微生物非核糖体多肽的合成基因簇挖掘及其合成研究进展

摘要：非核糖体多肽因其独特的生物活性受到关注,它结构复杂、种类繁多。许多微生物能利用非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthase,NRPSs)合成这些非核糖体多肽。NRPSs是一类分子巨大的蛋白复合物,由一系列催化结构域组成,能识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合成非核糖体肽(non-ribosomal peptide,NRPs)。其模块化结构涉及的基因在基因组上成簇排列。基于基因组挖掘技术可以预测基因组上的次级代谢产物合成基因簇,并发现新的次级代谢产物。针对非核糖体多肽的生物合成基因簇的分布、挖掘、模块化结构以及合成等方面的研究进行分析,有望为理解非核糖体肽合成酶系统合成生物活性物质的机制和挖掘新型生物活性物质提供依据。     

微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新

微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物，其生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提。迄今为止已有超过150种生物合成基因簇通过各种方式被克隆，并被用于组合生物合成、体外糖类随机化、代谢工程的定向改造。我们研究室已经克隆并测定了氨基糖苷类井冈霉索／有效霉索、多烯类抗生素FR-008／克念菌索、聚醚类南昌霉索、聚酮类梅岭霉索、杂合聚酮一多肽类略唑霉索等生物合成基因簇。深入的基因功能分析揭示了他们独特的生物合成途径和调节机理，为正在进行的组合生物合成结构改造和代谢工程产量提高奠定了基础。     

罗米地辛类抗癌药物的生物合成

罗米地辛(又称FK228)是紫色色杆菌中非核糖体肽合酶(NRPS)和I型聚酮合酶(PKS)催化合成的一种缩酚酸肽类天然产物,具有组蛋白脱乙酰基酶抑制剂活性,现被用于皮肤T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤的临床治疗。我们对已发现的罗米地辛类天然产物的化学结构,生物合成基因簇和生物合成途径的研究现状进行了总结,在此基础上初步探讨了通过基因组挖掘和组合生物合成等生物学手段获取新的罗米地辛类天然产物的可能性。     

基于元基因组的南海海绵Theonella swinhoei共生微生物次级代谢潜力研究

目的 揭示中国南海海绵Theonella swinhoei共生微生物次级代谢潜力。方法 用Illumina Hiseq 2000测序仪对T. swinhoei元基因组DNA进行测序,用MG-RAST平台对共生微生物种群结构和功能进行分析,并比较此海绵与其它海绵的次级代谢差异。用fragment recruitment方法评估T. swinhoei元基因组中具有代表性的微生物在此种海绵和其它生境中的丰度。用antiSMASH预测T. swinhoei元基因组中次级代谢产物生物合成基因簇,并通过序列比对分析其来源。结果 T. swinhoei共生微生物主要包括Proteobacteria(30.5%)、Actinobacteria(6.2%)、Poribacteria(3.6%)、Firmicutes(3.5%)、Chloroflexi(2.6%)和Cyanobacteria(2.1%)。Candidatus Entotheonella sp. TSY1和Candidatus Entotheonella sp. TSY2在T. swinhoei中的丰度比其它生境高很多。T. swinhoei共生微生物中聚酮合酶模块和相关蛋白(COG3321)以及非核糖体肽合成酶模块和相关蛋白(COG1020)基因的比例比其它海绵共生微生物中的比例高。次级代谢产物生物合成基因簇除来自Candidatus Entotheonella外,还有许多来自未知的共生细菌和可能的蓝细菌。结论 中国南海海绵T. swinhoei共生微生物具有很强的次级代谢潜力,为研究海绵天然产物微生物来源提供了依据,同时为进一步开发利用T. swinhoei共生微生物资源提供了基础。     

组合生物合成研究进展

组合生物合成是通过对微生物代谢途径中一些酶的编码基因进行操作,从而获得许多新的“非天然”天然产物。本文重点介绍聚酮合酶（PKSs）和非核糖体多肽合酶（NRPSs）的分类、作用机制及其杂合系统在组合生物合成应用研究中相关报道。另外,对于PKSs和NRPSs在大肠埃希荫中的异源表达也作了简单介绍。     

锡林郭勒盟高原盐湖放线菌资源勘探及抗菌活性筛选

摘要：目的 探究锡林郭勒盟高原盐湖放线菌的多样性、新颖性及抗菌活性,为新型抗菌活性产物的发掘储备菌种资源。方 法 采用20种分离培养基,以平板涂布法分离放线菌;依据16S rRNA基因的同源性对菌株进行分子鉴定;PCR检测代表菌株的I型聚 酮合酶(PKS I)、II型聚酮合酶(PKS II)和非核糖体多肽合成酶(NRPS)功能基因;菌株的发酵液上清和菌体分别经乙酸乙酯和丙酮提取, 提取样品经纸片扩散法进行抗菌活性检测。目标菌株合成次级代谢产物的能力通过antiSMASH对基因组序列进行分析预测。结果 从 7份盐湖土壤样品中分离获得了365株放线菌,其分布于放线菌纲的8个目15个科28个属,优势菌属为链霉菌属和拟诺卡菌属。分离获 得的链霉菌新颖性突出,13株链霉菌与近缘菌株16S rRNA基因的最高相似度≤98.0%,推测其归属于10个链霉菌属新种。受试放线菌 对革兰阳性菌的抗菌活性显著,并从中筛选出3株抗菌作用强且抗菌谱较广的链霉菌;20株受试放线菌同时含有3种抗生素生物合成基 因。菌株XMNu-295基因组含有24个潜在的次级代谢产物生物合成基因簇,以聚酮类、非核糖体多肽类和萜烯类等为主。结论 锡林 郭勒盟高原盐湖中可培养放线菌多样性较为丰富,新颖性突出,目标菌株值得进一步开展次级代谢产物的化学研究。     

抗生素生物合成的研究

抗生素生物合成研究的目的旨在阐明微生物生物合成抗生素的途径和机制,更为有效地进行发酵调控以提高目的产物的生物合成量;同时利用抗生素次级代谢物合成酶的底物特异性较差的特点和次级代谢产物发生变化的突变株来制备新的抗生素。用于抗生素生物合成的研究方法主要有:(1)同位素示踪法;(2)突变生物合成技术;(3)参与抗生素生物合成的酶的研究及(4)代谢调控的研究。对于一个具有临床意义或其他应用价值而有着开发前景的抗生素来说,进行生物合成的研究是很重要的。研究者可根据自己的     

聚酮合成酶应用研究进展

聚酮合成酶在生物活性产物的合成方面有广泛应用,本综述简单介绍了三类聚酮合成酶,并阐述了几例聚酮合成酶应用的原理及合成过程,分别为八酮烯二炔核心结构生物合成应用、增加聚酮合成酶多样性应用和构建"非自然"的天然产物。     

Advances in Application Research of Polyketide Synthases

聚酮合成酶在生物活性产物的合成方面有广泛应用,本综述简单介绍了三类聚酮合成酶,并阐述了几例聚酮合成酶应用的原理及合成过程,分别为八酮烯二炔核心结构生物合成应用、增加聚酮合成酶多样性应用和构建“非自然”的天然产物.     

一株海洋来源Streptomyces sp. SCSIO 1682中那西肽(nosiheptide)的分离鉴定及其生物合成基因簇分析

目的 对一株海洋来源的菌株SCSIO 1682进行16S rDNA分子生物学鉴定,对发酵产物中的抑菌活性化合物进行分离鉴定,并对抑菌活性化合物的生物合成基因簇进行分析。方法 通过构建基于16S rDNA序列的系统发育树来进行菌株鉴定;通过有机溶剂萃取、正相和反相硅胶层析等化学分离手段对菌株SCSIO 1682的次级代谢产物进行活性追踪分离纯化;运用HR-ESI-MS,₁H和₁₃C NMR等波谱手段对所得化合物进行结构解析;通过对菌株SCSIO 1682进行全基因组扫描测序鉴定所得化合物的生物合成基因簇。结果 该菌株被鉴定为Streptomyces sp. SCSIO 1682,所得抑菌活性化合物为那西肽,鉴定了那西肽的生物合成基因簇并进行生物信息学分析。结论 从海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 1682中分离鉴定了那西肽,那西肽生物合成基因簇的鉴定为利用组合生物合成和合成生物学技术对那西肽进行结构改造提供了新的基因资源。     

海洋放线菌次级代谢产物及其抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性研究进展

放线菌是发现大量药用天然产物的资源宝库,在微生物新药研究中占据着十分重要的地位。海洋放线菌生活环境特殊造就了其不同于陆地微生物独特的代谢途径,具有产生多种生物活性物质的潜力,是天然药用活性先导化合物的重要来源。从不同海洋生境来源放线菌的次级代谢产物中寻找生物活性物质已成为近年来的研究热点。目前已经分离到许多结构新颖、活性显著的化合物,为新药的研究提供了丰富的物质基础。本文主要对近3年（2015～2017）不同海洋生境来源且具有明显抗菌、抗病毒、抗肿瘤生物活性的放线菌次级代谢产物进行综述。     

Rational design of macrolides by virtual screening of combinatorial libraries generated through in silico manipulation of polyketide synthases

Bacterial secondary metabolites display diverse biological activities, thus having potential as pharmacological agents. Although most of these compounds are discovered by random screening, it is possible to predict and re-design their structures based on the information on their biosynthetic pathways. Biosynthesis of macrolides, governed by modular polyketide synthases (PKS), obeys certain rules, which can be simulated in silico. PKS mode of action theoretically allows for a huge number of macrolides to be produced upon combinatorial manipulation. Since engineering of all possible PKS variants is practically unfeasible, we created Biogenerator software, which simulates manipulation of PKS and generates virtual libraries of macrolides. These libraries can be screened by computer-aided prediction of biological activities, as exemplified by analysis of erythromycin and macrolactin libraries. This approach allows rational selection of macrolides with desired biological activities and provides instructions regarding the composition of the PKS gene clusters necessary for microbial production of such molecules.     

雷帕链霉菌次级代谢产物及其生物合成的研究进展

摘要：雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus)是一种重要的工业菌株,主要用于生产新型大环内酯类抗生素——雷帕霉 素。该抗生素具有抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制和抗衰老等众多生物活性,临床上主要用作器官移植的免疫抑制剂以及抗肿瘤药 物。全基因组测序表明,雷帕链霉菌野生型菌株NRRL5491基因组全长12.7Mb,编码多达48个次级代谢产物生物合成基因簇(共 长达3Mb),证明其具备强大的次级代谢潜力。除雷帕霉素以外,至今已有多种活性天然产物被鉴定,包括放线菌酸、尼日利亚 菌素、洋橄榄叶素、安莎类抗生素和六烯类抗生素等,相关合成基因簇及其生物合成途径已被解析。本文将就雷帕链霉菌中各 种次级代谢产物的生物学功能、生物合成基因簇及其生物合成过程等研究进展进行总结梳理,并就如何更好挖掘雷帕链霉菌中 的活性天然产物进行简单展望与讨论。     

海洋放线菌SCSIO 07745中红霉素衍生物的分离、鉴定和生物合成基因簇的分析

目的：对从中国南海沉积物样品中分离的放线菌SCSIO 07745中抑菌活性次级代谢产物进行研究,并对相应产物的生物合成基因簇进行分析。方法：提取菌株SCSIO 07745基因组DNA,利用Illumina Hiseq和PacBio SMRT技术进行基因组测序;通过对16S rDNA序列进行分析构建系统发育进化树以鉴定菌种;以有机溶剂萃取得到发酵产物并利用正相反相柱层析等色谱手段进行分离纯化;通过波谱数据分析对化合物进行结构鉴定。利用生物信息学技术对基因组进行注释并对合成该化合物的基因簇进行定位分析,推导其生物合成途径。结果：该放线菌被鉴定为糖多孢红霉菌Saccharopolyspora erythraea,从其发酵产物中分离鉴定了2个大环内酯类化合物sporeamicin A(1)和erythromycin A enol ether(2)。全基因组序列测序发现该菌株基因组DNA为线状,含有31个次级代谢产物生物合成基因簇,其中基因簇3可能负责红霉素衍生物的生物合成,并对其生物合成途径进行了推导。结论：筛选得到了1株产生红霉素类化合物的海洋糖多孢红霉菌S. erythraea SCSIO 07745,为红霉素类抗生素的开发提供了新的菌株资源。同时,该菌株的全基因组序列为其蕴藏的次级代谢产物的挖掘奠定了基础。     

产2S-甲基丙二酰辅酶A的基因工程假单胞菌的构建

目的:假单胞菌是次级代谢产物生物异源表达的优良宿主菌,然而它缺少许多次级代谢产物生物合成所需的小分子前体:2S-甲基丙二酸辅酶A(2S-mm-CoA),,因此构建产生2S-mm-CoA的宿主菌将有利于次级代谢产物的异源表达.方法:本研究将来源于大肠埃希菌的编码甲基丙二酰辅酶A变位酶的sbm基因和编码甲基丙二酰辅酶A变位...     

重组工程法构建德胺糖生物合成基因簇的表达载体

德胺糖(desosamine)是次级代谢产物来源的微生物药物中的一个重要的糖基团。为构建德胺糖生物合成基因簇的异源表达体系,本研究运用重组工程技术一步法从黏粒中克隆了德胺糖的生物合成基因簇的两个转录单元,重组效率高达100%。本方法避免了常规克隆手段的烦琐、耗时、针对长DNA片段的PCR易发生碱基突变等缺点。进一步,将两个转录单元分别置于来源于天蓝色链霉菌的pacI/pactIII双向启动子的控制下并克隆至链霉菌的游离型和整合型表达载体上。本工作为探索德胺糖生物合成基因簇在异源宿主菌中表达、德胺糖与多种糖苷底物偶联以创制新化合物奠定了基础。     

Pharmacologically prospective antibiotic agents and their sources: A marine microbial perspective

Marine microbes have been a storehouse of bioactive metabolites with tremendous potential as drug candidates. Marine microorganism derived secondary metabolites (chemical compounds/peptides) are considered to be a burning area of research since recent past. Many of such compounds have been proven to be anti-bacterial, anti-fungal, anti-algal, anti-HIV, anti-helminthic, anti-protozoan, anti-tumor and anti-allergic agents. Marine bacteria and fungi have been reported to be the producers of such compounds owing to their defense mechanisms and metabolic by products. Although the number of natural products isolated from these classes of marine microbial flora is large, a limited number of such compounds reach the clinical trial and even less number of them get approved as a drug. Here we discuss the recent studies on the isolation, characterization and the pharmacological significances of anti-bacterial, anti-fungal and anti-infective agents of marine microbial origin. Further, the clinical status of such compounds has also been discussed in comparison with those derived from their terrestrial counterparts.     

The biosynthetic gene clusters of aminocoumarin antibiotics

Plants and microorganisms are the most important sources of secondary metabolites in nature. For research in the functional genomics of secondary metabolism, and for the biotechnological application of such research by genetic engineering and combinatorial biosynthesis, most microorganisms offer a unique advantage to the researcher: the biosynthetic genes for a specific secondary metabolite are not scattered over the genome, but rather are clustered in a well-defined, contiguous region - the biosynthetic gene cluster of that metabolite. This is exemplified in this review for the biosynthetic gene clusters of the aminocoumarin antibiotics novobiocin, clorobiocin and coumermycin A (1), which are potent inhibitors of DNA gyrase. Cloning, sequencing and analysis of the biosynthetic gene clusters of these three antibiotics revealed that the structural differences and similarities of the compounds are perfectly reflected by the genetic organisation of the biosynthetic gene clusters. The function of most biosynthetic genes could be identified by gene inactivation experiments as well as by heterologous expression and biochemical investigation. The prenylated benzoic acid moiety of novobiocin and clorobiocin, involved in the interaction with gyrase, is structurally similar to metabolites found in plants. However, detailed investigations of the biosynthesis revealed that the biosynthetic pathway and the enzymes involved are totally different from those identified in plants.     

Emerging biopharmaceuticals from marine actinobacteria

Actinobacteria are quotidian microorganisms in the marine world, playing a crucial ecological role in the recycling of refractory biomaterials and producing novel secondary metabolites with pharmaceutical applications. Actinobacteria have been isolated from the huge area of marine organisms including sponges, tunicates, corals, mollusks, crabs, mangroves and seaweeds. Natural products investigation of the marine actinobacteria revealed that they can synthesize numerous natural products including alkaloids, polyketides, peptides, isoprenoids, phenazines, sterols, and others. These natural products have a potential to provide future drugs against crucial diseases like cancer, HIV, microbial and protozoal infections and severe inflammations. Therefore, marine actinobacteria portray as a pivotal resource for marine drugs. It is an upcoming field of research to probe a novel and pharmaceutically important secondary metabolites from marine actinobacteria. In this review, we attempt to summarize the present knowledge on the diversity, chemistry and mechanism of action of marine actinobacteria-derived secondary metabolites from 2007 to 2016.