乙型肝炎患者血清及外泌体内HBV-DNA提取及检测的方法学研究北大核心CSCD

目的:比较煮沸法与苯酚-氯仿法提取血清及外泌体内HBV-DNA,Taqman法与SYBR法qPCR检测HBV-DNA表达的优缺点,并寻找更为准确敏感的诊疗参考指标。方法:收集高病毒载量组与低病毒载量组的血清,提取血清外泌体并鉴定,分别提取血清与外泌体内HBV-DNA,比较分析煮沸法与苯酚-氯仿法提取及qPCR Taqman法与SYBR法检测之间的表达差异。结果:高病毒载量组(HBV-DNA>5E+02 U/ml)中煮沸法提取血清HBV-DNA,Taqman法检测值高于SYBR法(P<0.05);Taqman测定血清HBV-DNA、SYBR测定外泌体HBV-DNA,煮沸法提取效率均高于苯酚-氯仿法(P<0.05);血清HBV-DNA表达高于外泌体(P<0.05)。低病毒载量组(HBV-DNA<5E+02 U/ml)中煮沸法与苯酚-氯仿法提取、Taqman法与SYBR法qPCR检测血清及外泌体HBV-DNA差异均无统计学意义。外泌体HBV-DNA表达高于血清(P<0.05)。结论:两种提取及检测方法均具有一致的灵敏度与特异度。外泌体包裹的HBV-DNA水平可能是临床诊断和治疗慢性乙肝中不可或缺的关键因素。     

唾液SIgA、溶菌酶含量与牙周病关系的探讨

目的：探讨了牙周病患者唾液SIgA和溶菌酶含量的变化及临床意义。方法：应用放射免疫分析检测32例牙周病患者唾液SIgA含量、免疫扩散法检测溶菌酶含量,并与35名正常健康人作比较。结果：牙周病患者唾液SIgA和溶菌酶含量均非常显著地高于正常人组（P〈0.01）,经治疗1个月后与正常人组比较仍有显著性差异（P〈0.05）。结论：检测牙周病患者唾液SIgA和溶菌酶含量的变化对临床观察预后有重要的临床价值。     

一种鉴定重组子的快速简便方法

外源ＤＮＡ与质粒ＤＮＡ连接产生大量待鉴定的重组子。目前一般采用常规碱裂解法或煮沸法小量提取质粒ＤＮＡ后 ,酶切鉴定〔1,2〕。或者用菌落ＰＣＲ法鉴定重组子〔3〕。酶切鉴定要求质粒ＤＮＡ质量较高 ,且要求量较大 ,菌落ＰＣＲ由于菌量较少 ,常会出现丢失菌落情况。对于质粒ＤＮＡ小量制备 ,目前常采用常规的碱裂解法和煮沸法 ,前者操作步骤多 ,较繁锁 ,后者在加热裂解时可释放相对大量的糖类 ,很难避免质粒ＤＮＡ内污染有糖类 ,而糖类可抑制多种限制酶的活性。另外煮沸不能完全灭活内切核酸酶Ａ ,在Ｍｇ2 + 存在下温育时质粒ＤＮＡ会被…     

不同方法提取基因组DNA的比较

目的通过对不同方法的比较建立一种遗传工程鼠基因组DNA鉴定提取最简单快速的方法。方法以大鼠和小鼠的鼠尾及脚趾为实验材料,采用酚氯仿、煮沸法、涡旋离心法提取基因组DNA;通过琼脂糖凝胶的方法检验DNA质量,通过对时间的统计分析比较3种方法提取DNA的速率。利用PCR技术检测DNA的扩增效果。结果煮沸法、涡旋离心法和酚氯仿提取的DNA比较,电泳条带均较弱。涡旋离心法所耗费的时间最短,煮沸法次之,酚氯仿法耗时最长。除了煮沸法外,涡旋离心法和酚氯仿方法提取的DNA在用于PCR检测时都能得到清晰的目的条带。结论在使用PCR进行基因型初步鉴定时,涡旋离心法是三种方法中最简单快速的首选方法。     

浓缩一步法新型肺炎支原体核酸检测试剂盒的临床应用初步评价

目的 通过对比实验,对新型肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae,MP）核酸检测试剂（采用浓缩一步法处理样本,以下简称“浓缩一步法”）的临床使用进行评价.方法 用浓缩一步法试剂与煮沸法试剂对临床收集的样本进行MP DNA检测并对比其结果,同时,将两种试剂的检测结果分别与金标准培养法检测结果进行对比.结果 新型肺炎支原体核酸检测试剂与煮沸法试剂的阳性一致性百分比为98.36％,阴性一致性百分比为96.80％,总一致性百分比为97.68％;对5例不符样本进行测序复核,并对复核后的结果进行Kappa检验一致性分析,结果Kappa值=1.000,表明新型试剂的检测结果与煮沸法试剂及复核检测的结果具有很好的一致性.在与金标准培养法检测结果的对比中,两种试剂均表现出较好的准确性.结论 新型肺炎支原体核酸检测试剂与已上市的煮沸法试剂检测结果具有很好的一致性,操作简单快速,减少污染环节,并具有内标控制假阴性,结果准确,符合临床检测要求,具有较高的临床应用价值.     

唾液SIgA、溶菌酶含量与慢性支气管炎关系的探讨

目的：探讨了慢性支气管炎患者唾液SIgA和溶菌酶含量的变化及临床意义。方法：应用放射免疫分析检测38例慢性支气管炎患者唾液SIgA含量,免疫扩散法测定溶菌酶含量,并与35名正常人作比较。结果：慢性支气管炎患者唾液SIgA和溶菌酶含量非常显著地高于正常人组（P〈0．01）,经2周治疗后仍有显著性差异（P〈0．05）。结论：检测慢性支气管炎患者唾液SIgA和溶菌酶含量的变化对临床观察预后有重要的临床价值。     

一种新型沙眼衣原体核酸检测试剂的临床应用探讨

目的通过对比实验,对新型沙眼衣原体(CT)核酸检测试剂(以下简称"一步法试剂")的临床使用进行评估。方法用1例CT强阳性样本进行梯度稀释,用新型沙眼衣原体免核酸提取的荧光定量PCR检测试剂和市场上最为稳定的煮沸法试剂分别进行检测,考评其精确度与灵敏度。用一步法试剂与煮沸法试剂对345例临床收集的样本进行CT DNA定性检测并对比其结果。结果强阳性样本梯度稀释实验显示,一步法试剂的检测结果重复性好,灵敏度高;一步法试剂与煮沸法试剂的阳性一致性百分比为98.78%,阴性一致性百分比为99.24%,总一致性百分比为99.13%。对此结果进行Kappa检验一致性分析,结果 Kappa值=0.976,表明一步法试剂与煮沸法试剂检测的结果具有很好的一致性。结论一步法试剂与已上市的煮沸法试剂检测结果具有很好的一致性,并且操作简单、结果准确,符合临床检测要求,具有较高的临床应用价值。     

一种新的质粒小量快提方法

一种新的质粒小量快提方法肖新华，庞希宁，方福德，王　，孙琦（中国医学科学院北京协和医院，北京１００７３０）质粒提取与分离是分子生物学研究中的最基本技术之一。目前广泛应用的小量质粒提取方法是碱裂解法或煮沸法，这些方法虽然可行，但在某些方面存在不足，如需...     

用ELISA检测溶菌酶

溶菌酶测定过去常规采用溶菌试验法(比浊法).其原理主要是利用溶菌酶溶解溶壁微球菌的活性,观察其溶菌后混悬液的清浊度来间接表示溶菌的多少.由于溶菌试验缺乏一定的敏感性,加之受样本采集处理及保存时间的限制,因而,准确性不高.首次采用ELISA法检测溶菌酶.本法主要是测定溶菌酶特异性蛋白,而不是测定其溶     

溶菌酶抗体的制备及免疫学测定法的实验研究

用纯化溶菌酶为抗原，免疫家兔制备其抗体，以及抗体的提取、纯化和鉴定，建立了一种新溶菌酶免疫测定法，并对重复性、相关性和回收试验等最佳条件进行了探讨。回收率为９７％，批内ＣＶ１．９８％，批间ＣＶ４．５％，与黄色微球菌琼脂平板法比较，两法呈正相关，ｒ＝０．９８７。溶菌酶浓度０～３００μｇ／ｍｌ呈良好线性，正常参考值范围为９．８～４０μｇ／ｍｌ（２ｓ）。     

溶菌酶肠溶片治疗过敏性紫癜的临床疗效

目的 探讨溶菌酶肠溶片治疗过敏性紫癜的临床疗效。方法 选择2017年1月~2018年6月我院收治的过敏性紫癜患者108例,采用随机数字表法分为实验组和对照组,每组54例。对照组给予常规治疗,包括口服维生素C片和芦丁片,实验组在对照组基础上给予溶菌酶肠溶片口服治疗,比较两组临床疗效、症状缓解时间及复发情况。结果 实验组总有效率为83.33%,高于对照组的66.67%,差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组皮肤紫癜消退时间及尿常规恢复正常时间短于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组复发率为29.63%,低于对照组的50.00%,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 溶菌酶肠溶片治疗过敏性紫癜疗效显著,可有效缓解临床症状,且复发率小。     

DNA标记杂交技术筛选抗HBs-IFN-α融合蛋白表达载体

为在无抗药性改变 ,转化细胞无生物指示系统改变的克隆载体中扩大筛选范围 ,提高筛选阳性率 ,本文应用地高辛标记DNA检测系统筛选人源单抗片段与干扰素融合蛋白表达质粒 (Anti HBs IFN α ) ,取得了理想的效果。纯化制备载体的插入段DNA ,用地高辛标记系统进行化学标记 ,制成标记探针。挑取单克隆菌扩增 ,以溶菌酶加煮沸法批量制备载体DNA ,点样于硝酸纤维膜上并经 80℃烤 2h ,分别用预杂交液和标记探针进行 42℃ 2h、 42℃ 6h的膜预杂交和杂交反应 ,洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色。未带插入片段的抗体表达载体为阴性对照 ,IFN α质粒DNA作阳性对照 ,在 40株转化细胞中筛选出 7个目的克隆。为进一步核实该法的筛选效率和可靠性 ,分别用单酶切和双酶切法对筛选出的阳性载体进行鉴定 ,琼脂糖电泳结果显示 ,两者的符合率为 10 0 %。该系统筛选结果可靠 ,尤其在克隆载体转化细胞后无抗药改变 ,无其他筛选特征的载体构建中有一定的优势     

溶菌酶的免疫调节作用的实验和临床研究

有关溶菌酶的抗原决定族及其与免疫活性细胞相互作用的分子机制研究工作最近才开始。溶菌酶对花环形成过程的影响及其与某些特定的T、B细胞群相互作用尚未研究。本文报导溶菌酶对淋巴细胞在体外形成花环和转化为母细胞的影响,以及在肺部炎症疾病时(雾化)吸入溶菌酶对免疫系统的作用     

短小棒状杆菌菌苗(CPV)对小鼠腹腔巨噬细胞和血清中溶菌酶的影响

本文观察了不同品系及相同品系不同鼠龄的小鼠腹腔Mφ和血清溶菌酶含量,发现年幼鼠和年老鼠的腹腔Mφ和血清溶菌酶量较年青鼠低,经注射CPV后,白色非近交系和C57BL/6近交系鼠的PEC数量增多,主要是Mφ增加,Mφ体积明显增大,PEC溶菌酶量和血清溶菌酶量均增加,它们呈现平行关系。因而认为测定血清溶菌酶量的变化可以作为CPV激活Mφ的一种指标。     

肺炎链球菌假想的溶菌酶样蛋白的活性分析和鉴定

目的 探索肺炎链球菌中一种假想的溶菌酶样蛋白的活性.方法 生物信息学分析该基因的功能结构域;利用长臂同源PCR对该基因进行敲除,观察D39野生菌和缺陷菌在生物学性状的改变;利用底物PNP-(GIcNAc)和溶壁微球菌,构建过表达载体,绘制生长曲线,对截断和全长蛋白的溶菌酶活性进行鉴定.结果 生物信息学分析结果显示该基因的编码产物为β-1,4-N-乙酰胞壁酸糖苷酶,属于糖基水解酶25家族;野生菌为长链生长,缺陷菌呈短链状;溶菌酶和假想的溶菌酶样蛋白均可使底物释放出游离的对硝基苯酚,A405nm吸光度值分别为1.166和0.792;同时也可使得溶壁微球菌发生溶解;含过表达质粒的肺炎链球菌较之野生菌,溶解较快.结论 假想的溶菌酶样蛋白具有溶菌酶活性,是一种新的溶菌酶.     

硬性透气性角膜接触镜材料体外溶菌酶的短期吸附动力学

背景:镜片沉淀物的形成是角膜接触镜配戴的常见问题之一,其中蛋白沉淀最易形成。研究氟硅丙烯酸酯硬镜溶菌酶吸附动力学可进一步完善硬镜蛋白吸附数据,为降低其表面蛋白吸附量和预防硬镜表面污染提供有意义的指导。目的:考察氟硅丙烯酸酯硬镜在体外对溶菌酶的吸附情况。方法:配制质量浓度为2.0g/L溶菌酶溶液(溶液Ⅰ)及不同浓度三氟乙酸溶液;解析率实验,将对照组与实验组镜片浸入溶液Ⅰ37℃振荡孵育,Hank’s平衡盐溶液清洗氟硅丙烯酸酯硬镜,然后将对照组镜片浸入去离子水中,实验组镜片浸入不同浓度三氟乙酸,于不同时间点取出;溶菌酶短期吸附动力学实验,对照组镜片浸入去离子水中,实验组镜片浸入溶液Ⅰ37℃振荡孵育不同时间点,Hank’s平衡盐溶液清洗氟硅丙烯酸酯硬镜,后用0.2%三氟乙酸解析吸附溶菌酶;BCA法测定各溶液中溶菌酶的量。结果与结论:氟硅丙烯酸酯硬镜吸附溶菌酶可用三氟乙酸解析,三氟乙酸解析溶菌酶受解析时间和解析浓度的影响。三氟乙酸解析溶菌酶最佳时间1h,最适浓度0.2%。氟硅丙烯酸酯硬镜吸附溶菌酶(体外模拟24h),10min～1h溶菌酶吸附量递增,1h达吸附饱和,1～24h吸附量稳定,饱和吸附量为0.349mg/cm2。解析时间为10,30min时,溶菌酶解析率较低,40min～24h解析率较好(90%～100%)。     

肺心病患者唾液SIgA,溶菌酶含量测定的临床意义

为了探讨肺心病患者唾液SIgA、溶菌酶含量的关系,我们进行了唾液SIgA、溶菌酶含量的测定,现将结果报告如下。 对象和方法 一、对象: (一)正常人:35人。均为本院健康体检合格者,     

鼻分泌物中溶菌酶含量的测定

<正> 溶菌酶存在于人体的分泌液和组织液中,具有抑制和溶解细菌的作用,是机体非特异性免疫的一个环节。鼻分泌物中溶菌酶的含量,国内未见文献报告。为了研究鼻腔局部的免疫功能,我们进行了含量测定,并观察其与pH值的关系。 一、实验方法: (一)鼻分泌物的收集:取4×1.5cm~2滤纸,浸     

一种从链霉菌和大肠杆菌提取大分子量总DNA的新方法

近年来,我们在进行基因工程试验中,探索建立了一种避免使用苯酚、简化操作程序的DNA提取方法。利用该法所得DNA不仅分子量大(约300kb),且纯度完全能满足内切酶消化,接连和转化。在提取链霉菌和大肠杆菌染色体DNA时,称1g湿菌体,加9ml溶菌缓冲液(50mMol/L Tris.Hcl PH8.0;25mmolL EDTA;0.3mol/l sucrose)。混匀菌体后加入1ml溶菌酶溶液(20mg/ml和200ul RNase     

甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白的分离、纯化和鉴定

目的提纯甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白并鉴定。方法选用甲型副伤寒沙门菌,经自制的液体培养基扩大培养后,酸裂解法初步分离出鞭毛蛋白,用AKTAExplorer蛋白纯化系统除盐,弱阴离子交换层析纯化。纯化的蛋白用SDS-PAGE、Westernblot和磷钨酸负染扫描电子显微镜(scanningelectronmicrocopy,SEM)观察并摄片鉴定。考马斯亮蓝法测定所获得鞭毛蛋白的产量。结果SDS-PAGE提示纯化的鞭毛蛋白为一条相对分子质量(Mr)为52×103蛋白带;免疫印迹试验亦提示条带在Mr52×103处;SEM观察发现该鞭毛蛋白呈丝状;三者均证实该蛋白为同一均质蛋白。蛋白定量测得每克湿重的细菌可提取(4.8±0.5)mg鞭毛蛋白。结论经酸裂解法可获得高产量的鞭毛蛋白,且易于纯化和鉴定。