冻存对经血源性间充质干细胞表面标记的影响

目的：比较冻存前后经血源间充质干细胞（ MMCs）3种表面标志表达的变化,分析冻存条件对其表达的影响。方法淋巴细胞分离液法分析经血中单个核细胞,经过体外原代和传代培养,筛选具有增殖能力的细胞。观察细胞形态,流式细胞术分析冻存前后分析表面标志（ CD105、CD14和CD45）变化。结果经血单个核细胞传代3次后可获得具有间充质干细胞形态特点MMCs;MMCs高表达CD105分子,低表达CD14和CD45;冻存不影响MMCs表型。结论自经血中可获得MMCs,冻存对MMCs表型CD105high、CD14low、CD45low无影响。     

低氧增强骨髓间充质干细胞增殖维持分化潜能

目的观察低氧增强人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外增殖并维持其多向分化潜能的作用。方法分离10例骨髓血标本BMMSCs,分别进行低氧(低氧组)及常氧(常氧组)培养,观察BMMSCs的形态、增殖能力及成骨、成脂分化能力。结果低氧组BMMSCs保持其长梭形,鱼群样分布,增长状态良好,常氧组BMMSCs形态呈多角形或扁平状,低氧组BMMSCs数量及生长速率较常氧组增加(P0.05),且低氧组BMMSCs具有成骨、成脂分化能力。结论低氧能促进BMMSCs的体外增殖且维持其多向分化潜能。     

经血源性和羊水源性间充质干细胞基本生物学特性的比较

目的 比较经血源性与羊水源性的间充质干细胞(MSCs)在相同培养条件下的基本生物学特性,旨在为临床提供一种新的干细胞来源.方法 用Ficoll密度梯度离心法分离经血源性MSCs,采用离心贴壁培养的方法 分离羊水中的MSCs.对两种来源细胞的形态及培养特性进行观察,并利用细胞化学染色的方法 对两者的生物化学特性进行鉴定.结果 从经血及羊水中均可成功分离培养出具有典型样特征的MSCs:纤维样或梭形、紧密漩涡状的细胞,并证实可稳定传代.在同等培养条件下,相同代数经血源性MSCs克隆形态相似性更高.经血源性MSCs原代培养24 h左右可见贴壁细胞,而羊水源性MSCs为48 h左右;经血源性MSCs与羊水源性MSCs原代达80%~90%融合度时间均为10 d左右;经血源性MSCs细胞倍增时间约为7 d,羊水源性MSCs约为10 d.细胞化学染色:ACP染色均为强阳性、AS-DCE、ANAE、NAP、PAS、POX、SBB均为阴性,细胞内化学成分及定位大致相同.结论 与羊水源性MSCs相比,经血源性MSCs取材方便,易分离纯化,无伦理学争议,成为MSCs又一可靠的来源     

孤啡肽对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的 观察孤啡肽(OFQ)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)增殖的影响.方法 Percoll法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传2代后分别在含有浓度为0、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8和10-7 mol/L的OFQ培养基中继续培养,MTT法测定细胞活性.结果 当OFQ浓度小于10-11 mol/L时,OD值随着浓度的增大而增大,而当OFQ浓度大于10-11mol/L时,OD值随着浓度的增大而减小.结论 适当浓度的孤啡肽可促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖.     

过氧化氢对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响

目的观察过氧化氢(H2O2)对骨髓间充质干细胞的增殖活性的影响。方法使用密度梯度法分离大鼠骨髓间充质干细胞进行培养,以CD44鉴定后以不同浓度H2O2作用于MSC,建立MSC氧化损伤模型,通过MTT法检测MSC细胞损伤程度。结果在0.02%,0.04%,0.06%,0.1%,0.12%,0.17%,0.21%(V/V)浓度H2O2作用1h对MSC活性无影响,与对照组比较,差异无显著性(P>0.05);0.1%～0.21%浓度H2O2分别作用3,6和12h引起MSC增殖活性降低,呈量效依赖关系。结论0.1%～0.21%浓度H2O2作用3h后对MSC增殖起抑制作用,最佳H2O2作用浓度为0.12%和3h作用时间。     

大鼠脂肪源性干细胞和骨髓间充质干细胞增殖速度的差异性研究

目的比较大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖速度,探讨ADSCs替代BMSCs的可行性。方法从成年雄性SD大鼠取脂肪组织和骨髓分别提取ADSCs和BMSCs,利用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测细胞增殖速度。结果第二代ADSCs和BMSCs细胞接种时光密度(OD)平均值分别为0.028和0.030,两者OD值进行比较差异无统计学意义(t=0.88,P>0.05),于接种后的第1、2、3、4日ADSCs的OD值都显著高于BMSCs(P<0.05)。结论大鼠ADSCs增殖速度显著高于BMSCs。     

不同浓度万古霉素对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的 观察不同浓度万古霉素对兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖、成骨分化的影响.方法 将兔MSCs置于含不同浓度的万古霉素,以及添加了成骨诱导剂的培养液中培养,采用MTT法观察万古霉素对MSCs增殖的影响,不同时相点测定ALP值,钙结节染色观察万古霉素对MSCs的成骨影响.结果 MSCs可在不同浓度万古霉素溶液中生长,当万古霉素浓度≤700μg/ml时,万古霉素对MSCs的增殖无影响,当浓度≥1000μg/ml时,才对MSCs的增殖有一定影响.万古霉素浓度≤1000μg/ml时,实验组与对照组在不同时相点ALP无明显差异.同时钙结节茜素红染色阳性.结论 万古霉素对MSCs增殖、成骨分化影响较小,是预防和治疗骨科临床感染的较好选择.     

生殖细胞核因子在骨髓间充质干细胞增殖分化中的表达

目的:研究生殖细胞核因子在骨髓间充质干细胞增殖与分化中的表达.方法:取4～6周BALB/c小鼠,采用全骨髓贴壁筛选法体外培养小鼠BMSCs.取第3代小鼠BMSCs,定向诱导BMSCs向成骨细胞分化,通过检测碱性磷酸酶鉴定诱导后的细胞.采用RT-PCR及间接免疫荧光染色,从mRNA和蛋白水平检测GCNF在小鼠BMSCs诱导分化前后的表达.结果:RT-PCR与间接免疫荧光染色结果同时显示,第3代的小鼠BMSCs和向成骨方向诱导10d后的BMSCs均有GCNF表达.结论:GCNF在BMSCs增殖分化中有表达.     

恒磁场对成人骨髓间充质干细胞增殖及细胞周期的影响

目的：观察不同强度恒磁场辐射对成人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemce Hs，MSC)增殖水平及细胞周期的影响。方法：用密度梯度离心法分离成人MSC，再经贴壁筛选法筛选，对生长良好的第3代成人MSC进行恒磁场辐射(强度分别为0．05、0．10、0．50和1．00mT)，连续刺激5天(每天8h)后，用单四唑(MTT)法、流式细胞仪法测定细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡情况。结果：0．05mT组细胞增殖显著高于对照组；0．10mT组细胞增殖与对照组相比无明显差异；其余剂量组细胞增殖均显著低于对照组。各组均未发现DNA倍体异常细胞。结论：恒磁场对成人MSC增殖的影响与磁感应强度有关，0．05mT的磁场促进MSC的增殖，0．10mT的磁场对MSC无明显影响，0．50mT和1．00mT的磁场抑制MSC的增殖。     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用，为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法体外培养MSCs至第5代后，分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs，诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数，对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较；诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态；BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长；BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰，而β-ME在诱导2h即达高峰，但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性；RT-PCR显示NSE、NFL，MAP-2的mRNA表达阳性，GFAP有较弱的表达；蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞．而且分化后细胞的存活时间长．有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的:探讨脉冲电磁场(PEMFs)对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)的影响.方法:用全骨髓贴壁法分离rMSCs,对其进行1 Hz和15 Hz的PEMFs刺激,MTT法测定细胞增殖水平,检测碱性磷酸酶活性,进行四环素荧光染色和钙结节染色.结果:rMSCs经PEMFs刺激后,各实验组细胞增殖水平均有不同程度提高,差异具有统计学意义(P＜0.05),其中1 Hz,0.4 mT组改变最为明显(3 d,0.323±0.051;5 d,0.714±0.058),对照组(3 d,0.246±0.044;5 d,0.487±0.064),差异具有统计学意义(P＜0.01);碱性磷酸酶检测实验组水平升高(5 d,0.348±0.032;15 d,2.339±0.034),对照组(5 d,0.205±0.026;15 d,0.533±0.013),差异具有统计学意义(P＜0.05),四环素荧光染色和钙结节染色结果均呈阳性.结论:rMSCs经PEMFs刺激后,能促进体外培养rMSCs的增殖水平及成骨分化,磁场参数对实验结果有影响.     

神经干细胞增殖分化的影响因素

神经干细胞（neural stem cells,NSCs）是具有高度自我更新能力并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经前体细胞。它能增殖成恰当数量的细胞,在脑部各个区域按正确顺序排列组合,分化为神经元,星形胶质细胞、少突胶质细胞,这是发育过程中必不可少的过程。     

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

OBJECTIVE: To induce the differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into myogenic cells in vitro, and to investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene in AdTrackCMV-hVEGF165- transfected MSCs. METHODS: Twenty rabbits were divided equally into control group and experimental group, and MSCs were isolated and purified from their bone marrow by Percoll (1.073 g/ml) followed by cell culture in low-glucose DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. 5-azacytidine (5-Aza) was added into the cell culture of the experimental group on the third day. The expression of troponin I in MSCs was assayed by immunohistochemistry on the 28th day. AdTrackCMV- hVEGF165 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into the MSCs, and subsequent VEGF expression was detected by Northern blotting and Western blotting while enzyme-linked immunosorbent assay (ILISA) was employed to examine the VEGF concentration in the supernatant of the culture medium. RESULTS: Following successful isolation and culture of the MSCs from rabbit bone marrow, 5-Aza-induced differentiation of the cells into myogenic cells was demonstrated by their positive staining for cardiac troponin I (cTnI). Northern blotting showed that the expression of VEGF 165 mRNA was much higher in the VEGF165 gene-transfected cells than in the control cells. Western blotting showed VEGF expression in the transfected cells. The concentration of VEGF in the supernatant mounted to the peak level 3-5 d after VEGF165 gene transfection (1,011-1,027 pg/ml) and decreased gradually thereafter, but still maintaining higher levels than those in the control group and pAdTrackCMV group (349 pg/ml vs 116 pg/ml and 125pg/ml, respectively, P<0.01). CONCLUSION: MSCs can be induced to differentiate into myogenic cells in vitro and express VEGF after VEGF gene transfection, and this success may provided a basis for combining MSC transplantation with gene therapy for regeneration of the damaged myocardial cells.     

骨髓间充质干细胞的多向分化性及其应用

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs是从骨髓分离出的一种非造血前体细胞，这些细胞除了具有支持造血的功能之外，还可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞和神经细胞等。由于MSCs具有多向分化的潜能，因而利用它进行再生医学研究及应用具有以下优势：①来源广泛，取     

脑源性神经生长因子促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的 探索脑源性神经生长因子（BDNF）在诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞过程中的作用。方法 应用Ficoll分离骨髓中单核细胞,贴壁培养细胞,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含β-巯基乙醇（BME）、BDNF及碱性成纤维细胞因子（bFGF）的条件培养基使培养的细胞向神经细胞诱导分化;采用免疫荧光染色法对分化的细胞进行鉴定。结果 分离培养的贴壁细胞具有典型的BMSCs的形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星型胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶（NSE）、和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。结论 BMSCs在体外具有分化为神经元样细胞的能力,BDNF具有促进分化的作用。     

GnRH激动剂和经血源性干细胞联合治疗对小鼠卵巢功能的影响

目的 探究促性腺激素释放激素（GnRH）激动剂和经血源性干细胞（MenSCs）联合治疗对小鼠卵巢功能的影响。方法 将45只SPF级实验小鼠随机分为Control组（腹腔注射生理盐水）、POF组（腹腔注射120 mg·kg-1·d-1 CTX）、MenSC+POF组（CTX损伤处理后注射移植含2×106 MenSCs的细胞悬浮液）、GnRHa+POF组（造模前14 d注射丙氨瑞林0.1 mg·kg-1·d-1,第15天开始CTX注射）、MenSC+POF+GnRHa组（按MenSC+CTX组和GnRHa+CTX组方案联合用药）,每组9只。HE染色观察小鼠卵巢组织病理变化情况,ELISA法检测小鼠血清中黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、抗苗勒管激素（AMH）和雌二醇（E2）的含量水平,Western blot检测小鼠卵巢颗粒细胞中KI-67、Bcl-2、BAX、caspase 9、caspase 3、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、p-PI3K、PI3K、p-Akt及Akt蛋白的表达情况。结果 与Control组相比,POF组小鼠卵巢纤维化明显,闭锁卵泡数增多,血清中LH和FSH的含量水平极升高（P<0.01）,AMH和E2含量水平降低（P<0.01）,BAX、cleaved-caspase 9/caspase 9、cleaved-caspase 3/caspase 3蛋白表达水平升高（P<0.01）,KI-67、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白的表达水平降低（P<0.01）;与POF组比较,GnRH激动剂和经血源性干细胞联合治疗可抑制小鼠卵巢闭锁卵泡的产生,降低小鼠血清中LH和FSH的含量水平（P<0.01）,提高AMH和 E2的含量水平（P<0.05或P<0.01）,抑制小鼠卵巢颗粒细胞中BAX、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3蛋白的表达（P<0.05或 P<0.01）,促进KI-67、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）。结论 GnRH激动剂和经血源性干细胞联合治疗可能通过上调PI3K-Akt信号通路表达,减少卵巢闭锁卵泡的产生,提高小鼠卵巢的储备功能,从而达到对卵巢修复和保护的目的。     

非甾体类消炎药双氯芬酸抑制间充质干细胞向肌腱细胞增殖分化的研究

目的 探讨NSAIDs对间充质干细胞向肌腱细胞增殖分化过程的影响。方法体外建立鼠间充质干细胞系C3H10T1/2的肌腱细胞分化模型;CCK-8比色法分别检测双氯芬酸(diclofenac,DF)对间充质干细胞增殖的影响;用生长分化因子-7(growth differentiation factor,GDF-7)诱导鼠间充质干细胞系C3H10T1/2分化为肌腱细胞;PCR检测间充质干细胞分化过程中肌腱细胞相关基因(腱调蛋白、胶原蛋白)的表达。PCR分别检测DF对间充质干细胞分化过程中相关基因[腱调蛋白、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2)]表达的影响。结果成功建立鼠间充质干细胞系C3H10T1/2的肌腱细胞分化模型;DF高浓度时明显抑制间充质干细胞增殖(24 h:t=2.357,3.524,P0.05。72h:t=3.217,3.592,P0.05);GDF-7成功诱导鼠间充质干细胞系C3H10T1/2分化为肌腱细胞,肌腱细胞相关基因表达明显增加(腱调蛋白:t=124.107,P0.05;Ⅰ型胶原蛋白α_1:t=38.107,P0.05);DF对间充质干细胞分化过程中抑制了肌腱基因的表达(DF:腱调蛋白:t=31.758,P0.05),增强了脂肪相关基因的表达[(DF:脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2):t=97.735,P0.05)]。结论高浓度时DF抑制间充质干细胞增殖,改变间充质干细胞分化方向,不利于肌腱细胞再生修复。     

人脂肪源性间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的:分离培养并鉴定人脂肪源性间充质干细胞(hAD-MSC).方法:采用贴壁法从人脂肪组织分离获得hAD-MSC,并从表面分子表达和定向分化两个方面进行鉴定.结果:成功从脂肪组织中分离获得间充质干细胞,该群细胞贴壁生长,形态类似成纤维细胞样;具有较强的体外增殖能力和自我更新能力;一致性好,纯度高,99％的细胞阳性表达CD105、CD90、CD13、CD44分子;CD117、CD34、CD45和HLA-DR阴性表达,阳性率低于2％;可向脂肪和成骨细胞定向分化.结论:分离所得细胞符合间充质干细胞基本特点,可确定为hAD-MSC.     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用,为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法 体外培养MSCs至第5代后,分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs,诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数,对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较;诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果 两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态;BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长;BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰,而β-ME在诱导2h即达高峰,但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性;RT-PCR显示NSE、NFL,MAP-2的mRNA表达阳性,GFAP有较弱的表达;蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论 BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞,而且分化后细胞的存活时间长,有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。