在转染后的RAW264．7细胞中同时检测到了人GLS和小鼠IL-12的表达。结论人GLS能够与小鼠IL-12在小鼠巨噬细胞株RAW264．7中实现共表达，pZM02的成功构建为进一步研究GLS与IL-12的协同细胞免疫作用机制和免疫治疗作用奠定了基础。     

双萘酰亚胺类化合物诱导SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的 观察双萘酰亚胺类化合物(C8)对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的作用. 方法 四甲基偶氮唑盐法检测C8对SMMC 7721细胞的抑制情况;流式细胞术检测细胞周期和凋亡率;Western blot检测Bcl 2蛋白表达量;流式细胞术分析细胞内Bcl 2蛋白量;酶联免疫法检测Caspase9和Caspase 3表达量. 结果 C8抑制SMMC 7721细胞增殖,半数抑制浓度为15 umol/L.C8作用浓度在10,15、20 umol/L时,SMMC 7721细胞的凋亡比例分别为16.8%、29.4%和35.8%,对照组为2.1%,SMMC 7721细胞的凋亡率明显高于对照组,P<0.01.细胞内Bcl-2蛋白表达水平下降.酶联免疫检测结果表明Caspase 9和Caspase 3被活化.结论 C8可诱导人肝癌SMMC 7721细胞的凋亡,为抗肿瘤药物的研究提供新的化合物.     

Growth-inhibitory effects of MOB2 on human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721

AIM:To investigate the growth-inhibiting and apoptosis-inducing effects of the gene MOB2 on human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721.METHODS:The full-length cDNA of the MOB2 gene was amplified from human umbilical vein endothelial cells.The correct full-length MOB2 cDNA was subcloned into the eukaryotic expression vector pEGFP-C1.After lipofection of the MOB2 gene into cancer cells,the levels of MOB2 protein in the cancer cells were detected by immunoblotting.To transfect the recombined plasmid vector pEGFP-CI-MOB2 into SMMC-7721 cells,the cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle'sMedium with 10% fetal calf serum and glutamine,and then mixed with liposomes,Lipofectamine 2000 and the plasmid vector pEGFP-CI-MOB2.RESULTS:We observed the growth and proliferation of SMMC-7721 cells containing pEGFP-CI-MOB2 and analyzed their apoptosis and growth cycle phases by flow cytometry.We successfully transfected the recombined plasmid vector pEGFP-CI-MOB2 into SMMC-7721 cells and screened for a single clone cell containing MOB2.After transfection,MOB2 enhanced growth suppression,induced apoptosis,increased the ratio of G0/G1,significantly inhibited the advance of cell cycle phase,and arrested cells in G0/G1 phase.CONCLUSION:MOB2 overexpression induces apoptosis and inhibits the growth of human hepatic cancer cells,which may be useful in gene therapy for hepatic carcinoma.     

Downregulation of alpha-fetoprotein siRNA inhibits proliferation of SMMC-7721 cells

AIM: To study the function of α-fetoprotein (AFP) in SMMC-7721 hepatoma cells. METHODS: A hairpin siRNA expressing plasmid pSilencer3.0-H1-afp was constructed and transfected into SMMC-7721 cells with Lipofectamine 2000. The expression of AFP was monitored by real-time RT-PCR and immunoassays, its effect on SMMC-7721 cell proliferation and cell death was detected by MTT and fluorescenceactivated cell sorter (FACS). RESULTS: The AFP-siRNA expressing plasmid downregulated the expression of AFP obviously (about 34%), and inhibited SMMC-7721 cell proliferation, but did not induce apoptosis. CONCLUSION: Downregulation of AFP siRNA inhibits proliferation of SMMC-7721 cells, but cannot cause apoptosis.     

Knockdown of survivin gene expression by RNAi induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

AIM: To investigate the survivin gene expression in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 and the effects of survivin gene RNA interference (RNAi) on cell apoptosis and biological behaviors of SMMC-7721 cells. METHODS: Eukaryotic expression vector of survivin gene RNAi and recombinant plasmid pSuppressorNeo-survivin (pSuNeo-SW), were constructed by ligating into the vector, pSupperssorNeo (pSuNeo) digested with restriction enzymes Xba I and Sail and the designed double-chain RNAi primers. A cell model of SMMC-7721 after treatment with RNAi was prepared by transfecting SMMC-7721 cells with the lipofectin transfection method. Strept-avidin-biotin-complex (SABC) immunohistochemical staining and RT-PCR were used to detect survivin gene expressions in SMMC-7721 cells. Flow cytometry was used for the cell cycle analysis. Transmission electron microscopy was performed to determine whether RNAi induced cell apoptosis, and the method of measuring the cell growth curve was utilized to study the growth of SMMC-7721 cells before and after treatment with RNAi. RESULTS: The eukaryotic expression vector of survivin gene RNAi and pSuNeo-SW, were constructed successfully. The expression level of survivin gene in SMMC-7721 cells was observed. After the treatment of RNAi, the expression of survivin gene in SMMC-7721 cells was almost absent, apoptosis index was increased by 15.6%, and the number of cells was decreased in G2/M phase and the cell growth was inhibited. CONCLUSION: RNAi can exert a knockdown of survivin gene expression in SMMC-7721 cells, and induce apoptosis and inhibit the growth of carcinoma cells.     

熊果酸诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的：观察熊果酸（UA）对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制及诱导其凋亡作用。方法：MTT法检测5、10、20、30、40、50μmol/L UA对SMMC-7721细胞生长的抑制作用,吖啶橙（AO）荧光染色、电镜和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：UA能显著抑制SMMC-7721细胞的增殖,其作用呈剂量依赖性。35.2μmol/L UA作用SMMC-7721细胞48小时后AO染色,荧光显微镜下可见细胞出现体积缩小,核碎裂,染色质凝集等凋亡形态改变;电镜下SMMC-7721细胞出现明显的细胞凋亡的形态学改变,细胞核染色质出现边聚和中聚,细胞内部分线粒体肿胀;SMMC-7721细胞凋亡率为（67.91±5.24）%,与对照组（2.95±0.56）%比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结论：UA通过诱导SMMC-7721细胞凋亡抑制其生长。     

细胞色素P450 3A4及谷胱甘肽S转移酶A1重组质粒的构建及表达

目的构建重组质粒pBudCE4.1-细胞色素P450 3A4(CYP3A4)-谷胱甘肽S转移酶A1(GSTA1),使CYP3A4和GSTA1可在真核细胞C3A中表达,并且增加其表达量。方法从含有GSTA1和CYP3A4的开放阅读框(ORF)克隆中扩增GSTA1和CYP3A4基因;将片段GSTA1以及载体pBuDCE4.1双酶切后连接并转化,质粒命名为pBuDCE4.1-GSTA1;将片段CYP3A4以及质粒pBuDCE4.1-GSTA1双酶切后连接并转化,所得重组质粒命名为pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1;测序验证重组克隆中目的基因片段的序列信息;构建稳定细胞系,测定CYP3A4活性及GSTA1的表达情况。结果酶切及测序验证双表达重组质粒pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1构建成功,CYP3A4及GSTA1在转染细胞系中的表达量增多。结论构建成的双表达重组质粒pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1符合应用要求。     

血管内皮细胞生长因子反义核糖核酸对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)反义RNA转染人肝癌细胞后对细胞体内外生物学性状的影响。方法 将含正义、反义VEGFcDNA序列的质粒PCMV—VEGF、PCMV—FGEV及空载体质粒pcDNA3.1,在脂质体介导下导入SMMC—7721肝癌细胞,分别称为正义、反义及对照组,并通过G418筛选获得阳性克隆。细胞原位杂交和免疫组织化学方法检测转染后VEGF在肝癌细胞内的表达情况;MTT法和FCM检测转染后细胞在体外的增殖和凋亡情况;并制备裸鼠动物模型,观察转染后细胞的体内生长情况。结果 转染PCMV—FGEV后肝癌细胞内VEGF的转录及其蛋白的表达水平显著下降,但转染后体外细胞的增殖与凋亡情况均无明显变化。转染PCMV—FGEV后细胞在裸鼠体内的生长缓慢,反义组成瘤时间为(25.0±1.8)d,明显长于正义组(15.7±2.5)d和对照组(18.5±2.1)d,F=19.455,P<0.01;而平均瘤重以反义组最轻,为(0.96±0.28)g,F=21.501,P<0.01;同时反义组裸鼠肿瘤细胞发生明显的凋亡。结论 VEGF反义RNA转染人肝癌细胞可抑制肿瘤细胞VEGF的表达,在体外对细胞增殖和凋亡无影响,而体内可显著诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长。