经周围静脉途径转移的外源基因在大鼠体内的表达

目的 :探讨经周围静脉注射的外源基因在大鼠体内不同组织的表达。方法 :将重组LacZ腺病毒经尾静脉注射导入Wistar大鼠体内 ,以X gal染色法明确腺病毒载体介导的标识基因 (LacZ)在大鼠体内的表达部位和时间。结果 :β gal表达具有剂量依赖性 ,而且存在器官、组织和细胞 3种水平的表达差异。剂量较小时 ,肺、肾、肝、脾优先表达 ,而心肌在 1× 10 1 1 pfu·kg- 1 剂量组才有少量表达 ,大血管和脑组织始终未见表达。注射后 1～ 2周 ,大鼠的肾、肺、肝、脾、肾上腺高表达 β 半乳糖苷酶 ,3～ 4周表达量减少 ,5周基本消失。结论 :腺病毒介导的外源基因经静脉途径转移 ,可能是肾、肺、肝的部分疾病基因治疗的有效基因转移途径     

腺病毒介导的LacZ基因在乳腺癌细胞中的表达

观察腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞的转导效率及腺病毒转导对细胞生长的影响。方法：腺病毒介导的基因转导。结果：在病毒的重复感染率为５００时细胞的转导效率达到１００％；不同数量的病毒转导乳腺癌细胞对癌细胞的生长没有明显影响。低温冻存可使病毒的感染性明显下降。结论：腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞中有高的转导效率，而病毒载体本身对细胞的生长没有影响，可用作乳癌特异物前体酶激活基因治疗的基因转移方法。     

3腺病毒介导的LacZ基因在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　观察腺病毒介导的LacZ基因转移在B1 6细胞的转导效率。方法　腺病毒介导的LacZ基因转导B1 6细胞。结果　当MOI为 50～ 1 0 0 ,即可获得较高的转导效率 ,达 90 %± 1 %。结论　腺病毒介导的基因转移在B1 6细胞能获得较高的转导效率和目的基因的有效表达。提示腺病毒载体作为一种高效的基因转移载体 ,在肿瘤的基因治疗中有着良好的应用前景     

LacZ基因在体内外骨骼肌中的表达

采用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导基因转移技术，将含有大肠杆菌β－半乳糖苷酶的结构基因（ＬａｃＺ基因）及Ｒｏｕｓ肉瘤病毒启动子的质粒（ｐＲＳＶ－ＬａｃＺ）导入体外培养的大鼠原代骨骼肌内；另外，分别将具有ＲＳＶ启动子和巨细胞病毒ＣＭＶ启动子的ＬａｃＺ基因直接注射到活体小鼠肌肉组织内。经转染的体外培养骨胳肌细胞和取自活体的肌肉组织切片行Ｘ－ｇａｌ组织化学检测以判断ＬａｃＺ基因的表达情况。实验结果证明，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的骨胳肌基因转染率约为１０％～２０％。直接肌肉注射含有不同启动子的ＬａｃＺ基因后，肌细胞内均有该基因表达。结果表明，无论在体内或体外，骨骼肌细胞均能被外源性基因所转染并能表达该报告基因。因此，有望使用经遗传工程改造的骨胳肌细胞作为体细胞基因治疗的有效运载细胞。     

腺病毒介导的LacZ基因在乳腺癌细胞中的表达

目的：观察腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞的转导效率及腺病毒转导对细胞生长的影响。方法：腺病毒介导的基因转导。结果：在病毒的重复感染率（MOI）为500时细胞的转导效率达到100％；不同数量的病毒转导乳腺癌细胞对癌细胞的生长没有明显影响。低温冻存可使病毒的感染性明显下降。结论：腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞中有高的转导效率，而病毒载体本身对细胞的生长没有影响，可用作乳癌特异药物前体酶激活基因治疗的基因转移方法。     

腺病毒介导的LacZ基因在人肝癌细胞HepG2中的表达

目的观察腺病毒介导的LacZ基因在人肝癌细胞HepG2中的转染表达效率。方法常规重组腺病毒Ad-LacZ扩增、滴度测定及转染HepG2细胞,并检测细胞表达LacZ的情况。结果当病毒感染繁殖数(MOI)为100时,24小时后接近100%的HepG2细胞被感染并表达LacZ。感染后HepG2细胞的增殖能力无明显异常。结论腺病毒介导的LacZ基因在HepG2细胞中能获得较高的转染效率和有效表达。     

成年大鼠侧脑室注射与脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的比较研究

目的比较观察脑室注射和脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的范围及表达产物的程度。方法分别将Ad5CMV LacZ表达载体（20μl,病毒滴度为1．01×10^5pfu／ml）注入成年SD大鼠右侧脑室、尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,在注射后3～28d将大鼠脑制作成为切片,进行X-gal组织化学反应,观察被转染和表达的细胞形态和数目。结果在侧脑室内注射后3d,右侧侧脑室室管膜细胞及其下层开始有病毒载体转染和表达,继之向对侧侧脑室、第三脑室和第四脑室转染和表达产物,脊髓中央管壁偶尔有被转染和表达的细胞;而将等体积和等滴度的AdSCMV LacZ载体注入尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,则均出现直径约2～5mm的转染范围,表达产物的细胞离注射原位最远处约为5—6mm,细胞表达产物很局限并相对集中;而侧脑室注射病毒载体可以随脑脊液流动而使转染范围广,但被转染细胞主要集中在室管膜及其下层,离脑室壁最远处也只在0．5—2mm范围内。结论侧脑室注射病毒表达载体便于基因治疗弥漫性脑疾病;而脑实质注射病毒表达载体则利于基因治疗局部性脑疾病。     

Adeno-X Tet-On系统调控LacZ基因在雪旺细胞中表达的研究

目的　应用Adeno XTet On系统感染雪旺细胞 ,通过四环素衍生物强力霉素 (doxcycline ,Dox)调控LacZ基因产物 (βgal)的表达。方法　①取生后 5～ 6dSD仔鼠坐骨神经进行雪旺细胞培养 ,并进行形态学及S 10 0蛋白相关抗原免疫组织化学染色鉴定。②将Adeno XTet OnVirusStock与Adeno XTRE βgalVirusStock分别感染HEK2 93细胞 ,收获病毒并作滴度测定。③将扩增后的病毒感染雪旺细胞并绘制Dox调控下βgal诱导表达曲线。结果　①由体外培养获得的雪旺细胞纯度可达 90 %以上并且状态良好 ,免疫组织化学染色阳性结果明显。②扩增后的病毒滴度较高 ,分别达 1.2 6× 10 9、1.99× 10 9pfu/ml。　结论　将病毒感染雪旺细胞后 ,经检测发现DOX对 βgal表达调控明显     

经鼠中心静脉途径注射重组腺病毒的基因转染效率及靶向性

目的：探讨经中心静脉途径注射外源基因在大鼠体内不同组织的表达及靶向性。 方法:将重组腺病毒AdLacZ经中心静脉途径导入SD大鼠体内,以X-gal染色法检测腺病毒介导的标识基因（LacZ）在大鼠体内的表达部位和时间。结果:注射AdLacZ（1×109pfu/mL）后1d,大鼠肺、肝、肾、脾组织即有少量表达。3d后大鼠肺、肝、肾、脾组织LacZ基因表达明显,7d时达高峰,14d开始下降,28d基本消失。肺组织,第3,7,14,21d,LacZ基因明显高于其他组织（P<0.05）,脑组织始终未见表达。结论:腺病毒携带的外源基因,经中心静脉途径给药,可能是肺、肝、肾等疾病基因治疗的有效途径,尤其适用于肺部疾病的基因治疗。     

Reporter LacZ gene transfer into cultured ocular cells of human eyes in vitro

Objective To investigate whether a reporter LacZ gene could be transferred into cultured ocular cells of human eyes in vitro. Methods Fibroblast cells of Tenon’s capsule, trabecular meshwork cells, and muscle celms in the ciliary body of human eyes were cultured and the pcDNA3-LacZ gene was transferred into these cells using a cationic liposome delivery system.The cells were subsequently fixed with 4% paraformaldehyde, mixed with X-gal, then observed under a microscope. Results Blue stain was seen in the cytoplasm of the cultured cells under the microscope, demonstrating the successful transfer of the LacZ gene into these cells.Conclusion Reporter LacZ gene was easily transferred into the cultured ocular cells in vitro.This provides insights into the transfer of the genes into these cells to study the pathogenesis and therapy of glaucoma.     

9-氨基吖啶诱导LacZ靶基因突变分子机制的研究

目的 使用我室新构建的含LacZ靶基因的λgt11 DNA 体外重包装致突变检测系统,研究了移码突变剂9-氨基吖啶（9-AA）诱发突变及分子突变谱,并进一步对该系统的可行性进行了评价。方法 用9-AA直接处理λgt11 DNA ,经体外重包装为完整噬菌体、铺皿,通过X-gal和IPTC检测突变率,使用DNA测序了解阳性克隆DNA分子改变情况。结果 9-AA能明显噬菌体的存活率和诱发DNA突变,突变率呈明显剂量-反应关系;9-AA主要诱发移码突变,移码突变主要集中在Gs、Gs、As、Ts重复区内且突变频率随碱基重复长度增加而增加;9-AA同时还能诱发碱基置换,碱基置换主要表现为颠换,而碱基转换主要发生于Gs碱基。结论 该致突变检测系统不仅可以快速、灵敏地筛选出外来化合物的遗传毒性,而且可以深入分析外来化合物致突变分子机制。     

腺病毒介导的β—半乳糖苷酶在小鼠气道上皮的转基因表达

目的：以β－半乳糖苷酶基因为标志基因研究重组复制缺陷腺病毒在 小鼠肺内气道上皮细胞中的转基因表达。方法：带有LacZ表达基因的重组复制缺陷腺病毒（AdCMVLacZ）,经鼻腔吸入法和气管内注射法两种途径分别感染小鼠肺组织,此后在不同时间取小鼠肺组织经多聚甲醛固定后,以X-gal染色。石蜡包埋切片后用核固红复染。结果：β－半乳糖苷酶经重组复制缺陷腺病毒AdCMVLacZ感染小鼠气道和肺泡上皮细胞,并高效表达目的基因,表达时间可长达31天,重复感染后仍可表达13天。结论：重组复制缺陷腺病毒可携带外源性基因在小鼠气道上皮细胞内进行高效、稳定和较为长期的转基因表达。     

外源基因在大鼠体内不同组织的表达

将逆转录病毒载体（ｐＮ２－ＬａｃＺ）或ｐＮ２－ＣＭＶ－ＰｒｏＵＫ质粒，直接导入Ｗｉｓｔａｒ大鼠股四头肌，心肌或动管内壁，证明外源性基因可以在上述组织中表达出相应的蛋白质。外源基因在注射人股四头肌后７天表达水平最高，约可持续１－３个月以上。将带有外源基因的医用缝合线，缝合于肌肉组织中，亦可于肌肉组织中表达邮相应的蛋白质，基表达效率远高于直接注射法。     

New mutation detection system of repackaged λ gt11 DNA containing LacZ gene

Objective: To establish a reformative detection system which has sound ability of providing information on molecular mutagenesis spectrum and the specificity of detection system of repackaged λ phage. Methods: LacZ gene, as mutational target gene and reporter gene, was applied into the detection system. The λ gt11 DNA treated with ENU (1-ethyl-1-nitrosourea) and 9-AA (9-aminoacridine) was repackaged in vitro. The packaged λ phage was then grown in E. coli Y1090 on a selective plate containing X-gel and IPTG. The survival and mutation frequencies were determined by counting the clear-plaque and blue-plaque, and the molecular mutation mechanism was studied by extracting and sequencing the LacZ gene of mutants. Results: The survival of repackaged λ phages treated with 9-AA and ENU apparently decreased in consistent dose-dependence. The mutation frequency of clear-plaque mutants showed a linear dose-related increase. The predominant mutations induced by 9-AA were ± 1 frameshift mutation, and 9-AA induc     

腺病毒介导CTLA4-FasL基因转移诱导大鼠心脏移植物长期存活的作用

目的　探讨腺病毒介导细胞毒T淋巴细胞相关抗原 (CTLA4 ) FasL基因转移延长异基因大鼠心脏移植物存活的作用及其相关机制。方法　供体DA大鼠心脏移植给受体LEW大鼠后 ,经门静脉注入 5× 10 9空斑形成单位 /毫升 (pfu/ml)CTLA4 FasL腺病毒 (AdCTLA4 FasL) ;随后 ,通过每天触摸受体大鼠腹壁 ,记录心脏移植物存活时间。受体大鼠尾静脉取血 ,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定CTLA4 FasL融合蛋白的体内表达 ;通过过继性转移试验、混合淋巴细胞反应 (MLR)及白细胞介素 (IL) 2逆转实验、细胞毒T细胞 (CTL)活性测定、辅助性T淋巴细胞前体 (HTLp)和细胞毒T淋巴细胞前体 (CTLp)频数测定及辅助性T细胞 (TH) 1/ 2型细胞因子检测 ,探讨耐受机制。结果　经AdCTLA4 FasL处理的受体大鼠 ,异基因心脏移植物平均存活时间达 (71 0± 2 3 7)d(n =6 ) ,而对照的未处理组、绿色荧光蛋白 (EGFP)腺病毒处理组和细胞毒T淋巴细胞相关抗原 4免疫球蛋白 (CTLA4Ig)腺病毒处理组平均存活时间分别为 (5 7± 0 5 )d(n =6 )、(5 2± 0 4 )d(n =6 )和 (4 5 7± 12 4 )d(n =6 ) ,差异具有显著意义 (均P <0 0 5 )。心脏移植物长期存活的受体大鼠对供体抗原的低应答可以被过继转移 ;MLR活性特异性降低 ,且不被外源性IL 2逆转 ;CTL活