microRNA-223过表达与抑制表达 慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率。方法 设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应（PCR）调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段。并通过基因重组技术将目的 基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体。利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平。结果 对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功。microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平。结论 成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。     

生长分化因子-15与肿瘤关系的研究进展

生长分化因子-15(GDF-15)是转化生长因子-β(TGF-β)超家族中的一员,参与组织发育、炎症、肿瘤、外伤等生理和病理过程,并参与多种肿瘤的发生和发展.本文就GDF-15的结构、与肿瘤发生发展的关系及其表达调节等方面的研究进展作一综述.     

雌激素受体α高表达慢病毒载体对根尖牙乳头干细胞成牙/成骨分化的影响

目的雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)高表达慢病毒载体感染根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs),探讨其在SCAPs体外成牙/成骨分化中的作用。方法 ERα高表达慢病毒载体感染SCAPs,Western blot检测ERα的表达,茜素红染色和Western blot检测其对SCAPs成牙/成骨分化的影响。结果体外实验表明,实验组(ERα)ERα的蛋白表达水平较对照组(GFP)明显升高,实验组成牙/成骨向分化标志蛋白(碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和骨钙素(osteocalcin,OCN))表达水平在3d或7d的表达均有不同程度上调,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。在成骨诱导条件下,实验组(ERα)的矿化结节形成量较对照组(GFP)多,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的ERα高表达载体成功在体外上调了目的基因的表达,并促进根尖牙乳头干细胞的成牙/成骨分化。     

生长分化因子15对骨髓间充质干细胞增殖及基因表达的影响

目的探讨生长分化因子15(GDF15),对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的调控作用及其机制。方法分离、培养大鼠BMSCs,流式细胞术和免疫荧光染色鉴定BMSCs;CCK8检测不同浓度rh-GDF15对BMSCs增殖的影响,流式细胞周期检测不同浓度rh-GDF15对BMSCs细胞周期的影响;Realtime PCR检测不同浓度rh-GDF15对BMSCs中ALP、RunX2、COL-1、VEGF、b FGF和HIF-1α基因表达的影响。结果常氧条件下,GDF15可以在48 h内促进BMSCs的增殖,并上调VEGF的基因表达,且具有浓度相关性,50μg/L的rh-GDF15可以显著降低BMSCs的G1期,上调S期和G2期细胞比例,促增殖作用最显著。结论 GDF15可以在短时间内促进BMSCs的增殖和VEGF基因表达,其机制还需进一步探索。     

PERK干扰慢病毒载体的构建及其在人牙髓细胞中的表达

目的:构建人PERK基因的shRNA慢病毒载体,检测其对人牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)PERK基因表达的抑制作用.方法:针对人PERK基因的cDNA序列,设计并合成针对人PERK基因的shRNA表达序列,将其连接到载体hU6-MCS-CMV-EGFP中.测序正确后,将构建的目的载体和包装质粒共转染293T细胞,72 h后收获并浓缩得到重组慢病毒颗粒.筛选最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),将病毒感染人牙髓细胞,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测PERK基因mRNA和蛋白的表达水平,验证干扰效果.采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学分析.结果:成功构建LV-PERK-RNAi慢病毒载体,病毒滴度为3×108 TU/mL,最适MOI=30;RT-PCR和Western印迹法检测显示,与空白对照组相比,PERK基因的mRNA和蛋白质表达水平显著下降,在mRNA水平的表达抑制率约为63％.结论:成功构建PERK干扰慢病毒表达载体,为后续的研究创造了条件.     

靶向人CD106基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：：构建人CD106基因RNAi慢病毒载体。方法：设计4条靶向CD106的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4),合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成siRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定验证获得连接正确的克隆。经由293T细胞包装siRNA慢病毒颗粒,随后将其感染人口腔鳞癌HN12细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：构建的慢病毒载体的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度至少达到1×109 TU/ ml。siRNA慢病毒感染人HN12细胞,经Real-time PCR和Western blot检测目的基因CD106的mRNA和蛋白表达较阴性对照载体慢病毒感染组明显下降。结论：成功构建了人靶向CD106RNAi慢病毒载体,并能够在细胞水平上有效沉默靶基因。     

低氧诱导因子-1α慢病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞内表达的检测

目的:构建低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的慢病毒载体(Lenti-HIF-1α),转染骨髓基质干细胞(bone marrowstromal cells,BMSCs)后,检测HIF-1α在BMSCs内的表达,并鉴定其位置。方法:根据人的HIF-1α基因(NM_001530)序列行引物设计及序列片段的PCR扩增,将目的基因PCR产物连接到载体pEGFP-N1上,构建真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α。将目的基因PCR产物和目的载体用NheI和BamHI分别进行酶切,对质粒进行鉴定。采用LR重组系统将目的序列重组到慢病毒载体plenti6.3V5-DEST上,构建慢病毒载体Lenti-HIF-1α(Lenti-LacZ为对照组)。检测慢病毒滴度后,转染BMSCs,检测目的基因的表达。通过细胞免疫组织化学法观察HIF-1α在BMSCs内的位置。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α构建成功。用Lenti-HIF-1α转染BMSCs细胞,0、1、4、7、14和21 d后qPCR检测。结果表明HIF-1α在转染后的第4天开始有明显的过表达,且持续到第21天。细胞免疫组织化学结果显示目的基因位于BMSCs的核内。结论:成功构建了慢病毒载体Lenti-HIF-1α,且转染的目的基因位于BMSCs细胞核内,为HIF-1α介导的BMSCs进行体内实验研究奠定了基础。     

慢病毒表达载体pLentiTrident1-hBMP2-Neo-hNGF的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含有人骨形成蛋白2(hBMP2)及神经生长因子(hNGF)目的基因的慢病毒载体.方法:使用限制性内切酶,将新霉素抗性基因(Neo)从载体pLentiTrident1-EGFP-Neo切下,插入pLentiTrident1空载体的相应多克隆位点上.构建出含新霉素抗性的表达载体.采用PCR扩增得到hBMP2与hNGF的目的片段,通过多克隆位点将2个目的基因插入表达载体.对该重组载体进行酶切鉴定、PCR鉴定以及DNA序列测序分析.结果:通过酶切鉴定及测序分析,慢病毒表达载体(plentiTrident1-hBMP2-Neo-hNGF)构建成功.结论:成功构建了hBMP2与hNGF的共表达慢病毒载体.为研究神经因素在骨组织再生中的作用奠定了基础.     

慢病毒载体的研究进展及应用

慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,能稳定且高效地转染分裂细胞和非分裂细胞,已成功应用于临床,并逐渐应用于其他生物医学领域。本文从慢病毒载体的分子构造、遗传毒性、细胞工程应用及转基因动物模型应用方面就慢病毒载体的研究作一综述。     

人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,寻找最佳RNAi慢病毒载体。方法 针对人Notch-1基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计3段RNAi靶点序列（shRNA1~3）,通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌,筛选阳性克隆,经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度,观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,运用定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1,四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光;浓缩后的病毒滴度为5.8×108 TU·mL-1;以复感染系数为1时感染293T细胞,感染效率在90％以上。QRT-PCR和Western blot检测结果表明,pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度最高。结论 成功构建了人Notch-1 RNAi慢病毒载体。     

E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法：体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6（Age I/EcoR I）质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-Time PCR和Western检测三组E2F-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论：靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。     

慢病毒载体介导Golli-MBP基因过表达的体内实验初探

目的：通过过表达Golli?MBP基因尝试诱导口腔黏膜产生OLP病损,探讨Golli?MBP在OLP发病中的作用。方法：通过动物体内实验利用慢病毒载体系统包装诱导Golli?MBP过表达基因,将其注射于叙利亚金黄地鼠口腔黏膜下,肉眼观察黏膜改变,HE染色观察组织学改变,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测细胞增殖情况。结果：Golli?MBP未能诱导实验动物口腔黏膜产生肉眼可见的OLP病损变化,7天实验组上皮层细胞凋亡率与对照组无明显差异（ P＞0．05）,14天实验组上皮层细胞凋亡率低于对照组（P＜0．05）。7天及14天实验组上皮层细胞增殖率低于对照组（P＜0．05）。结论：Golli?MBP 过表达能够抑制叙利亚金黄地鼠颊囊黏膜上皮细胞增殖和凋亡,但未能成功诱导其黏膜产生OLP病损。     

冻干对BMP-2基因重组慢病毒载体生物学效应的影响

目的:研究冻干对BMP-2重组慢病毒载体(Lenti-BMP-2)生物学效应的影响.方法:利用基因重组技术构建lenti-BMP-2.以感染复数(multiplicity of infection,MOI)10、25、50、100、200转染大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),X-gal染色确定最佳MOI值.在适宜条件下,将lenti-BMP-2与10％海藻糖配比的冻干保护剂混合制成冻干剂型.采用MTS试剂盒观察冻干前、后lenti-BMP-2对BMSCs增殖的影响.应用ELISA法检测冻干lenti-BMP-2转染大鼠BMSCs后细胞中BMP-2蛋白的表达变化,实时定量PCR检测冻干对lenti-BMP-2转染BMSCs后成骨标志物Runx-2 、Coi1、OCN、OPN表达水平的影响.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:X-gal染色显示,MOI为100 pfu/细胞时,转染效率趋于稳定,冻干前、后lenti-BMP-2对BMSCs增殖无显著影响(P＞0.05).ELISA法检测显示,利用冻干后的lenti-BMP-2转染BMSCs,可持续稳定地分泌BMP-2蛋白,冻干不会影响BMP-2蛋白的分泌活性.实时定量PCR检测结果显示,冻干前和冻干后组被转染的BMSCs细胞中,Runx-2、Coi1、OCN、OPN表达水平无显著差异,说明冻干不会影响BMP-2促进成骨标志物的表达(P＞0.05).结论:海藻糖冻干剂型的lenti-BMP-2能够长期保持lenti-BMP-2的高生物活性,是一种有效可靠的储存方法.     

GDF15对成血管和成骨/破骨作用的影响及机制的研究进展

生长分化因子15作为转化生长因子-β超家族中的一员,在人体组织中广泛表达。GDF15可被多种因素(比如缺氧、炎症、射线、急性损伤或癌变)诱导表达,通过SMAD通路和非SMAD通路发挥作用。最新的研究表明,在不同微环境下,GDF15对于血管生成,骨代谢具有不同的调节作用。本文就GDF15在不同生物背景下对成骨/成血管作用的影响及其相关信号通路作一综述。