反义RNA技术与肿瘤研究进展

反义RNA技术是一种选择性地封闭靶基因表达的基因治疗方法，近年来发展迅速，在肿瘤研究与治疗中取得了令人瞩目的成就。本文主要综述反义RNA技术在肿瘤研究与治疗方面的有关进展。     

反义RNA技术与肿瘤研究进展

反义RNA技术是一种选择性地封闭靶基因表达的基因治疗方法，近年来发展迅速，在肿瘤研究与治疗中取得了令人瞩目的成就。本文主要综述反义RNA技术在肿瘤研究与治疗方面的有关进展。     

mrp反义RNA逆转胃癌细胞系SGC7901对VCR的耐受性

目的：探讨以多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）作为靶分子进行胃癌多药耐药基因治疗的可行性。方法：采用已构建成功的ｍｒｐ反义ＲＮＡ真核载体ｐｃＤＮＡ－Ａｍｒｐ转染胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１,用Ｇ４１８抗性筛选出稳定细胞克隆,命名为Ｍ－ＳＧＣ７９０１;用＾３２Ｐ标记的寡核苷酸探针打点杂交检测Ｍ－ＳＧＣ７９０１细胞中ｍｒｐ ｍＲＮＡ表达的变化;从细胞生长曲线中,观察Ｍ－ＳＧＣ７９０１细胞生长速度的变化;经０．００     

增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的构建及对人胃癌细胞的抑瘤效应

目的观察增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因反义ＲＮＡ表达质粒对人胃癌细胞生长特性的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法用ＤＮＡ重组方法将人ＰＣＮＡ基因反向克隆到真核表达质粒ｐＤＯＲｎｅｏ中，构建成人ＰＣＮＡ基因真核表达质粒ｐＤＲＰＣＮＡ，用脂质体介导转染人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１。结果经Ｇ４１８筛选获得转染细胞ＳＧＣ／ＰＣＮＡ，与亲本细胞相比，其生长速度减慢，ＲＮＡ、蛋白质的生物合成受到抑制，Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期ＤＮＡ含量降低。结论ＰＣＮＡ基因反义ＲＮＡ对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用。     

反义端粒酶RNA对人胃癌细胞端粒长度及端粒酶活性调控的研究

 目的　探讨反义端粒酶RNA(hTR)对人胃癌细胞 端粒长度(TRF)及端粒酶活性的调控作 用。方法　应用反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901 ,通过分子杂交及端粒重复扩增PCR方法检测hTR表达及端粒、端粒酶活性变化。结 果　经HYR筛选,转染细胞形成稳定克隆,反义hTR表达增强、正义hTR表达下调,平 均TRF缩短、端粒酶活性受抑。结论　反义hTR对胃癌细胞TRF及端粒酶活性 的调控可能是通过其对hTR模板的“封闭”而发挥作用的,反义hTR可以作为胃癌基因治疗的 一种新靶点。     

突变p53基因的反义拯救研究

目的研究p53基因的个体性反义RNA联合野生型p53（wt-p53）对乳腺癌细胞的增殖抑制作用，探讨体外双重基因治疗的意义。方法将wt-p53重组质粒pC53-SN3转染人乳腺癌MDA—MB-231细胞，G418筛选稳定表达wt—p53的细胞克隆（WTp53—231细胞）；体外构建针对MDA—MB-231细胞p53基因突变外显子8（exon8）的反义表达载体[pGEM3zf（＋／-）p53exon8]，并制备其反义RNA（ASp53exon8＇RNA）；以MDA—MB-231细胞为对照，阳离子脂质体介导下ASp53exon8’RNA转染wTp53—231细胞；转染48h后，用MTT法检测细胞生长活性，TUNEL法检测细胞凋亡情况，免疫细胞化学LSAB染色法检测p53蛋白的表达。结果ASp53exon8’RNA转染wTp53—231细胞与ASp53exon8’RNA转染MDA—MB-231细胞比较，前者可进一步抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡。结论p53基因的个体性反义RNA联合wt—p53共转染可协同抑制乳腺癌细胞增殖，达到“反义拯救”基因治疗目的。     

P53反义RNA抑制肝细胞癌生长的研究

目的;针对突变型P53基因的致癌性,采用反义RNA技术以阻断肝细胞内源突变型P53的表达,研究对肝癌细胞生长的影响,为肝癌基因治疗提供可行的理论基础。方法;采用定向克隆将人野生型P53基因cDNA反向插入到哺乳动物表达载体P^CR3.1的EcorRⅠ和XbaⅠ位点,构建了反义P^CR3.1-P^53(AS)表达载体。用免疫组化法鉴定Bel-7402肝细胞株为内源P53突变株,用脂质体转染法将PCR3．1－P53（AS）、PCR3．1空载体导入Be17402细胞中,同时设Bel17402细胞对照组。用MTT法测定细胞的生长、用FCM测定细胞周期的变化。结果：转入PCR3．1－P53（AS）Bel7402细胞生长明显受到抑制,而转入PCR3．1的Bel7402细胞生长与对照组Bel7402细胞之间差异不大;FCM结构也表明转入PCR3.1-P53(AS)的细胞的生长明显被阻滞于G0／G1期,而其他两组之间则相差不大,表明可能P53反义RNA对肝癌细胞突变型P53表达的阻断,肝癌细胞显示出正常方向逆转迹象。结论：本研究结果表明,肝细胞癌内源突变型P53的表达被反义RNA抑制后,细胞增殖速度显著下降,FCM的结果也证明细胞部分受阻于G0／G1期,显示了向正常方向逆转的迹象。此研究结果即为肝癌发生提供理论基础,也为肝癌基因治疗提供新思路。     

端粒酶RNA的反义寡核苷酸抑制裸鼠移植瘤生长的研究

背景与目的许多研究已证明:端粒酶的激活在肺癌的发生、发展中具有重要作用,因而成为肺癌基因治疗的重要靶点之一。本研究旨在探讨针对人端粒酶RNA成分的反义寡核苷酸对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法应用人肺腺癌细胞株A549细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,18只荷瘤裸鼠随机分为反义寡核苷酸组(Antisense Oligodeoxynucleotide Group,Group ASODN)、正义寡核苷酸组(Sense Oligodeoxynucleotide Group,Group SODN)和生理盐水对照组(Normal Saline Group,Group NS),每组6只,瘤体内分别注射反义寡核苷酸/阳离子脂质体复合物、正义寡核苷酸/阳离子脂质体复合物和生理盐水,均为每日1次,共14次,观察移植瘤的生长情况。结果反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组的体积抑瘤率分别是43.94%、6.91%,统计学检验有非常显著性差异(t=6.17,P<0.001)。治疗过程中裸鼠对药物耐受良好,无恶心、呕吐等消化道症状,未见皮下出血,治疗结束时各组裸鼠的体重较治疗开始时略有增加。结论瘤体内注射脂质体包封的端粒酶RNA的反义寡核苷酸能够明显抑制裸鼠体内移植瘤的生长。     

p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

目的 研究外源p53反义RNA对有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法 构建p53反义RNA真核细胞表达载体PEGFP－p53（AS),经酶切图证明反向联结质粒。Lipofectin介导转染有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系801D，经G418筛选获耐受克隆。稀释法建立单细胞克隆系，应用PCR检测外源基因，荧光显微镜检测细胞绿色荧光蛋白表达，p53单抗免疫组化染色检测p53突变蛋白表达，体外集落形成实验检测细胞生长，流式细胞仪检测细胞周期，MTT法检测细胞对顺铂药物敏感性。结果 酶切图证明了p53-cDNA反向联结于质粒，构建了PEGFP－p53(AS),并建立了转染单细胞克隆系PEGFP－p53(AS)-801D及空载细胞系PEGFP－801D。PCR检测外源p53基因和neo基因存在于转染细胞系，而荧光显微镜下发现其胞浆有绿荧光蛋白表达。免疫组化染色p53突变蛋白在801D细胞系为阳性，而PEGFP－p53(AS)-801D为阴性，证明外源反义p53在转染细胞稳定表达并封闭内源突变蛋白表达。与母系相比，PEGFP－p53(AS)-801D集落形成抑制率为61％（P＜0．01），流式细胞检测该细胞系G1期细胞数明显增中，出现G1期阻滞的表现。MTT检测PEGFP－p53(AS）－801D对顺铂比母系更为敏感。结论 有p53基因248密码点突变的801D细胞恶性增殖明显，对顺铂耐药，外源p53反义RNA可封闭突变蛋白表达，抑制细胞体外恶性增殖，增加对顺铂的药物敏感性。转染p53反义RNA可抑制p53突变的恶性表型或恢复野生型p53基因功能。     

RNAi在胃癌基因治疗中的研究

RNA干扰(RNAi)又称转录后基因沉默,是由外源或内源性的双链RNA(dsRNA)导入细胞而引起同源的mRNA降解,进而抑制其相应的基因表达。作为一项新技术,目前广泛地应用于生物体基因功能研究和多种肿瘤的研究。在胃癌方面,现针对胃癌相关基因治疗进行了积极的探索,并取得了一些突破性的进展。     

VEGF反义RNA对人食管癌细胞抑制作用的研究

目的: 研究血管内皮生长因子(VEGF)反义RNA对人食管癌细胞的抑制作用,探讨以VEGF反义RNA进行食管癌基因治疗的可行性.方法: 采用脂质体法将反义VEGFcDNA质粒转染入食管癌细胞TE-1;用MTT法检测细胞增殖情况;用免疫组化法检测VEGF蛋白表达;原位杂交和RT-PCR技术检测VEGFmRNA的表达.流式细胞术检测细胞的凋亡率和周期分布.结果: 被反义VEGFcDNA质粒转染的食管癌细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达,该细胞的VEGFmRNA及蛋白表达水平降低,但细胞生长速率无明显改变,未发生明显凋亡现象;接种裸鼠后,形成肿瘤的时间明显延长,肿瘤的体积和重量明显减小.结论: VEGF反义RNA可抑制食管癌细胞VEGF表达和裸鼠体内的肿瘤生长.该表达体系为食管癌基因治疗的进一步研究奠定了基础.     

长链非编码RNA HOTAIR 在胃癌中的表达及意义

目的:探讨长链非编码RNA HOX 转录反义RNA（HOTAIR）在胃癌组织及胃癌细胞株中的表达及与临床病理关系,并进一步研究其对胃癌细胞增殖的影响。方法:收集2010 年1月至 2012 年 1月我院40例胃癌手术切除标本（包括癌组织及对应的正常胃上皮组织）,qRT-PCR检测40例胃癌中HOTAIR的表达,并分析其与临床病理关系。qRT-PCR检测胃癌细胞株和正常胃上皮细胞株中的HOTAIR的表达差异,利用siRNA抑制HOTAIR表达后,分别用MTT法和流式细胞仪（FCM）检测对细胞增殖和凋亡的影响。结果:胃癌组织中的HOTAIR的表达水平（6.32±2.56）显著高于正常胃上皮组织（4.61±1.81）（P=0.001）。同时,HOTAIR在人胃癌细胞株MKN28、SGC7901、BGC823中的表达水平明显高于正常胃上皮细胞GES-1（P＜0.05）。胃癌肿瘤组织中HOTAIR的表达水平与肿瘤的大小和临床分期显著相关（P＜0.05）。利用siRNA干扰HOTAIR的表达后,SGC7901细胞增殖明显降低,凋亡增加（P＜0.01）。结论:HOTAIR在胃癌中显著高表达,并可促进胃癌细胞增殖,可能成为胃癌的诊断和治疗提供新的分子标记物。     

长链非编码RNA DLGAP1-AS2在胃癌中的表达及作用研究

目的 探讨长链非编码RNA DLGAP1反义RNA 2(DLGAP1-AS2)在胃癌中的表达及其作用。方法 收集淮安市淮安医院2019年1月至2022年8月40例行胃癌根治术患者的癌组织和癌旁组织,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测DLGAP1-AS2在所收集胃癌组织和胃癌细胞中的表达水平。采用慢病毒敲低DLGAP1-AS2在胃癌细胞MKN45和BGC-823中的表达后,利用CCK-8、Transwell小室和细胞划痕实验评估胃癌细胞的增殖和侵袭迁移能力。通过裸鼠成瘤实验再次验证DLGAP1-AS2与胃癌细胞MKN45成瘤能力的关系。结果 与癌旁组织相比,胃癌组织的DLGAP1-AS2表达水平明显增加,且其水平与胃癌患者的淋巴结转移和远处转移有关。在细胞水平,qPCR提示DLGAP1-AS2在胃癌细胞中表达明显升高,其中在MKN45细胞表达最高。CCK-8、Transwell、细胞划痕实验提示敲低DLGAP1-AS2可明显抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。此外,裸鼠成瘤实验说明敲低DLGAP1-AS2可以抵抗胃癌细胞的裸鼠成瘤能力。结论 DLGAP1-AS2在胃癌组织和细胞中的表...     

RNAi在胃癌基因治疗中的研究

RNA干扰（RNAi）又称转录后基因沉默,是由外源或内源性的双链RNA（dsRNA）导入细胞而引起同源的mRNA降解,进而抑制其相应的基因表达。作为一项新技术,目前广泛地应用于生物体基因功能研究和多种肿瘤的研究。在胃癌方面,现针对胃癌相关基因治疗进行了积极的探索,并取得了一些突破性的进展。     

反义端粒酶RNA基因对肝癌细胞的抑制作用

目的：研究逆转录病毒载体介导的反义端粒酶RNA基因对肝癌细胞的抑制作用，探讨通过抑制端粒酶活性治疗肝细胞癌的有效途径。方法：采用电穿孔法将携带正反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒载体导入PT67包装细胞，G418筛选获得稳定产病毒细胞株，收集逆转录病毒上清并感染人肝癌HepG2细胞，G418筛选获得稳定转染细胞克隆并扩增培养，经PCR鉴定后，通过MTT法分别检测转染正反义端粒酶RNA基因组肝癌细胞（HepG2-hTR—EcoRⅠ和HepG2-hTR—BamHⅠ）以及未转染端粒酶RNA基因组细胞（HepG2）的生长，免疫荧光化学检测肝癌细胞增殖，TRAP—PCR—ELⅠSA法检测细胞的端粒酶活性，流式细胞术检测各组细胞所处的细胞周期及凋亡率。结果：基因转染后经PCR扩增可于约500bp处检测到目的基因的表达。转染反义端粒酶RNA基因的HepG2一hTR—BamHⅠ组细胞生长受到明显抑制；抗中性粒细胞核增殖抗原（PCNA）表达减少；实验组端粒酶活性为（2．31±0．16），较HepG2-hTR—EcoRⅠ组（3．24±0．20）及HepG2组细胞（3．22±0．17）明显下降（P〈0．01）；流式细胞术检测显示实验组细胞的凋亡率为（9．58±1．38）％，与对照组相比差别具有显著性（P〈0．01）；实验组细胞出现G2／M期阻滞。结论：端粒酶RNA是端粒酶活性表达的一个重要组成部分，通过反义技术下调其表达能够抑制肝癌细胞生长增殖，并诱导其凋亡。     

ets-1基因的反义寡核苷酸治疗胃癌的研究

目的：研究ets1反义寡核苷酸对胃癌的治疗作用及其机制。方法：应用ets1反义、正义寡核苷酸转染SGC7901细胞，并设PBS对照组。转染后应用逆转录聚合酶链式反应检测ets1mRNA的变化，克隆形成试验检测细胞增殖活性的变化，Transwell小室检测癌细胞体外侵袭力的变化，并应用裸鼠胃癌皮下转移模型观察对体内侵袭力的影响。结果：转染ets1反义寡核苷酸后，ets1mRNA表达降低，形成克隆数目较正义组、对照组明显减少（24.2±4.8 vs 47.6±8.1 vs 44.3±7.6，P<0.01），穿过小室滤膜细胞数目明显减少（97.1±11.1 vs 198.7±18.3，205.8±22.2，P<0.01），裸鼠胃癌生长明显受到抑制。结论： ets1反义寡核苷酸对胃癌有治疗作用，其机制可能与降低胃癌细胞体内外侵袭力有关。     

鸟氨酸脱羧酶和S-甲硫氨酸脱羧酶双反义RNA腺病毒抑制食管癌细胞的增殖和侵袭

目的:探讨鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC) 和 S-甲硫氨酸脱羧酶(s-adenosylmethionine decarboxylase,AdoMetDC)的双反义RNA腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCas)对食管癌Eca109细胞增殖和侵袭的抑制作用.方法:重组腺病毒载体Ad-ODC-AdoMetDCas感染食管癌Eca109细胞,应用Western blotting和HPLC分别检测双反义RNA腺病毒对食管癌细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺合成的抑制作用.采用活细胞计数法观察其对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响,采用Matrigel侵袭实验检测重组腺病毒载体感染对食管癌Eca109细胞侵袭活性的影响.同时应用裸鼠皮下移植瘤模型观察Ad-ODC-AdoMetDCas对移植食管癌生长增殖的抑制作用.结果:Western bloting证实Ad-ODC-AdoMetDCas可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白的表达,HPLC结果显示食管癌Eca109细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后细胞内腐胺、精胺、精脒等3种多胺含量都明显降低(P<0.01).活细胞计数法表明Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖有明显抑制作用(P<0.01),Matrigel侵袭实验结果显示Ad-ODC-AdoMetDCas可显著降低食管癌Eca109细胞的体外侵袭能力(P<0.01).体内实验显示,双反义RNA腺病毒载体对已形成的裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01).结论:ODC和AdoMetDC双反义RNA重组腺病毒能显著抑制食管癌细胞的增殖和侵袭,具有食管癌基因治疗临床应用的潜在价值.     

反义端粒酶基因表达对肝癌细胞生长抑制的研究

目的：观察端粒酶基因hTRT反义表达对癌细胞生物学行为的影响,探讨人端粒酶逆转录酶反义基因治疗对肝癌细胞恶性表型的逆转作用.方法：含620bp端粒酶反义hTRT基因的PBSTRT质粒用Sal Ⅰ、BamH Ⅰ酶切后,插入真核表达载体pCDNA3 BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点,构建成含反义hTRT基因的真核表达重组子.反义hTRT基因转染肝癌细胞株HepG1-6,观察其对肿瘤细胞生长的影响.结果：成功构建hTRT反义真核表达载体,并导入肝癌细胞株HepG1-6中,获表达hTRT反义基因的细胞系（HepG1-6/pCDNA3-反义hTRT）,该细胞系出现显著生长抑制现象,端粒酶活性明显下降,G0/G1期细胞增加,S和G2M期细胞减少,而HepG1-6/pCDNA3细胞则无明显变化.结论：反义hTRT基因治疗可以明显抑制HepG1-6细胞的增殖,部分细胞受阻于G1期,提示hTRT基因可以作为治疗肿瘤的靶基因.     

VEGF反义RNA 抑制裸鼠体内食管癌细胞生长的实验研究

 目的 探讨VEGF反义RNA对食管癌细胞在裸鼠体内生长的影响。方法 观察转染VEGF反义RNA的食管癌细胞TE-1在裸鼠体内成瘤性；应用免疫组化法、RT—PCR法检测移植瘤组织中VEGF蛋白及mRNA表达和MVD；用流式细胞仪和透射电镜检测细胞凋亡情况。结果 转染VEGF反义RNA的TE-1细胞在裸鼠体内肿瘤形成的潜伏期明显延长，所形成肿瘤的重量和体积小于对照组及空载体组。肿瘤组织中VEGF蛋白和mRNA的表达降低，MVD降低；肿瘤细胞发生明显的凋亡形态学改变；G0／G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少，细胞增殖能力降低。结论 VEGF反义RNA能抑制裸鼠体内TE-1细胞的生长，减少肿瘤内血管的生成，增加细胞凋亡；为食管癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

RNA干扰技术在胃癌治疗中的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)主要通过导入双链RNA(double strands RNA,dsRNA)进而靶向抑制转录后基因的沉默,小分子干扰RNA(short interfering RNA,siRNA),是RNA干涉的调控的关键.由于RNAi对基因沉默的高效、特异性,在胃癌治疗中,可明显影响胃癌细胞的生物学特性,故这一技术目前已被广泛应用于与胃癌发生相关的基因、蛋白、通路和酶等研究,为胃癌的治疗提供了一种新的途径.