HIV-1病毒蛋白与细胞膜通道调制

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)主要感染中枢神经系统(Central nervous system,CNS)和免疫系统,导致感染者血脑屏障(blood brain barrier,BBB)受损、免疫功能缺陷等神经病理性改变,人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒蛋白对于病毒的病理变化发挥着重要作用。本文主要综述HIV-1的感染机制、HIV-1病毒蛋白及其对细胞膜通道的调制作用,以期为治疗AIDS提供更多思路。     

HIV-1 Gag蛋白 P2/NC 蛋白酶切割位点序列的随机化及噬菌体展示

目的:构建HIV-1 Gag PR蛋白P2/NC切割位点序列随机化的噬菌体展示文库,研究HIV-1蛋白酶(protease PR)耐药性突变对其敏感切割序列的影响.方法:PCR扩增制备重组HIV-1 gag基因上的CAP2和NC片段,在CAP2片段5′端引入StuⅠ酶切位点,3′端PR切割位点处的氨基酸序列进行随机化;在NC片段5′端设计重叠区域,3′端引入SalⅠ酶切位点.应用Overlapping PCR将CAP2和NC片段拼接并克隆于噬菌体展示载体LD3-pCANTAB5S上,建立HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之间切割位点随机化的噬菌体展示文库.结果:该噬菌体展示文库库容量为2.1×106,滴度为3.0×1012TU/ml,CAP2/NC片段插入率为52.1%;12个样品的序列分析显示切割位点中随机化的核苷酸与氨基酸均呈随机性分布; 10个阳性单克隆噬菌体CAP2/NC-LD3-pCANTAB5S样品中9个与IgG特异结合.结论:成功地对HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之间切割位点进行了随机化并展示于噬菌体表面,构建了其噬菌体展示文库,为筛选耐药性突变的PR敏感切割序列及构建蛋白酶抑制剂噬菌体筛选模型打下基础.     

HIV-1P24蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

目的 制备HIV-1 P24蛋白及单克隆抗体,建立酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测HIV感染.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增p24基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,经E.coli表达并纯化HIV-1 P24蛋白.以纯化P24蛋白抗原免疫Balb/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,制备能产生P24单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用Western blot、ELISA技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定,建立检测P24蛋白含量的ELISA竞争法.结果 原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达P24蛋白,从杂交瘤细胞中选取能稳定分泌P24单克隆抗体的杂交瘤细     

AT-2灭活HIV-1病毒及纯化回收鉴定

目的 制备具备完整空间构型且纯度在90%以上的灭活HIV-1病毒,用于HIV疫苗研究.方法 应用化学制剂2,2'-dlthiodipyridine(aldrithiol-2;AT-2)灭活HIV-1病毒,对灭活的病毒超速离心浓缩并洗涤去除灭活用的化学制剂AT-2.采用分子筛技术去除灭活病毒中残存的杂质蛋白质.结果 250μmoL/L AT-2与HIV-137℃作用1 h可以彻底灭活病毒的感染性,同时保留病毒的免疫原性.灭活的病毒纯化后检测不到AT-2的残留,检测牛血清蛋白残余量低于50 ng/mL.结论 灭活的HIV-1病毒经过纯化后纯度达到95.6%,可以满足作为HIV疫苗研究的免疫刺激剂的使用要求.     

P14^ARF及P53蛋白在肝癌中的表达及相关性研究

目的:探讨肝癌组织中P14ARF和P53蛋白的表达情况及相关性.方法:应用免疫组化方法检测50例肝癌及癌旁组织中P14ARF和P53蛋白的表达.结果:P14ARF及P53在肝癌及癌旁组织中的表达比较差异均有统计学意义(P＜0.05).P14ARF蛋白在肿瘤分化程度上表达差异有统计学意义(P＜0.05),而与临床分期、门脉癌栓、术后复发、肝外转移、肿瘤大小、肿瘤个数及血清AFP无关(P＞0.05).P53蛋白表达在门脉癌栓、术后复发、肝外转移、肿瘤分化程度比较差异有统计学意义(P＜0.05),与临床分期、肿瘤大小、肿瘤个数及血清AFP无关(P＞0.05).P14ARF和P53蛋白的表达呈负相关(r=0.324,P=0.022).结论:P14ARF与 P53蛋白在肝癌的发生及发展中起着重要作用.     

EB病毒相关胃癌组织中P53及P21蛋白的表达

目的探讨Epstein-Barr病毒(EBV)感染、P53和P21蛋白表达异常在胃癌发生发展中的作用以及三者相关性。方法应用免疫组化技术检测13例EBV相关胃癌(EBVaGCs)、45例临床指标与之匹配的EBV阴性胃癌(EBVnGCs)以及58例相应癌旁组织中P53和P21蛋白的表达。结果胃癌组织P53蛋白阳性率明显高于癌旁组织,差异有极显著性(χ2=50.000,P<0.01)。EBVnGCs组织中P53蛋白阳性率与EBVaGCs相比差异无显著性(χ2=0.072,P>0.05);但EBVaGCs组织P53蛋白过表达率明显低于EBVnGCs组织,差异有极显著性(χ2=7.259,P<0.01)。胃癌组织P21蛋白阳性率明显低于癌旁组织,差异有极显著性(2χ=12.500,P<0.01)。EBVnGCs与EBVaGCs组织P21蛋白阳性率无明显差异(P>0.05)。胃癌组织中P21与P53蛋白共同表达率较高,但无显著相关性(2χ=1.323,P>0.05,r=0.202 5)。结论P21蛋白表达存在p53依赖性和p53非依赖性两条途径;胃癌组织中EBV感染与P53蛋白的异常表达有关,而与P21蛋白异常表达无显著相关性。     

乙型肝炎病毒P22e蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 研究乙型肝炎病毒P22e蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 利用含HBVP22e基因的重组pEGFP-C2HBVP22e质粒的人肝细胞癌细胞系HepG2,并以Act-D、TNFα诱导该细胞系发生凋亡,使用流式细胞术,检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例代表凋亡细胞数;使用激光共聚焦显微镜,观察凋亡细胞核的变化,进一步研究HBVP22e在肝细胞凋亡的生物学功能效应.结果 HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞系在发生凋亡的时间上比HepG2细胞系有明显延迟,凋亡的发生率也明显低于HepG2细胞系(P＜0.01).结论 由于外源性基因HBVP22e的引入及表达,对HepG2细胞的凋亡有明显的抑制作用.     

宿主与HIV-1病毒的相互作用

人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)主要由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)引起。近10年对HIV-1编码基因的功能研究结果促进了抗病毒药物的发展,如能直接抑制HIV-1基因编码的酶(逆转录酶和蛋白酶)的药物。但由于病毒突变所导致的耐药性及药物的不良反应等使这些药物不能很好的控制AIDS的发展。若没有合适的宿主因素,病毒将不能进行复制及引起疾病,通过调控宿主因素有可能防治病毒引起的疾病。本文对近年宿主与HIV-1相互作用的研究进展作简要论述。     

丙型肝炎病毒P7蛋白体外原核表达状况的研究

目的:扩增丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)P7蛋白基因,克隆到多个原核表达系统,观察P7蛋白在体外表达的情况,获取具有生物学活性的HCV P7重组蛋白.方法:设计扩增全长HCVP7基因片段的特异引物,以H/FL质粒DNA(含HCV 1acDNA全长序列)为模板,通过PCR扩增全长HCVP7基因...     

日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的原核表达及鉴定

目的:原核表达并鉴定日本血吸虫P14基因(SjP14)。方法:提取日本血吸虫成虫总RNA,RT-PCR扩增SjP14基因,插入pGEM-T载体后酶切鉴定,再亚克隆至pET28a(+)原核表达载体并转化感受态细胞E.coli BL21,1mmol/L的IPTG诱导表达后,用纯化试剂盒纯化并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果:RT-PCR扩增后获得一特异性基因片段,测序及比对后确认为SjP14基因。用IPTG诱导含重组pET28a(+)-SjP14的E.coli BL21后,经SDS-PAGE分析表明其表达成功,分子量约为38 ku。Western blot鉴定结果表明纯化后的SjP14蛋白可被SjP14多克隆抗体识别。结论:成功表达并纯化了日本血吸虫P14基因产物,为下一步动物免疫保护性实验奠定了基础。     

P14ARF与肿瘤

INK4a/ARF基因编码有两个独立的蛋白,即p16INK4a和p14ARF.其中p14ARF对MDM2-p53通路具有关键性调控作用.在人类的很多肿瘤中发现p14ARF基因位点存在改变.随着国内外研究的增多,p14ARF成为肿瘤研究的热点,本文将对p14ARF的结构、抑癌机理及其功能失活机制作一综述.     

HIV-2对HIV-1感染可能有预防作用

发现HIV-1几年后,HIV-2已出现在其家族的阴影中。尽管这两种病毒最终均能削弱免疫系统功能,并引起AIDS,但HIV-1传播迅速,导致病人很快死亡。最近的一篇报道为研制AIDS疫苗带来一线希望。研究人员认为,由HIV-2感染触发的免疫反应能抵制以后更致命的HIV-1感染。研究人员对塞内加尔达克尔的妓女进行长达9年     

象牙海岸HIV-1与HIV-2感染的流行病学特征

HIV-1主要在非洲中部国家、HIV-2主要在非洲西部国家流行,其中象牙海岸是两种病毒均流行的少数国家。HIV-1抗体阳性率高于HIV-2,与各种因素无关。城市HIVs抗体阳性率高于农村。非洲感染HIV-1的男女抗体阳性率女性高于男性2～3倍,但象牙海岸男性抗体阳性率高于女性。在异性间性行为主要感染方式的地区也有女性抗体阳性率高于男性的倾向,但在HIV-1流行病学调查开始的数年内,该地区男性抗体阳性率呈高值,今后应注意其动向。妓女HIVs抗体阳性率较其他原因所致者高,可认为是由于性接触感染了HIVs,但推测HIV-1与HIV-2抗体阳性率之间的差别可     

HIV-1原发感染者病毒辅助受体特征分析

目的 观察HIV-1感染者在原发感染早期的不同阶段,体内病毒对CCR5和CXCR4辅助受体利用特点及演变情况.方法 以高危人群前瞻性队列研究的方式随访发现12例HIV-1原发感染者,分别收集感染最早期和病毒载量稳定期(病毒调定点)的血浆,提取病毒RNA,反转录(RT)-PCR,套式PCR扩增env gp160基因,连接到TA克隆载体,测序分析,以Geno2pheno、PSSMx4r5PSSMsinsi、SVM、Charge Rule 5种在线生物信息学工具预测病毒株CCB5和CXCR4辅助受体利用情况.结果 12例原发感染者感染早期病毒利用CCR5嗜性者有11例,利用CXCR4辅助受体1例;1例在随访10个月时检出辅助受体的转换;不同基因型预测方法的结果一致性88.3%.结论 HIV-1原发感染者早期病毒主要利用CCR5受体,也有利用CXCR4受体,原发感染者在感染1年内可能发生辅助受体的转换;以基因型预测CCB3或CXCR4辅助受体宜选用多种不同的分析方法.     

HIV-1原发感染者病毒辅助受体特征分析

目的 观察HIV-1感染者在原发感染早期的不同阶段,体内病毒对CCR5和CXCR4辅助受体利用特点及演变情况.方法 以高危人群前瞻性队列研究的方式随访发现12例HIV-1原发感染者,分别收集感染最早期和病毒载量稳定期(病毒调定点)的血浆,提取病毒RNA,反转录(RT)-PCR,套式PCR扩增env gp160基因,连接到TA克隆载体,测序分析,以Geno2pheno、PSSMx4r5PSSMsinsi、SVM、Charge Rule 5种在线生物信息学工具预测病毒株CCB5和CXCR4辅助受体利用情况.结果 12例原发感染者感染早期病毒利用CCR5嗜性者有11例,利用CXCR4辅助受体1例;1例在随访10个月时检出辅助受体的转换;不同基因型预测方法的结果一致性88.3%.结论 HIV-1原发感染者早期病毒主要利用CCR5受体,也有利用CXCR4受体,原发感染者在感染1年内可能发生辅助受体的转换;以基因型预测CCB3或CXCR4辅助受体宜选用多种不同的分析方法.     

hMSH2蛋白和P53蛋白表达在胃癌发病中的意义

[目的]探讨DNA错配修复基因hMSH2蛋白、抑癌基因P53蛋白表达在胃癌发病中的意义。[方法]采用免疫组织化学技术（S—P法）检测63例胃癌组织及32例胃炎组织hMSH2、P53的表达。[结果]胃癌组hMSH2蛋白阳性表达率（79．37％）明显高于胃炎组（53．13％）（P〈0．05）；胃癌组P53蛋白阳性表达率（88．89％）明显高于胃炎组（21．88％）（P〈0．05）。hMSH2蛋白在高中分化腺癌、低分化腺癌及黏液癌的阳性表达率分别为73．68％、82．76％和80．00％，P53蛋白阳性表达率分别为100．00％、89．66％和73．33％，两者阳性表达率与胃癌分化程度均无显著性差异（P〉0．05）。hMSH2蛋白和P53蛋白表达呈正相关。[结论]DNA错配修复基因hMSH2蛋白及抑癌基因P53蛋白的异常表达可能参与胃癌发生机制。     

C-erbB-2蛋白,P53蛋白在大肠癌中的表达及意义

目的：探讨C-erbB-2癌基因蛋白及P53蛋白在大肠癌组织中的表达，及其与淋巴结转移的关系。方法：采用常规免疫组化sP法检测69例大肠癌C-erbB-2癌基因蛋白、P53蛋白表达。结果：大肠癌69例中C-erbB-2、P53表达阳性率为50．7％、36．2％。C-erbB-2、P53在大肠癌中表达均与淋巴结转移呈正相关（P〈0．01）。大肠癌中P53表达还与Dukes分期相关。结论：C-erbB-2、P53联合检测可以作为判断大肠癌预后的重要指标。     

原发性肝细胞癌P53、P16和c-erbB-2蛋白表达意义

目的：研究P53、P16和c-erbB-2蛋白表达与原发性肝细胞癌发生物学行为的关系。方法：应用免疫组化链霉素抗生素蛋白－过氧化物酶连结法（LSAB）检测60例原发性肝细胞癌和癌旁肝组织P53、P16和c-erbB-2蛋白表达。结果：P53、P16和c-erbB-2在原发性肝细胞癌中的阳性率分别为41．6％、35％和58．33％，癌旁肝组织的阳性率分别为8．33％、88．33％和21．67％，差异有显著性（P＜0．01或P＜0．05）。P53和c-erbB-2与肝细胞癌的病理组织学分级具有一定程度的相关性，P16蛋白与病理组织学分级有显著差异（P＜0．05）。P16、c-erbB-2和P53均与转移有关。P53蛋白表达与c-erbB-2蛋白表达具有显著的协同性（P＜0．05），与P16蛋白表达呈负相关性（P＜．05）。结论：肿瘤的多因素分析比单因素分析更有价值，癌基因c-erbB-2和抑癌基因P53、P16蛋白的表达异常及协调作用在原发性肝癌的发生、发展中起重要作用。