热诱导调控序列的合成及其热诱导特性的研究

目的 探讨合成热诱导性的HSP70启动子调控序列,并鉴定加热条件下诱导其下游报告基因表达的特性。方法 利用PCR方法,以肝癌细胞株HepG2基因组为模板,体外合成热休克蛋白70（HSP70）启动子序列。利用双酶切法构建HSP70启动子调控的含EGFP报告基因的真核表达载体pcDNA-HSP70-EGFP。以脂质体为载体,体外转染肝癌细胞株HepG2,在不同的温度下（37℃、39℃、41℃、43℃、45℃）加热不同时间（0、15、30、45、60min）后,利用流式细胞术检测报告基因EGFP表达强度,从而判定温度及时间对HSP70启动子热诱导活性的影响。结果 合成的HSP70启动子序列测序结果与GeneBank 中AL671762所提供序列完全一致。低温加热后EGFP在HepG2细胞中的表达强度不同程度增强,在43℃/30 min 时最为明显,为未加热组的3.3倍。结论 成功合成可热诱导的HSP70启动子序列;HSP70启动子在低温加热下能明显增强其下游外源基因的表达,为进一步研究肿瘤热疗-基因治疗提供了实验基础。     

pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 构建标记有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(hTIMP-1)真核表达质粒pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP,并通过转染大鼠血管平滑肌细胞(SMCs)验证hTIMP-1的表达.方法 将hTIMP-1及编码EGFP的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列通过扩增、酶切、插入pcDNA3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达质粒;应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入SMCs(pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组).应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测hTIMP-1的表达情况;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性.用空质粒pcDNA3.1转染SMCs(空质粒pcDNA3.1转染组)和未转染质粒的SMCs(未转染组)作为对照.结果 pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组重组质粒转染SMCs后,SMCs生长受到抑制;转染24 h后在荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,SMCs出现646 bp目的基因;Western blotting检测显示,在转染后的血管SMCs中有hTIMP-1表达;明胶酶谱法检测结果显示,MMP-2、MMP-9活性降低;与空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 TIMP-1真核表达质粒的构建和在血管SMCs中的表达,为TIMP-1基因治疗的研究奠定了基础.     

人凝血酶调节蛋白基因对兔动脉壁的转染

目的 探讨注射加压转染的方法对兔动脉壁进行人凝血酶调节蛋白(human thrombomodulin, hTM)基因转染的可行性.方法 健康新西兰大白兔84只,应用抽签法随机分为3组: pcDNA3.1/hTM质粒组(n=28),pcDNA3.1(+)/neo质粒组(n=28)和未转染组(n=28),通过基因转染并建立动脉损伤-阻滞模型,于术后3、7、14和28 d分别检测hTM mRNA和蛋白在动脉壁的表达.结果 17只实验动物在手术当天至术后3 d内意外死亡.pcDNA3.1/hTM质粒组各时间点的hTM mRNA表达都明显高于pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组(P＜0.01);pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组组内和组间每个时间点的hTM mRNA表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05).hTM蛋白在各组中均有表达,主要位于动脉内腔面;pcDNA3.1/hTM质粒组各时间点的hTM蛋白表达明显高于pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组(P＜0.05);pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组的hTM蛋白表达在各个时间点都相对恒定,组内和组间比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 用动脉腔内加压法可以有效地对活体动物的动脉壁进行基因转染.     

RhoC基因对肝癌细胞促血管生长因子表达的影响

目的:观察RhoC基因对肝癌HepG2细胞表达促血管生长因子（VEGF，bFGF）的影响。 方法:将pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1转染HepG2细胞，用RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞的RhoC mRNA及RhoC蛋白表达情况;RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞VEGF和bFGFmRNA及蛋白的表达。将转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1的HepG2细胞接种裸鼠，观察肿瘤的成瘤率。结果:与转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞相比，转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒的细胞表达RhoC mRNA及RhoC 蛋白增强，其表达VEGF和bFGFmRNA及蛋白明显增强（P＜0.01）;重组质粒转染组成瘤率高于空载体组。结论:RhoC表达可促进HepG2细胞表达血管内皮生成因子。RhoC可促进肝癌细胞分泌促血管生长因子，可能是促进肝癌侵袭、转移的机制之一。     

睾丸特异性新基因T490真核荧光表达载体的构建及其表达

目的 构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的睾丸特异性新基因T490超表达质粒pDT490-EGFP,检测其在Hela细胞中的表达情况.方法 采用RT-PCR的方法从成年Balb/c小鼠睾丸组织中扩增T490基冈,将该基凶连接克降到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,再将T490和EGFP融合基因酶切下来,克隆到pcDNA3.1(-)真核超表达载体上,以构建重组质粒pDT490EGFP.将该重组质粒通过阳性脂质体Lipofectamine 2000导入Hela细胞系中,在荧光显微镜F观察转染24h后融合基因的超表达情况,并用RT-PCR的方法进一步证实目的 基因mRNA的表达水平.结果 RT-PCR获取编码T490基因的全序列cDNA,大小为508bp;DNA测序和PCR方法证实T490和EGFP融合基因成功克隆到真核超表达载体L;在荧光显微镜下,转染24h后的Hela细胞具有很强的绿色荧光;RT.PCR显示转染后的Hela细胞T490基因mRNA的表达明显.结论 重组质粒pDT490-EGFP构建成功,并在细胞内明显表达,此质粒可应用于研究睾丸特异性新基因T490的功能,为T490的生物学研究奠定基础.     

含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽的白细胞介素-24突变体真核表达载体的构建及其体外抗肝癌作用

目的 构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的白细胞介素(IL)-24突变体(RGD-IL-24)真核表达质粒,观察其对肝癌细胞的抑制作用.方法 利用重叠PCR技术在IL-24cDNA中插入GGT三个碱基,获得RGD-IL-24 cDNA.将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1/RGD-IL-24.将pcDNA3-1/RGD-IL-24及作为对照的pcDNA3.1/IL-24转染肝癌细胞HepG2,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-24 mRNA表达;Western blot检测IL-24蛋白表达;噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖;FITC-Annexin V染色检测细胞凋亡;Western blot检测bax、bcl-2表达.结果 测序证明pcDNA3.1/RGD-IL-24构建成功.RT-PCR、Western blot证实转染pcDNA3.1/RGD-IL-24的肝癌HepG2细胞表达IL-24.pcDNA3.1/RGD-IL-24、pcDNA3.1/IL-24处理组HepG2细胞存活率分别为(0.382±0.064、0.563±0.038),凋亡细胞阳性率分别为(0.346±0.049、0.163±0.087),两组差异均有统计学意义.Western blot证实pcDNA3.1/RGD-IL-24促进bax表达、抑制bcl-2表达作用强于pcDNA3.1/IL-24.结论 RGD-IL-24真核表达质粒不仅不影响IL-24表达,且能显著增强IL-24诱导肝癌细胞凋亡及抑制肿瘤生长作用.     

脆性组氨酸三联体基因FHIT对乳腺癌细胞株MCF-7的作用

目的 克隆人类脆性组氨酸三联体基因(FHIT)并构建其真核表达载体pcDNA3.1(+)/FHIT,将人FHIT基因转染人乳腺细胞MCF-7中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 构建FHIT基因表达载体pcDNA3.1(+)/FHIT,用脂质体法将FHIT基因的真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)/FHIT导入人乳腺癌细胞MCF-7中,细胞计数、流式细胞术分析转染后细胞的生物学特性变化.结果 将逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增后的产物克隆到表达载体peDNA 3.1(+)上,经PCR扩增筛选鉴定和测序鉴定证实为所需序列,转染乳腺癌MCF-7细胞后,FHIT基因的表达明显增强,细胞周期分析发现MCF-7/FHIT与MCF-7比较S期及G2/M期的细胞减少,G0/G1期的细胞增加,MCF-7/FHIT细胞的凋亡率为(29.75±5.90)%,MCF-7细胞的凋亡率为(11.21±6.10)%,和MCF-7比较,转染后的MCF-7/FHIT细胞的凋亡明显增加,MCF-7细胞的增殖明显抑制.结论 FHIT基因表达载体可有效抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖.     

PcDNA3.1/hTM质粒对真核细胞转染表达的实验研究

目的： 探讨含有人血栓调节蛋白（hTM）基因的真核表达质粒pcDNA3.1/hTM转染脐静脉内皮细胞（HUVECs）的抗凝效应。方法：由阳离子脂质体介导将pcDNA3.1/hTM质粒转入内皮细胞中，以RT-PCR法检测hTMmRNA的表达;免疫组化法检测hTM分子的表达。结果：转染重组质粒的HUVECs表达的hTMmRNA约为载体质粒组及未转染组的1.7倍。免疫组化显示有平均10%的HUVECs获得转染，阳性细胞较阴性细胞hTM的表达强度有明显提高。结论：pcDNA3.1/hTM质粒能被导入 HUVECs中表达，而且外源性hTM分子具有完全的抗凝生物学活性。     

RECK基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建RECK(reversion-induc ing-cyste ine-rich prote in w ith Kazal motifs)基因的真核表达载体,通过脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2并获得高表达RECK蛋白的细胞克隆。方法用RT-PCR方法扩增出人RECK基因,构建真核表达载体pcDNA3-RECK,采用脂质体介导法将重组质粒导入体外培养的HepG2细胞,RT-PCR和W estern b lot检测转染细胞和未转染细胞中RECK基因mRNA及蛋白质的表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-RECK,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达RECK的细胞克隆;W estern b lot显示转染前的细胞未检测到RECK基因mRNA及蛋白质表达,但转染后表达量明显增高。结论重组质粒pcDNA3-RECK经转染能在HepG2细胞中高效表达,为进一步研究RECK对肝癌细胞的生物学影响奠定了基础。     

乙肝病毒X蛋白对E—cadherin和T—cadherin表达的调节作用

目的 体外研究乙肝病毒X蛋白(HBx)对E-钙黏蛋白(E-cadherin)和T-钙黏蛋白(T-cadherin)表达的调节作用.方法 建立稳定表达HBx基因的HepG2细胞系(HepG2-HBx),稳定转染空质粒pcDNA3.1的HepG2细胞系作为对照(HepG2-pcDNA3.1),分别用荧光实时定量(Real-time)PCR和Western-blot技术检测转染前后E-cadherin和T-cadherin在mRNA及蛋白水平表达变化.结果 以HepG2-pcDNA3.1细胞为参照,转染HBx基因后的HepG2-HBx细胞E-cadherin mRNA和蛋白水平分别为其(42.28±8.73)%和(35.28±4.33)%,而T-cadherin则分别为其(4.47±0.78)和(5.11±0.83)倍,差异有统计学意义(P<0.05).结论 HBx下调E-cadherin的表达,上调T-cadherin的表达,其机制可能为HBx促进E-cadherin向T-cadherin转换.     

C型利钠肽对血管内皮细胞株增能力的影响

目的 了解C型利钠肽（CNP）对血管内皮细胞增殖能力的影响。方法 将所构建的含人CNP（hCNP）的重组质粒pcDNA3．1（＋）在聚乙烯亚胺介导下转染人脐静脉血管内皮细胞株。通过反转录-聚合酶链反应、免疫组织化学和蛋白质印迹法检测该质粒的表达，用噻唑蓝法检测该质粒的表达产物对人脐静脉血管内皮细胞株增殖能力的影响。同法转染下列物质作对照：pcDNA3．1（＋）（阴性对照）、增强型绿色荧光蛋白质粒（阳性对照，只用于检测转染率）、磷酸盐缓冲液（空白对照）。结果pcDNA3，1（＋）转染48h后人脐静脉血管内皮细胞株的增殖能力为0．164±0．012；与其比较，含hCNP的pcDNA3．1（＋）在血管内皮细胞中能高效表达，可使细胞增殖能力达0．3014±0．096（P〈0．05）。结论 CNP具有促进血管内皮细胞增殖的生物学活性。以聚乙烯亚胺介导转染质粒、检测CNP在血管内皮细胞中的表达及测定被转染细胞增殖活性等方法的建立，为开展CNP基因治疗提供了物质基础和实验依据。     

AIBP在肝癌细胞中的表达及意义与含AIBP基因及AFP启动子驱动的双自杀基因表达载体构建

目的：探讨载脂蛋白A-I结合蛋白（AIBP）在肝癌细胞中的表达及意义。方法：用RT-PCR与Western blot法分别检测正常肝细胞株L02,AFP阳性人肝癌细胞株HepG2和Hep3B,及AFP阴性人肝癌细胞株SMMC7721中AIBP基因与蛋白的表达;构建AFP启动子驱动的双自杀基因（CD,TK）+AIBP基因过表达载体pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK,并转染Hep3B和SMMC7721细胞,用MTT法检测转染后细胞的增殖能力,用RT-PCR和Western blot法检测细胞AIBP,血管内皮生长因子（VEGF）,VEGF受体2（VEGFR-2）,基质金属蛋白酶9（MMP-9）基因和蛋白的表达。结果：AIBP mRNA和蛋白在正常肝细胞中高表达,而在各肝癌细胞系中均表达下调,且Hep3B和SMMC7721细胞中下调明显。成功构建pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK真核表达质粒并转染入Hep3B和SMMC7721细胞。转染后AFP阳性Hep3B细胞生长到明显抑制,但AFP阴性SMMC7721细胞增殖不受影响;两种细胞的AIBP基因与蛋白表达均明显上调,而VEGFR-2,VEGF和MMP-9基因与蛋白表达明显表达下调。定量指标间的差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：AIBP在肝癌细胞中表达下调,AIBP与肝癌细胞的侵袭转移能力有关,而与细胞增殖能力无关;成功构建了联合基因载体pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK。

     

人VEGF-C基因荧光真核表达载体的构建和表达

目的:构建含有绿色荧光蛋白基因的人血管内皮生长因子C基因的真核表达载体,检测该基因在真核细胞中的表达,研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用.方法:含有绿色荧光蛋白基因的质粒pEGFP-1通过末端平滑化,酶切获得5'(粘端)BamHI-EGFP-XbaI(平端)3'片断,已经构建的VEGF-C表达载体pcDNA3.1/VEGF-C通过末端平滑化,酶切获得5'-(粘端)BamHI-pcDNA3.1-目的基因-KpnI(平端)3',两片段连接构建含有绿色荧光蛋白的真核表达载体,琼脂糖凝胶电泳并测序检测插入片段的正确性.将该载体通过脂质体转染到真核细胞CHO中,观察绿色荧光蛋白在CHO细胞中的表达情况.通过G418筛选阳性转染细胞,提取总RNA,行RT-PCR,PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察VEGF-C基因在CHO细胞中的表达情况.结果:琼脂糖凝胶电泳证实了插入EGFP片段的大小,测序结果证实了插入片段的正确性,CHO细胞中看到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR产物中含有VEGF-C cDNA.结论:成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的VEGF-C真核表达载体并检测到在真核细胞CHO中的表达.     

胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗的构建和体外转染

目的 探索胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗的构建，以进一步研究对胰腺癌的治疗作用。方法 首先对VNTR编码基因进行了重组设计，氨基端插入人单核细胞趋化蛋白Ⅰ信号肽基因序列，起始码前插入KOZAK促真核翻译序列。将人工合成的重组人VNTR基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3，1／Myc-his（＋）A质粒的MCS中。将通过测序鉴定的含有准确插入序列的pcDNA3．1-VNTR／Myc-his（十）A重组质粒转染C087细胞，进行体外转染实验和Westernblot检测VNTR在细胞内外的表达。结果自转化平板筛选的阳性克隆通过测序鉴定，pcDNA3．1-VNTR／Myc-his（＋）A重组质粒含有完整的阅读框架和目的基因。重组质粒可在C087细胞内外表达VNTR，以胞内为主。所表达的VNTR分子量比人工合成的VNTR多肽大。结论 自行构建的胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗序列准确，可在哺乳动物细胞中表达VNTR。     

linamarase稳定转染肝癌细胞系的建立及研究

目的构建含木薯linamarase(lis)基因的稳定转染肝癌细胞系,并对其生物学特性进行研究。方法应用PCR法从木薯的DNA中扩增出lis基因,将其克隆至pcDNA3.1(+)质粒中,构建重组质粒pcDNA3.1/lis。通过脂质体法将其转染人肝癌细胞系HepG2,进行G418筛选,获得稳定转染的肝癌细胞系HepG2/lis,通过免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot法鉴定lis在细胞中的表达;采用Lambert法对细胞内lis酶的活性进行分析;采用MTT法观察稳定转染细胞系生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠成瘤实验分析其体内成瘤特性。结果 lis基因能稳定整合于真核细胞中,并包装出具备β-葡萄糖苷酶活性的蛋白。lis在细胞中的稳定表达对细胞形态、生长特性、细胞周期、体内成瘤性等生物学特征并无明显影响。结论成功构建含lis基因的稳定转染肝癌细胞系,为将lis自杀基因系统应用于肝癌的治疗提供了实验基础。