17β-雌二醇对人根尖牙乳头干细胞RANKL、OPG表达影响的研究

目的:探讨17β-雌二醇对人根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs)核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响。方法:通过酶消化法分离培养SCAPs,将SCAPs分别于对照组(普通培养基+10μmol/L无水乙醇)和含0.1μmol/L17β-雌二醇的培养基培养3d和7d后,实时荧光定量PCR法和蛋白质免疫印迹法分别检测RANKL、OPG mRNA和蛋白表达。结果:17β-雌二醇刺激3d和7d组,OPGmRNA和蛋白表达均较对照组升高(P<0.01),RANKL mRNA和蛋白表达均较对照组降低(P<0.01)。结论:17β-雌二醇可能通过调节RANKL/OPG系统,参与调节SCAPs成牙/骨及破牙/骨活性。     

静压力对人牙周膜干细胞骨向分化能力的影响

目的:观察静压力对人牙周膜干细胞(h PDLSCs)骨向分化能力的影响。方法:体外培养h PDLSCs,并将其随机分为4个组;置于压力加载装置内分别给予0(对照组)、20、100、200 k Pa的静压力刺激,连续加压6 h后分别采用Quantitative RT-PCR和Western-blots法检测h PDLSCs的破骨细胞核因子KB受体活化因子配基(RANKL)及骨保护因子(OPG)的表达。结果:与对照组相比,当压力值为20 k Pa时,RANKL mRNA和蛋白的表达量变化不明显(P>0.05),但OPG的表达量明显升高(P<0.05),RANKL/OPG的比值明显降低(P<0.05);当压力值为100 k Pa时,RANKL mRNA和蛋白的表达量明显升高(P<0.05),但OPG的表达量降低(P<0.05),RANKL/OPG的比值明显升高(P<0.05);当压力值为200 k Pa时,RANKL、OPG mRNA和蛋白的表达量均明显降低(P<0.05),其中以RANKL下降的程度更加明显,RANKL/OPG的比值明显降低(P<0.05)。结论:持续的静压力作用可使h PDLSCs表达OPG和RANKL的水平发生明显变化,并具有力值依赖性。     

中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞RANKL／OPG表达的影响

目的：探讨中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达的影响。方法：将系列浓度的中间普氏菌培养上清作用于牙龈成纤维细胞,显微镜下观察细胞的变化。实时定量 RT-PCR法和 Western blot法分别检测 RANKL、OPG mRNA及蛋白水平的表达,并计算 RANKL/OPG的比值。结果：牙龈成纤维细胞的数量随中间普氏菌培养上清浓度的增加而减少,50μg/mL 时,显微镜下没有活细胞存在。在mRNA水平上和蛋白水平上,RANKL/OPG的比值在12．5μg/mL处理组均高于对照组,差异具有统计学意义（P＜0．01）。结论：中间普氏菌培养上清可诱导人牙龈成纤维细胞表达 RANKL 和 OPG,破坏 RANKL/OPG比例的平衡,影响破骨细胞分化的细胞因子微环境,在破骨细胞分化和牙周炎骨吸收中起着一定的调节作用。     

前列腺素E2对人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达的影响

目的：探讨前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）对人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）mRNA表达的影响。方法：将体外培养的人牙周膜成纤维细胞用不同浓度（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol/L）的PGE2分别处理2、8、24、48h,使用Trizol抽提总RNA,通过半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来观察人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达强度变化。结果：10^-9～10^-6mol/LPGE2在2～24h可上调人牙周膜成纤维细胞RANKL mRNA的表达,但抑制OPGmRNA的表达,且RANKL/OPG比率呈上升趋势。结论：PGE2有可能通过调节人牙周膜成纤维细胞的RANKL/OPG mRNA表达比例,从而间接地调节破骨细胞的分化和活性。     

脂磷壁酸诱导根尖骨吸收调控蛋白的表达

目的研究难治性根尖周炎重要病原菌粪肠球菌脂磷壁酸对骨吸收核心调控系统,核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和骨保护素(OPG)蛋白表达的影响。方法采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测0.1、1.0、10.0、20.0mg/L脂磷壁酸作用24、48、72h后对人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)增殖的影响。细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测脂磷壁酸刺激HPDLFs 24h后RANKL、OPG表达水平及RANKL/OPG值的变化。结果脂磷壁酸抑制HPDLFs增殖具有浓度和时间依赖性。10.0mg/L脂磷壁酸刺激24h后,HPDLFs中RANKL、OPG蛋白表达均增加,RANKL的增长速度较OPG快,脂磷壁酸上调RANKL/OPG值具有浓度依赖性,高浓度组明显大于对照组(P<0.05)。结论脂磷壁酸对牙周膜成纤维细胞增殖具有抑制作用,可上调细胞RANKL、OPG表达及RANKL/OPG值,推测其在难治性根尖周炎骨吸收中扮演重要作用。     

RANKL和OPG在种植体周围软组织及骨组织的表达变化

目的：研究破骨细胞核因子κB受体活化因子配基（receptor activator nuclear factor kappa B ligand,RANKL）及其伪受体骨保护因子（osteoprotegerin,OPG）在非负荷期种植体周围软组织和骨组织中的表达变化及时间分布特点。方法：选用6只1-2岁龄左右的雄性Beagle犬建立种植义齿动物模型,分别观测种植体植入后3d、7d、15d、30d、60d和90d,种植体周围的骨改建情况。取种植体周围软组织进行实时荧光定量PCR,取犬下颌骨进行大体标本观察拍摄X线片,取种植体周围骨组织进行免疫组化染色,检测RANKL和OPG随时间的表达变化及分布特点。结果：骨改建的最活跃期为种植体植入后的第7d,种植体周围软组织中的RANKL和OPG mRNA及骨组织中的RANKL和OPG均随种植体植入时间的增加而增加,第7d达高峰,而后均逐渐降低。RANKL和OPG在种植体周围软组织及骨组织中的表达变化规律一致。结论：OPG和RANKL能在种植体周围软组织中表达,且变化规律与种植体周围骨组织改建过程一致。种植体周围组织可以通过OPG/RANKL系统参与破骨细胞的形成,调节骨质吸收,影响骨组织代谢微环境。     

实验性大鼠根尖周炎骨质破坏与RANKL／OPG关系的研究

[摘要]目的：观察核因子-κB受体活化因子配体（receptoractivatorfornuclearfactor-κB ligand,RANKL）、骨保护素（osteoprote—gerin,OPG）在大鼠根尖周炎发展各阶段表达的变化与根尖周病损发展之间的关系。方法：选取8周龄雄性Wistar大鼠,随机一侧下颌第一磨牙为实验组,对侧下颌第一磨牙作为对照组;术后1、3、7、14、21d处死动物,拍摄颌骨x线片,计算根尖周骨破坏面积;组织切片,免疫组织化学检测根尖周组织中RANKL、OPG的表达。结果：根尖周骨破坏面积自术后3d开始显著增大,21d达到峰值,呈时间依赖关系;RANKL的表达量在3d组明显增高,7d组表达量到达峰值,14d组开始下降;OPG的表达量在1d组即出现有显著性上升,3d组表达趋于平缓,21d组达峰值。RANKL、OPG的变化与根尖周病变发展的变化趋势有着显著相关性。结论：RANKL／OPG系统在根尖周炎炎症性骨质破坏机制中起重要调节作用。     

骨保护蛋白在牙周组织再生中的应用

核因子-KB受体活化因子配体(RANKL)/核因子-κB受体活化因子(RANK)/骨保护蛋白(OPG)是调节破骨细胞分化和成熟以及骨吸收功能的关键因子,在牙周炎发病中起重要的调节作用.OPG可抑制破骨细胞的分化,抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性并诱导其程序性死亡.本文就RANKL/OPG调节系统、RANKL/OPG调节系统...     

白细胞介素22对人牙周膜成纤维细胞核因子κB受体活化因子配体、骨保护素表达的影响

目的探讨白细胞介素22（IL-22）对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）表达核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）的影响;并进一步研究IL-22是否与牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）具有协同刺激作用。 方法酶消化法结合组织块法原代培养hPDLF,免疫细胞化学染色法鉴定其来源;取第3~ 5代细胞给予不同浓度（0、5、10、25、50、100 ng/mL）IL-22刺激,培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒（CCK-8）进行细胞毒性实验;采用5、10、25 ng/mL IL-22作用于hPDLF 72 h,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测RANKL、OPG mRNA的表达;随后选择最佳刺激浓度10 ng/mL IL-22,与1 μg/mL Pg-LPS分别或协同刺激hPDLF 72 h,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测RANKL、OPG mRNA和蛋白水平的表达。采用单因素方差分析对数据进行统计分析。 结果50、100 ng/mL IL-22刺激hPDLF后,细胞活力明显下降（F_{24 h}= 15.17,F_{48 h}= 76.37,F_{72 h}= 24.409,P<0.05）;5、10、25 ng/mL IL-22均可上调hPDLF RANKL mRNA表达（F= 32.88,P<0.05）,但是对OPG mRNA表达无明显影响（F= 0.719,P= 0.555）;10 ng/mL组和25 ng/mL组上调RANKL mRNA表达较5 ng/mL组显著（P<0.05）;1 μg/mL Pg-LPS亦可显著上调hPDLF RANKL mRNA和蛋白水平的表达;而10 ng/mL IL-22与1 μg/mL Pg-LPS协同作用下RANKL mRNA和蛋白表达可进一步显著上调（F_mRNA= 36.67,F_蛋白= 41.24,P<0.05）,但是对OPG的表达无明显影响（F_mRNA= 0.652,P= 0.593;F_蛋白= 1.271,P= 0.313）。 结论IL-22可通过影响hPDLF表达RANKL/OPG参与牙周炎骨破坏,并且与Pg-LPS具有协同作用。     

持续静压力作用下牙周膜细胞骨保护素、核因子-κB受体活化因子配体表达的增龄性变化

目的 通过细胞实验观察持续静压力作用下人牙周膜细胞（HPDLCs）表达骨保护素（OPG）、核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）的增龄性变化。 方法 组织块法原代培养HPDLCs,分为A组（13~18岁）、B组（19~29岁）、C组（30~44岁）。CCK-8检测HPDLCs的增殖能力,β-半乳糖苷酶染色检测HPDLCs衰老情况。3组细胞均分别给予0、1.5、3、6、12、24、48、72 h体外持续静压力机械刺激,酶联免疫吸附测定法检测所提上清液中OPG、RANKL的表达。 结果 体外持续静压力刺激后,牙周膜细胞OPG表达水平随加力时间及年龄增长而增加（P<0.01）。RANKL表达水平随加力时间延长而增加,随年龄增长而下降（P<0.01）。OPG/RANKL比值随加力时间呈先下降后增加趋势,且随年龄增长而增加（P<0.01）。 结论 体外持续静压力作用下,增龄因素可上调牙周膜细胞OPG表达及OPG/RANKL比值,下调RANKL表达。     

不同根吸收阶段乳牙牙周膜干细胞生物学特性研究

目的：比较生理性根吸收不同阶段的乳牙牙周膜干细胞（PDLSCs）的生物学特性,检测其对破骨细胞形成和凋亡相关分子的表达情况,为解释生理性根吸收的调控机制提供实验依据。方法：通过分离、培养处于不同生理性根吸收时期的乳牙PDLSCs（未吸收、中度吸收、重度吸收）与恒牙PDLSCs;采用流式细胞术、MTF实验比较各组PDLSCs的免疫表型、细胞增殖能力;采用成骨、成脂诱导与茜素红染色、油红O染色及Real—timePCR检测各期PDLSCs成骨成脂相关基因表达;采用Westernblot检测各组PDLSCs的RANKL、OPG与FasL表达。结果：所分离获得各组乳牙PDLSCs表达间充质干细胞标志分子,与恒牙PDLSCs相比具有较强的增殖能力。其中,重度吸收组乳牙PDLSCs与其它组相比成骨能力最强、成脂能力最差。不同根吸收时期的PDLSCs差异表达RANKL、OPG与FasL蛋白。结论：不同根吸收时期乳牙PDLSCs生物学特性存在差异,RANKL、OPG与FasL的差异表达可能对生理性根吸收过程中破骨细胞的形成与凋亡起到调控作用。     

补肾壮骨中药对成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响

目的观察补肾壮骨中药对成骨细胞OPG和RANKL的影响,探讨中药对牵张成骨作用机制。方法 Beagle犬6只,雄性,体重10kg~15kg。实验分为含药血清组（A组）、无药血清组（B组）和胎牛血清组（C组）。含药血清组的血清来自补肾壮骨中药经煎制后,按体表面积折算等效剂量,2只Beagle犬连续喂服7天后经股动脉采血制备而成。无药血清组的血清采用等剂量生理盐水2只Beagle犬喂服7天后经股动脉采血制备而成。胎牛血清组的血清直接购买。另外2只Beagle犬由胫骨获取骨髓,经F icoll分离液进行梯度离心,MSC经含胎牛血清的DMEM培养,传代后分别将MSC在含药血清（A组）、无药血清（B组）和胎牛血清（C组）的诱导矿化液（β-甘油磷酸钠,维生素C和地塞米松）＋DMEM中培养。采用原位杂交的方法检测成骨细胞OPG和RANKL mRNA的表达情况。结果诱导培养5天、7天时,含药血清组成骨细胞OPG mRNA的表达量均高于无药血清组和胎牛血清组（P〈0.05）。无药血清组和胎牛血清组相比无显著性差异（P〉0.05）。诱导培养5天时,成骨细胞RANKLmRNA的表达量三组间两两比较均无显著性差异（P〉0.05）。诱导培养7天时,含药血清组成骨细胞OPG mRNA的表达量均低于无药血清组和胎牛血清组（P〈0.05）。无药血清组和胎牛血清组相比无显著性差异（P〉0.05）。诱导培养5天时,含药血清组OPG/RANKL比率是无药血清组的1.67倍,是胎牛血清组的2.01倍。诱导培养7天时,含药血清组OPG/RANKL比率是无药血清组的2.18倍,是胎牛血清组的2.62倍。结论补肾壮骨中药可以调节成骨细胞分泌OPG、RANKL的功能,从而降低破骨细胞的活力,促进成骨过程。     

Evaluation of two formulations containing mineral trioxide aggregate on delayed tooth replantation: relevance of RANKL/RANK/OPG system

This study aimed to evaluate the effects of White MTA (WMTA) and MTA Fillapex^® on root resorption, when used for root canal filling, in a rat model of delayed tooth replantation, with special focus on the RANKL/RANK/OPG system. Maxillary right central incisors of male rats were extracted (total N = 48), and exposed to dry environment for 30 min. The animals were allocated into four groups: (1) WMTA; (2) MTA Fillapex; (3) Calcium hydroxide; (4) Negative control. After periodontal ligament removal, root canals were filled with the corresponding material and replanted. After 10 and 60 days, qualitative and semi-quantitative histological and immunohistochemical analyses were carried out. Analysis of variance (ANOVA) with Tukey’s post hoc adjustment was used, at 10 and 60 days, to compare the experimental groups in terms of the inflammatory scores and in terms of the changes in OPG, RANK and RANKL. Both WMTA and MTA Fillapex groups displayed inflammatory and replacement resorption, with the presence of dento-alveolar ankylosis, similarly to that observed for calcium hydroxide, in either 10 or 60 days. Notably, a slight increase of the inflammatory process was observed in both MTA groups. Quantitatively, inflammation score analysis showed a significant difference between the calcium hydroxide and the control group at 10 days. On 60 days, dento-alveolar ankylosis was found significantly increased in the MTA Fillapex, in comparison to the control group (p < 0.05). For immunohistochemical analysis, the expression of both RANK and RANKL was reduced in calcium hydroxide and WMTA groups, from 10 to 60 days of evaluation, an effect that was accompanied by increased OPG immunolabelling. Otherwise, the MTA Fillapex group presented a general increase of RANKL immunopositivity, similarly to that observed in the negative control group. Our data showed that none of tested materials was able to fully prevent the root resorption, although the white MTA cement presented an outcome comparable to that seen for calcium hydroxide. MTA cements might present some advantages when considering no need of frequent changes, although the effects of MTA cements in dental avulsion still require further investigation.     

Inflammatory and bone regulators expression in murine macrophages under exposure of commercial and experimental mineral trioxide aggregate

Background: Mineral trioxide aggregate (MTA) has been used in a variety of surgical and non-surgical endodontic applications. The aim of this study was to evaluate the gene expression and protein production of TNF-α, IL-1β and IL-6, as well as the gene expression of RANKL and OPG using both commercial and experimental MTA in macrophage cell cultures. Methods: Peritoneal macrophage cell culture was performed. Viability, gene expression of cytokines, RANKL and OPG, and protein levels in experimental- and commercial-grey MTA co-cultured with peritoneal macrophages was determined by tryptan blue, real time PCR and ELISA. Results: The expression of TNF-α for both commercial and experimental MTA was higher, while the expression of IL-1β and IL-6 was similar when compared to the negative control. At protein expression level, no differences were observed between the negative control and cements. RANKL did not show a significant improvement in gene expression when compared with the negative control, but OPG expression in cement samples was higher when compared to the negative control. Conclusions: This study suggests that commercial and experimental MTA promotes anti-inflammatory processes, as well as bone healing capacity.     

Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor suppress osteoclastic differentiation by inducing PGE(2) production in chondrocytes

This study examined how interleukin-6 (IL-6) and soluble IL-6 receptor (sIL-6r) influence osteoclastic differentiation through the function of chondrocytes. Chondrocytes were cultured with or without IL-6 and/or sIL-6r in the presence or absence of NS398, a specific inhibitor of cyclooxygenase (COX)-2, for up to 28 days. Chondrocytes were also cultured with or without IL-6 and sIL-6r for 28 days, and the conditioned medium from cells cultured without IL-6 and sIL-6r was used to induce differentiation of RAW264.7 cells into osteoclast precursors. Osteoclastic differentiation was assessed by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining. Expression of osteoprotegerin (OPG), receptor activator of NF-κB ligand (RANKL), COX-2, and prostaglandin E(2) (PGE(2)) increased in cells exposed to IL-6 and sIL-6r, whereas expression of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and bone resorption-related enzymes decreased. NS398 blocked the stimulatory/suppressive effects of IL-6 and sIL-6r on the expression of OPG, RANKL, and M-CSF. Fewer TRAP-positive multinucleated cells were detected after treatment with conditioned medium from IL-6- and sIL-6r-treated chondrocytes than after treatment with conditioned medium from untreated chondrocytes. These results suggest that IL-6 and sIL-6r interfere with osteoclast function through the involvement of chondrocytes. Specifically, they appear to suppress the differentiation of osteoclast precursors into osteoclasts by inducing chondrocytic PGE(2) production, which, in turn, increases OPG secretion and decreases M-CSF secretion by chondrocytes.     

三氧化矿物凝聚体对乳、恒牙牙髓细胞增殖和分化影响的比较

目的 对比三氧化矿物凝聚体（MTA）和氢氧化钙对人乳、恒牙牙髓细胞增殖和分化的影响。方法 采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测牙髓细胞生长增殖变化;实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测碱性磷酸酶（ALP）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨保护因子（OPG）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）基因的表达。结果 氢氧化钙组乳、恒牙牙髓细胞增殖均显著低于对照组（P<0.01）,MTA组乳、恒牙牙髓细胞增殖均高于对照组（P<0.01）。实时荧光定量PCR检测结果显示,乳牙氢氧化钙组ALP、DSPP和OPG的表达显著低于对照组（P<0.01）,MTA组上述因子的表达显著高于对照组（P<0.01）;氢氧化钙组RANKL的表达显著高于对照组（P< 0.01）,MTA组RANKL的表达与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。恒牙牙髓细胞氢氧化钙组ALP和DSPP的表达与对照组相比无显著差异（P>0.05）,MTA组ALP和DSPP的表达显著增加（P<0.01）;氢氧化钙组和MTA组OPG、RANKL的表达与对照组无显著差异（P>0.05）。结论 MTA比氢氧化钙更适合做乳牙和恒牙的盖髓剂,其优势在乳牙可能更为明显。     

富血小板纤维蛋白对根尖牙乳头干细胞生物学性能的作用研究

目的　研究富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）对根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）生物学性能的作用，探讨其应用于牙髓再生治疗（regenerative endodontic treatment，RET）、促进年轻恒牙牙根继续发育的机制。方法　原代分离培养SCAP，抽取静脉血获取PRF。实验按所用PRF的体积不同分为4组：1/8PRF组、1/2PRF组、1PRF组、0PRF组（对照组）。分别收集各组PRF上清液，制备条件培养基。通过MTT法检测PRF对SCAP增殖的影响；对经不同PRF条件培养基预处理的SCAP进行成骨诱导，应用Western Blot检测牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）、骨钙素（osteocalcin，OCN）的表达水平，检测PRF对SCAP成牙本质或成骨分化的影响。结果　在条件培养基培养3 d和5 d时，与对照组相比，实验组PRF均显著促进SCAP的增殖（P < 0.05），3 d和5 d时，1/2PRF组促进SCAP增殖作用最强（P < 0.05）。PRF条件培养基预处理的SCAP经成骨诱导后，高表达DSPP和DMP1（P < 0.05）。结论　PRF可显著促进SCAP增殖和向成牙本质细胞分化，为PRF应用于RET奠定了生物学基础。     

HMGB1对大鼠骨髓基质干细胞增殖和分化的影响

目的：探讨高迁移率族蛋白B1（HMGBl）对于大鼠骨髓基质干细胞BMSCs增殖、成骨／破骨的影响。方法：原代培养的大鼠BMSCs,分别以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,M‘rr法检测细胞数目;以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,7d后行AIJP染色和RT—PCR检测成骨／破骨基因的表达（骨钙素OCN,骨保护素OPG,核因子KB受体活化因子配体RANKL）。结果：HMGBl存100、500ng／mL浓度时,第3d和第5dBMSCs的OD值有明显升高,在第7d对BMSCs的ALP染色没有明显的改变,OCN和OPG基因的表达也没有明显变化,HMGBl明显提高了BMSCs的RANKI．及RANKI．／OPG基因表达。结论：HMGBl对大鼠BMSCs的增殖和破骨基因表达有明显的促进作用,为HMGBl应用于临床提供实验依据。