血管内皮生长因子受体KDR基因胞外段1-3区基因转染抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的研究

目的 评价脂质体介导的血管内皮生长因子受体KDR基因胞外段1-3区(KDRn3)基因转染抑制氧诱导的视网膜新生血管的效果.方法 选1周龄C57Bl/6N小鼠置于氧浓度为75%±2%的氧箱中5 d.回到正常环境中诱导视网膜新生血管模型.在小鼠离开氧箱的当日,向转染组小鼠玻璃体腔注射脂质体pEGFP-N1/KDRn3复合物1 μl;脂质体对照组注射等量脂质体;空白对照组小鼠注射等量PBS.回到正常环境中后5 d,采用视网膜铺片及视网膜冰冻切片在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白在视网膜的表达;采用荧光标记的右旋糖酐血管灌注下视网膜铺片方法观察视网膜新生血管的分布并测量无灌注区面积;组织学切片观察比较突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量.多组比较采用方差分析,有统计意义后进行两两比较的q检验.结果 转染组视网膜铺片见视网膜局部散在点状绿色荧光信号,空白对照组与脂质体对照组未见绿色荧光信号;视网膜冰冻切片见转染组视网膜神经节细胞层、内核层部分细胞胞质内见绿色荧光表达,空白对照组与脂质体对照组视网膜各层未见绿色荧光表达;视网膜铺片观察可见空白对照组与脂质体对照组在无灌注区边缘均可见新生血管芽及荧光渗漏,转染组见新生血管芽明显减少,生后第17天A、B、C 3组新生血管模型小鼠各组视网膜无灌注区面积分别为(1.33±0.49)、(2.75±0.70)、(2.12±0.35)mm2,组间比较差异有统计学意义(F=17.61,P＜0.01＝.正常对照组及A、B、C组视网膜表面突破内界膜的血管内皮细胞核计数分别为0.20±0.51、13.58±2.48、23.05±3.40及21.70±2.89,组间比较差异有统计学意义(F=1085.25,P＜0.05＝.结论 pEGFP-N1/KDRn3基因转染可不同程度抑制氧诱导C57,Bl/6J小鼠视网膜新生血管的生长.

Abstract：

Objective To evaluate the effect of liposome mediated plasmids KDRn3 injected into the vitreous to inhibit experimental retinal neovascularization. Methods One-week-old C57BL/6N mice were exposed to 75% ± 2% oxygen for 5 days, then returned to the room air to induce retinal neovascularization. Cationic liposome mediated KDRn3 comp-lex (1 μl) was injected into the vitreous in the treatment group. PBS 1 μl or liposome were injected in the control group. The pEGFP-N1/ KDRn3 expression was observed by using fluorescence microscope. Retinal neovascularization was evaluated by counting the number of vascular endothelial cell nuclei on the vitreal side of the inner limiting membrane of the retina and measuring the areas of non-perfusionsin in central retina. Results KDRn3 protein was expressed both in the ganglion layer and in the inner layer. Retinal wholemount preparation of retinal neovascular animal model showed that prominent neovascular tuft and fluorescein leakage and large areas of non-perfusionsin in central retina. Fewer neovascular tufts and fewer areas of non-perfusionsin could be seen after pEGFP-N1/KDRn3 injection. There were statistic differences between control group and pEGFP-N1/ KDRn3 injecting group with the number of vascular endothelial cell nuclei on the vitreal side of the inner limiting membrane of the retina(0. 20 ±0. 51, 13. 58 ±2. 48,23. 05 ±3. 40,21. 70 ± 2. 89;F = 1085. 25, P ＜ 0. 05 ) and the areas of non-perfusionsin in central retina [(1. 33 ± 0. 49 ) , ( 2. 75 ± 0. 70 ) , ( 2. 12 ± 0. 35) mm2; F = 17. 61 , P ＜ 0. 01] . Conclusion pEGFP-N1/KDRn3 gene transfer can inhibit retinal neovascularisation in C57Bl/6J mice of ischaemia-induced retinal neovascularisation on some extent.     

Bevacizumab抑制高氧诱导新生小鼠视网膜新生血管的实验研究

目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的单克隆抗体Bevacizumab(Avastin)对视网膜新生血管的抑制作用.方法 80只7 d龄清洁级C57BL/6小鼠随机分为4组,即空白对照组、高氧实验组、小剂量实验组和大剂量实验组,建立高氧诱导新生小鼠产生视网膜新生血管的动物模型,分别对小剂量实验组和大剂量实验组行玻璃体注射Bevacizumab(25 g·L-1)0.5μL、1.0μL,免疫组织化学染色法观察VEGF在视网膜各层的表达,应用CD31计算突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数,评价该药对视网膜新生血管的抑制作用.电镜观察该药对视网膜超微结构的影响.结果 VEGF在各组视网膜中均有表达,在高氧组表达明显增加,两给药组表达相对较弱,空白对照组最弱.空白对照组、高氧实验组、小剂量实验组及大剂量实验组突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数分别为(0.20±0.42)个、(16.80±6.05)个、(3.90±1.52)个、(5.10±2.88)个,统计学处理结果表明两给药组分别与高氧实验组比较差异均有显著统计学意义(P均<0.01),而两给药组之间差异无统计学意义(P>0.05).透射电镜检查显示两给药组视网膜超微结构与高氧实验组相比损伤较轻.结论 Bevacizumab能有效抑制视网膜新生血管的形成,并在一定程度上对缺氧造成的视网膜超微结构的损伤具有预防作用.     

胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白-1抑制视网膜血管新生的实验研究

背景寻求有效的血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂是治疗和预防新生血管性眼病的关键。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白-1（IGFBP—rP1）是一种新发现的抑血管新生因子,推测其在眼内有抑制VEGF的作用。目的探讨IGFBP—rP1对VEGF体外诱导视网膜新生血管形成的抑制作用及其机制。方法使用含质量分数10％FBS的DMEM对猕猴视网膜／脉络膜血管内皮细胞株（RF／6A）进行扩增培养,利用免疫荧光细胞化学染色法观察RF／6A细胞表达IGFBP—rP1的情况。RF／6A细胞血清饥饿法培养24h后分为对照组、10mg／LVEGF组,50、100、200mg／LIGFBP—rP1＋10mg/L VEGF组进行干预,分别利用MTS比色法、Transwell实验和流式细胞术比较IGFBP—rP1（0、50、100、200mg／L）联合VEGF（10mg／L）作用后,RF／6A细胞在增生、移行和凋亡等生物学行为方面的变化。结果RF／6A细胞用不同质量浓度的IGFBP—rP1培养后细胞质呈FITC激发后的绿色荧光,细胞核呈PI激发后的红色荧光,而对照组细胞仅见细胞核的红色荧光。10mg／LVEGF组RF／6A细胞的A490值、移行细胞数与对照组相比明显增加,差异均有统计学意义（t=-15．191,P=0．000;t=-21．274,P=0．000）,细胞凋亡率明显下降,差异有统计学意义（t=10．228,P=0．000）。与10mg／LVEGF组相比,IGFBP—rP1（50、100、200mg／L）＋10mg／LVEGF组RF／6A细胞的A490值、移行细胞数明显下降（均P〈0．05）。50、100、200113geLIGFBP—rPl＋10mg／LVEGF组RF／6A细胞的细胞凋亡率分别提高了（1．26±0．04）％、（1．50±0．07）％和（1．93±0．27）％,各组的总体差异有统计学意义（F=274．273,P=0．000）。结论IGFBP—rP1作为一种内源性因子,通过促细胞凋亡机制抑制VEGF诱导的视网膜血管的生成。     

肝细胞生长因子与视网膜新生血管形成

视网膜新生血管形成可造成眼部多种组织成分的广泛损害,已成为世界范围的致盲性疾病。其发生及发展过程复杂,需要多种因素参与,包括多种生长因子的相互作用等。肝细胞生长因子(HGF)作为多效性生长因子,对新生血管形成的作用逐渐被认识。本文主要探讨HGF在视网膜新生血管发病机制中的作用以及与血管内皮生长因子(VEGF)的关系。     

血管内皮生长因子及其受体与眼底新生血管

眼底新生血管是多种眼病的并发症,研究发现促进眼底新生血管发生发展的最主要的因子是血管内皮生长因子,在这些眼病的病理过程中血管内皮生长因子表达上调,表达上调的血管内皮生长因子引起脉络膜或视网膜的新生血管.目前缺少针对眼底新生血管的有效的早期治疗手段,一系列下调或阻断血管内皮生长因子或其受体的药物和抑制二者结合后生物学效应发挥的药物已成为治疗眼底新生血管研究的热点之一.     

可溶性VEGF受体1在视网膜新生血管疾病中的研究进展

视网膜新生血管性疾病的共同特征是病理性新生血管形成。目前研究的内源性视网膜新生血管因子最主要的是VEGF。可溶性VEGF受体1(sFlt-1)是VEGFR-1的mRNA胞外区剪接形成的可溶性形式,只编码胞外区,缺乏细胞内酪氨酸激酶区域,所以其仅具有与配体结合的能力,而无信号转导能力,从而阻止新生血管的形成。sFlt-1作为近年来的研究热点,有可能成为治疗该类疾病的新的基因治疗方法。本文就sFlt-1在视网膜新生血管疾病治疗中的作用机制及研究进展做一综述。     

血管内皮生长因子与大鼠角膜移植术后新生血管增生关系的实验研究

目的：观察血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）在大鼠角膜移植术后不同时间点的表达及与角膜新生血管（ＣＮＶ）生长之间的关系。方法：利用免疫组化方法观察同种异体大鼠角膜移植术后不同时间点ＶＥＧＦ的表达。结果：角膜移植术后,ＶＥＧＦ组ＣＮＶ生长面积与其它各组差异有高度显著性（Ｐ〈０．０１）,生长时间提前,高峰期持续时间长,ＶＥＧＦ表达明显强,     

兔视网膜静脉阻塞眼视网膜新生血管组织中 血管内皮生长因子mRNA的表达

目的探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF )在视网膜新生血管组织的发生发展中的参与机制。方法 采用氩激光直接光凝法封闭兔眼视网膜静脉建立视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion,RVO)模型。利用组织原位杂交法观察缺血视网膜组织及新生血管组织中VEGF mRNA的表达。结果缺血视网膜及新生血管组 织中有不同程度的VEGF mRNA表达,表达的程度以视网膜新生血管组织中最强。 VEGFmRNA 的表达部位与视网膜组织缺血的分布具有一定的对应性。结论VEGF在视网膜血管增生性病变的发生中可能具有重要的参与机制。(中华眼底病杂志,2001,17:5-7)     

内皮抑素对视网膜新生血管中血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的:观察内皮抑素(endostatin,ES)对视网膜新生血管中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:通过缺氧的方法建立小鼠视网膜新生血管模型36只,随机分为高氧组及ES治疗组。ES治疗组小鼠在出氧箱后12,36h,玻璃体腔内注射ES1μL。另将生活在正常氧环境中的18只同龄小鼠作为正常对照。提取3组小鼠视网膜总RNA,通过RT-PCR方法定量检测VEGF在3组小鼠视网膜中的表达。结果:氧致视网膜病变视网膜中VEGF的表达升高,与正常对照组比较有统计学意义(高氧组与正常对照组比较P<0.05);ES作用后VEGF的表达减少,与给氧组比较有统计学意义(ES治疗组与高氧组比较P<0.05)。结论:ES作用机制可能是通过抑制VEGF mRNA基因的表达来抑制视网膜新生血管的形成。     

视网膜新生血管动物模型的制备

目的制备视网膜新生血管动物模型,为今后的视网膜新生血管相关疾病的研究提供稳定的模型.方法以出生7d的C57BL/6J小鼠56只,雌雄兼有,随机将28只放入75%±2%高氧环境,控制室温23℃±2℃,日光照明,5d后返回空气环境;另一组28只置于23℃±2℃空气环境中饲养作为对照.随机于出生后12、14、17、21、22、25d取高氧组和空气组小鼠行视网膜铺片、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)免疫组化染色,观察VEGF的表达情况,并对出生后17d小鼠的视网膜铺片、石蜡切片HE染色、VEGF免疫组化染色.结果高氧诱导组出生后17d视网膜无血管区面积,穿过视网膜内界膜细胞核计数明显高于空气组.血管内皮细胞VEGF的表达从出生后14d开始有阳性表达,阳性表达逐渐增强,出生后17d达到高峰,之后逐渐下降,持续至出生后21d.结论该模型为一种合适的视网膜新生血管动物模型.     

血管紧张素转换酶抑制剂抑制小鼠视网膜新生血管的实验研究

目的:探讨血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)对视网膜新生血管(retinal neov-ascularization,RNV)的抑制作用。方法:采用随机对照实验研究。选取7天龄C57BL/6J新生小鼠36只,随机分为2组:高氧组和ACEI组,每组18只。ACEI组和高氧组小鼠建立氧诱导视网膜病变模型,出氧箱后每日分别ip卡托普利10mg/kg和等量生理盐水,连续5d。采用荧光素血管灌注视网膜铺片观察视网膜血管形态学改变;制作视网膜组织切片并进行HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;采用Western blot检测视网膜血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表达。结果:荧光素血管灌注视网膜铺片:高氧组可见大量新生血管丛,伴明显荧光渗漏,ACEI组较高氧组视网膜新生血管减少,荧光渗漏减轻。突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数:ACEI组较高氧组减少,差异具有统计学意义(P=0.00)。视网膜AngII蛋白表达水平:ACEI组较高氧组下调,差异具有统计学意义(P=0.00)。视网膜VEGF蛋白表达水平:ACEI组较高氧组下调,差异具有统计学意义(P=0.00)。结论:早期应用ACEI可一定程度抑制RNV形成。     

金雀异黄素抑制兔视网膜中央静脉阻塞新生血管的研究

目的评价金雀异黄素（genistein，Gen）对兔视网膜中央静脉阻塞新生血管的产生是否具有抑制作用，并探讨其机制。方法采用氩激光直接光凝法封闭兔视网膜静脉建立视网膜中央静脉阻塞模型成功后1周，将兔分为2组，2组玻璃体内分别注射150μmol·L-1的Gen0.1 mL和DMSO 0.1mL，连续4d。用药1周后处死，行视网膜血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）免疫组织化学染色和视网膜HE染色．计数矢状面6 μm视网膜切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数。兔光凝前、光凝后当天、1d、7d、18d行眼底荧光血管造影。同时设立正常对照组。结果Gen治疗组视网膜发生新生血管的眼数较DMSO组少，但较正常对照组多。Gen治疗组、DMSO组和正常对照组平均每个切面突破内界膜的血管内皮细胞核数为12.18±4.11、18.19±5.51和O.34±0.02．视网膜VEGF免疫组织化学分数分剐为1.02±0.15、1.94±0.31和O.33±O.12，3组之间差异有统计学意义（P〈0.01）。结论Gen可抑制缺血性视网膜病变的血管新生．机制可能与Gen抑制视网膜VEGF的表达有关。     

视网膜新生血管生物药物治疗研究进展

眼内新生血管的发生是许多眼病的病理基础和重要临床表现,而血管内皮生长因子(VEGF)是刺激不正常的血管生长以及造成血管壁渗漏的主因,因此抗VEGF靶分子治疗成为当今的研究热点.本文综述了近年来视网膜新生血管生物药物治疗新进展,包括VEGF反义寡聚脱氧核苷酸、VEGF抗体、RNA干扰类药物等.这些方法均显示出令人振奋的效果,但仍需要经过长期、系统的临床试验检验其安全性、有效性.     

MMP-2和VEGF在视网膜新生血管的表达

目的检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)在视网膜新生血管中的表达,探讨两者的相互关系。方法 取7 d龄C57BL/6J小鼠40只,随机分为高氧组和对照组,每组各20只。建立高氧诱导的视网膜新生血管小鼠模型。采用ADP酶组织化学染色、HE染色和免疫组化方法分别观察2组视网膜血管的变化、计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核数目和检测MMP-2、VEGF的表达。结果 高氧组视网膜铺片可见大量视网膜新生血管形成,对照组未见新生血管形成;高氧组突破视网膜内界膜内皮细胞核数目为14(14.230±5.388),与对照组数目0(0.110±0.386)相比差异有统计学意义(t=23.537,P<0.001);对照组和高氧组视网膜组织中VEGF的积分光密度值分别为36.81±14.60、60.85±24.55,差异有统计学意义(t=3.348,P<0.01);对照组和高氧组视网膜组织中MMP-2的积分光密度值分别为16.33±4.13、21.12±6.29,差异有统计学意义(t=3.160,P<0.01)。高氧组视网膜组织中MMP-2和VEGF的表达呈正相关(r=0.633,P<0.01)。结论 在ROP小鼠模型的视网膜组织中,VEGF、MMP-2的表达同步升高,二者的高表达可能与视网膜新生血管形成密切相关。     

MMP-2和VEGF在视网膜新生血管中的表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）在视网膜新生血管中的表达及意义。方法取C57BL/6J小鼠60只,随机分为高氧组和正常组,各30只。以高浓度氧诱导小鼠建立视网膜新生血管模型。采用ADP酶视网膜铺片、苏木精-伊红染色及免疫组织化学法分别观察视网膜血管的改变、计数视网膜新生血管内皮细胞数并检测MMP-2、VEGF蛋白的表达。结果高氧组视网膜可见大量新生血管形成;突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数为（33.51±2.55）个,与对照组相比差异有统计学意义（t=9.345,P〈0.05）。高氧组与对照组比较,MMP-2、VEGF蛋白在神经节细胞层、内丛状层、内核层和突破视网膜内界膜的新生血管中高表达,且二者表达呈正相关（r=0.825,P〈0.05）。结论MMP-2、VEGF共同促进视网膜新生血管的形成,且二者可能具有协同作用。     

GM6001抑制视网膜新生血管形成VEGF和MMP2的表达

目的:探讨基质金属蛋白酶抑制剂GM6001对鼠视网膜新生血管形成的抑制作用及机制。方法:采用高氧使鼠视网膜血管阻塞建立早产儿视网膜病变模型后,将鼠分为两组,玻璃体腔内注射75μmol/L的GM60010.5μL,另一组不治疗。5d后处死,行视网膜HE染色计数矢状面5μm视网膜切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数,和血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)免疫组织化学染色,以及视网膜铺片。同时设立正常对照组。结果:GM6001治疗组视网膜发生新生血管的眼数较高氧对照组少,但较正常对照组多。GM6001治疗组、高氧对照组、正常对照组平均每个切面突破内界膜的血管内皮细胞核数为2.38±0.90,21.25±1.12和1.23±0.46,高氧对照组与正常对照组具有显著统计学差异(P<0.01),GM6001治疗组与正常对照组无统计学差异(P>0.05),与高氧对照组具有显著统计学差异(P<0.01)。视网膜铺片正常对照组血管发育成熟,深浅两层血管网结构清晰,可见螺旋动脉,高氧对照组血管迂曲阻塞,大量结构异常新生血管,丧失了血管网结构,GM6001治疗组见两层血管网结构清晰,仍有少部分深层血管阻塞。视网膜免疫组织化学检测GM6001治疗组VEGF及MMP-2与正常对照组有统计学差异(P<0.05),与高氧对照组也有显著统计学差异(P<0.01)。结论:GM6001可抑制视网膜病的血管新生,机制可能是抑制了MMP-2对VEGF的作用。