粘质沙雷菌中SHV型β-内酰胺酶编码基因的克隆及序列分析

目的研究重庆地区临床分离的粘质沙雷菌E121编码超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的基因。方法PCR扩增ESBLs编码基因片段，克隆入pUCm—T载体，双脱氧链终止法测定核苷酸序列并确定亚型，等电聚焦测定β-内酰胺酶的等电点（pI）。结果PCR扩增结果显示粘质沙雷菌E121产生的ESBLs为SHV型，其基因片段含756个核苷酸，GenBank查询其核苷酸序列与SHV-28型ESBLs完全相同。该耐药株至少含有等电点pI约为5．4和8．2的两种β-内酰胺酶。结论重庆地区粘质沙雷菌E121所产ESBLs亚型为SHV-28。     

肺炎克雷伯氏菌SHV-28编码基因的克隆、测序及基因定位

以临床分离的一株肺炎克雷伯氏菌99-799株为研究对象，对其所产生的一种β-内酰胺酶编码基因的序列、亚型及基因定位进行研究。采用聚合酶链反应(PCR)，用β-内酰胺酶通用引物、blasHv引物扩增获得β-内酰胺酶及SHV型酶编码基因的片段，将SHV型酶PCR扩增产物克隆入pUCm—T载体，以双脱氧链终止法测定核苷酸序列，再通过GeneBank进行同源性检测确定其亚型和基因所在位置。肺炎克雷伯氏菌99—799株所含的一种β-内酰胺酶基因型为SHV型，与SHV-28编码基因序列完全相同，且位于细菌150bp的大质粒上，说明重庆地区有SHV-28亚型的存在。     

临床分离鲍曼不动杆菌产β-内酰胺酶的研究

目的:了解临床分离鲍曼不动杆菌多重耐药株产β-内酰胺酶的情况。方法:采用K-B纸片法和梯度琼脂平板法测定细菌敏感性;鲍曼不动杆菌产β-内酰胺酶用Nitrocefin定性后,以市售试剂盒抽提质粒和染色体,PCR法扩增β-内酰胺酶基因,并对扩增产物进行基因测序和同源性比较。结果:研究所用的12株鲍曼不动杆菌均产β-内酰胺酶,对头孢菌素类高度耐药,但对碳青霉烯类和加酶头孢菌素较敏感;其中6株细菌经PCR扩增和产物序列分析表明其质粒上携带有β-内酰胺酶AmpC基因。结论:质粒介导的AmpC酶是临床分离的鲍曼不动杆菌对头孢菌素类药物产生严重耐药性的主要因素。     

多药耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白基因研究

目的 调查多药耐药鲍曼不动杆菌(MDR-ABA)β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白carO基因情况.方法 收集分离自宁波市李惠利医院2009年6月至2009年9月住院患者的MDR-ABA共20株,采用聚合酶联反应(PCR)及序列分析的方法分析21种β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白carO基因.结果 20株MDR-ABA共检出3种β-内胺酰酶基因:TEM,SHV,ADC,阳性率分别为80.0%(16/20).5.0%(1/20),30.0%(6/20),其余18种β-内酰胺酶基因未检出,膜孔蛋白carO基因缺失率70.0%(14/20).2号株ADC阳性基因测得序列经BLAST比对与己在GenBank登录的ADC型AmpC均不相同,经与GenBank登录的ADC型序列分子进化分析,确认为ADC型β-内酰胺酶新的变异型.结论 本组MDR-ABA多种β-内酸胺类药物耐药与产TEM,SHV,ADC等3种β-内酸胺酶相关外,还与膜孔蛋自编码基因carO缺失有关.     

鲍曼不动杆菌ADC型AmpC β-内酰胺酶基因研究

目的了解浙江湖州解放军第98医院自临床分离的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中ADC型AmpC β-内酰胺酶基因（blaADC）存在状况。方法收集2000年7月-2002年12月所分离到的60株鲍曼不动杆菌，采用聚合酶链反应及序列分析的方法分析blaADC基因。结果60株中有59株blaADC基因呈阳性（98．3％），序列分析表明4号菌株（原始编号HZB3944）blaADC基因为-新亚型，其核酸序列已登录GenBank（注册号EF569589）。结论鲍曼不动杆菌中blaADC基因阳性率很高，产ADC型AmpC β-内酰胺酶是本组菌株对β-内酰胺类抗生素耐药的重要原因之一。     

泛耐药鲍曼不动杆菌中发现β-内酰胺酶基因新的变异型ADC-65、ADC-66

目的 调查一组泛耐药鲍曼不动杆菌(PDR-ABA)中β-内酰胺酶基因存在和变异情况.方法 收集2010年7月至2010年12月某医院住院患者之痰液标本中分离的泛耐药鲍曼不动杆菌共20株,用分子鉴定法鉴定菌种,再用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析A类～D类共34种β-内酰胺酶基因.结果 本组20株泛耐药鲍曼不动杆菌共检出TEM-1型20株(100.0％)、PER-1型16株(80.0％)、OXA-23型20株(100.0％)、OXA-66型20株(100.0％)、ADC-30型16株(80.0％)、ADC基因新的变异型ADC-65型3株(15.0％)(GenBank登录号:JX109941)、ADC-66型1株(5.0％)(GenBank登录号:JX109942).结论 本组鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类药物耐药主要与产TEM-1、PER-1、OXA-23型、OXA-66型、ADC等β-内酰胺酶基因相关,OXA-23型β-内酰胺酶基因阳性是泛耐药菌耐碳青霉烯类药物的原因.发现ADC基因存在新变异型:ADC-65、ADC-66是国内外首次报道.     

合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株的SHV型耐药基因分布和耐药性分析

目的了解1999～2000年合肥市临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中,SHV型β-内酰胺酶基因型分布情况和耐药性分析。方法标本为安徽省细菌耐药性监控中心所留取的1999年9月～2000年9月从合肥市4家大医院临床分离的、已被证实产ESBLs的98株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,采用聚合酶链反应(PCR)扩增产SHV型β-内酰胺酶菌株基因片段,克隆入pGEM-Teasy载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列以鉴定基因型。按照2005年CLSI推荐标准,用琼脂稀释法分别测定临床分离菌株和转移结合子对11种不同抗菌药物的MIC值,并比较分析两者的不同结果。结果98株产ESBLs菌株中有29株产SHV型β-内酰胺酶,其中SHV-1型8株,SHV-11型5株,SHV-12型11株,SHV-18型1株,SHV-28型1株,SHV-89型3株[序列号为(DQ193536)]。临床分离株的MIC结果显示对哌拉西林,头孢噻肟,头孢曲松的敏感率低;转移结合子的敏感性较临床分离菌株有所上升。结论合肥市部分医院产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌检出率较高,我们在国内外首次报道了SHV-89;并且本地区产SHV型β-内酰胺酶菌株的耐药性较高。     

产ESBLs鲍曼不动杆菌的耐药特性、质粒谱及耐药基因型

目的了解并研究产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）鲍曼不动杆菌的流行、耐药特点及质粒图谱，对产ESBLs菌株进行基因分型。方法先后用nitrocefin纸棒、最低抑菌浓度（MIC）初筛法和纸片扩散确认法从临床分离的鲍曼不动杆菌中检测产ESBLs菌株，用凝胶电泳分析其质粒图谱，并用聚合酶链反应（PCR）对产ESBLs基因进行分型。结果93株鲍曼不动杆菌中，对β-内酰胺酶类抗菌药物耐药47株（79．66％），中度敏感12株（20．34％）；产ESBLs菌株有16株，占17．20％。产ESBLs鲍曼不动杆菌对头孢曲松、头孢他啶、头孢唑肟、头孢吡肟、氨曲南、庆大霉素、妥布霉素、磺胺甲曝唑、环丙沙星和阿米卡星的耐药率均显著高于非产ESBLs菌株（P〈0．05）。保留的15株产ESBLs菌具有4种质粒谱，主要为Ⅰ型和Ⅲ型；它们均携带1～2种TEM型或SHV型或PER型β-内酰胺酶基因，且80％携带OXA-23型碳青霉烯酶基因。结论产ESBLs鲍曼不动杆菌常为多重耐药菌，耐药率与产ESBLs密切相关；同一克隆株在同一病房有流行趋势；本院流行株均携带2—3种耐药基因型，主要为TEM型、PER型β-内酰胺酶基因和OXA-23型碳青霉烯酶基因。     

鲍曼不动杆菌OXA-23型碳青霉烯酶基因的研究

目的分析鲍曼不动杆菌的耐药性及其产OXA-23型碳青霉烯酶基因的核苷酸序列。方法用自动微生物分析仪测定常用抗菌药的MIC50；对OXA-23型碳青霉烯酶基因进行PCR扩增，产物纯化测序。结果15株产ESBLs鲍曼不动杆菌中有12株携带OXA-23型碳青霉烯酶；PCR产物纯化后测序表明与鲍曼不动杆菌（AY795964．1）blaxxA-23基因序列100％同源。结论携带OXA-23型碳青霉烯酶基因的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药的耐药率高，其编码基因为blaoxA-23。     

铜绿假单胞菌产TEM-29型ESBL基因的克隆及原核表达

目的研究临床分离铜绿假单胞菌Pa3-104产生的超广谱β-内酰胺酶的基因型，并对其进行原核表达，了解它的相关特性。方法对该临床菌株进行接合试验；采用PCR扩增TEM型β-内酰胺酶编码基因的片段，克隆入pUCm-T载体，在E.coliJM109中表达，双脱氧链终止法测定核苷酸序列，确定基因型；并将TEM型β-内酰胺酶全编码基因克隆入原核表达载体pBK-CMV中进行原核表达；用三维试验检测重组菌产β-内酰胺酶的表型，等电聚焦电泳测定其表达蛋白的等电点（pI）。结果该临床菌株质粒接合试验为阳性；PCR扩增测序结果显示为TEM型，其基因片段含861个核苷酸，该TEM型β-内酰胺酶的编码基因与GenBank中大肠埃希菌产生的TEM-29的编码基因（Y17584）一致，等电聚焦电泳结果显示该酶的pI为5．4，三维试验证实为ESBL。结论在国内首次从临床分离铜绿假单胞菌中发现TEM-29型ESBL。     

鲍曼不动杆菌耐药性及β-内酰胺酶基因型研究

目的 调查川北地区鲍曼不动杆菌耐药性及β-内酰胺酶基因型.方法 用Vitek 32细菌鉴定系统对细菌进行鉴定.用琼脂稀释法测定鲍曼不动杆菌对16种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC).用聚合酶链反应(PCR)法检测β-内酰胺酶耐药基因,并对耐药基因测序分析.结果 78株鲍曼不动杆菌对亚胺培南全部敏感,对美罗培南的耐药率为1.3%,对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率为37.2%,对其它13种抗菌药的耐药率均在60%以上.21株多重耐药鲍曼不动杆菌均携带TEM型基因,其中.同时还携带SHV和CTX-M型基因的分别有14株和7株,经DNA测序.TEM基因均为TEM-128,CTX-M基因为CTX-M-2,SHV基因可能为SHV-5、SHV-1b、SHV-56、SHV-71或SHV-96.结论 川北地区鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药存在严重耐药现象,β-内酰胺酶耐药基因型以TEM-128为主,同时也有SHV和CTX-M,部分菌株携带两种以上β-内酰胺酶耐药基因参与细菌耐药性的形成.     

新疆地区鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因研究

目的了解20株鲍曼不动杆菌(A.baumannii,AB)β-内酰胺酶基因存在状况。方法用PCR方法对20株AB菌的9种β-内酰胺酶基因进行检测。结果20株AB菌中blaTEM阳性13株(65%)、blaADC阳性12株(60%)、blaSHV阳性1株(5%),其余β-内酰胺酶基因均阴性;1株blaSHV测得序列经比对为blaSHV-36型;1株blaADC作全长基因测序,测得序列经比对与美国核酸库已登录的blaADC DNA序列均不同,为新亚型。结论该20株AB菌对β-内酰胺类抗生素耐药与产β-内酰胺酶密切相关。     

TEM-105编码基因的功能研究

目的　获得浙江地区临床分离的 4株肺炎克雷伯菌所产的TEM型β 内酰胺酶编码基因的序列,鉴定其基因型,并了解其相关特性。方法　PCR扩增TEM型β 内酰胺酶编码基因片段,克隆入pGEM Teasy载体,表达于感受态细胞大肠埃希菌DH5α中,双脱氧链终止法测定核苷酸序列,确定基因型;其基因与原核表达载体 (pET 28c)连接,并在感受态细胞大肠埃希菌DH5α中进行原核表达,提取质粒,用PCR进行表达鉴定,用等电聚焦电泳测定原核表达菌株中酶的等电点(pIs),用ESBLs表型确认试验鉴定表达菌株的表型,另外对这些临床菌株进行接合试验。结果　PCR扩增结果显示这 4株细菌产生的TEM型β 内酰胺酶编码基因片段含1 009个核苷酸,其表达酶的性质均为非ESBLs,pIs均为5 4,临床菌株的质粒接合试验均为阳性。这 4株临床菌株所产生的TEM型β 内酰胺酶的编码基因已被GenBank命名为TEM 105(GenBank注册号:AF516720)。结论　浙江地区这 4株细菌所产TEM型β 内酰胺酶均为TEM 105,在世界上我们首次从临床分离株中发现TEM 105。     

多重耐药鲍曼不动杆菌的β内酰胺酶基因型研究

目的了解临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌β内酰胺酶基因的存在情况。方法采用MicroScan40微生物全自动鉴定系统微量肉汤稀释法测定菌株的耐药性。采用聚合酶链反应(PCR)方法检测β-内酰胺酶基因型。结果 30株鲍曼不动杆菌除对阿米卡星和左氧氟沙星耐药率分别为23.3%和30.0%外,对其他抗菌药物均达80.0%以上。检出β-内酰胺酶基因26株(86.7%),OXA-23样阳性20株(66.7%),OXA-51样阳性18株(60.0%),AMPC酶阳性18株(60.0%),TEM阳性5株(16.6%),SHV阳性4株(13.3%),PER阳性3株(10%),14株(46.6%)同时携带2种以上基因,未检出IMP、VIM、CTX-M-9,DHA、OXA-24、OXA-58。结论我院多重耐药鲍曼不动杆菌携带多种β-内酰胺酶基因,而且同时携带3种以上β-内酰胺酶基因比率高。     

耐药鲍曼不动杆菌ADC型β-内酰胺酶基因分子流行病学研究

目的 了解临床分离的92株耐药鲍曼不动杆菌ADC型β-内酰胺酶基因存在状况以及其基因进化分析.方法 92株耐药鲍曼不动杆菌分离自某省级医院痰液标本,药敏纸片法检测其药物敏感性,聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析ADC型β-内酰胺酶基因.结果 92株鲍曼不动杆菌对头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/三唑巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、米渃环素、复方磺胺甲噁唑的耐药率分别为:91.3％、91.3％、91.3％、89.1％、89.1％、90.2％、67.4％、83.7％、58.7％、84.7％; ADC型β-内酰胺酶的阳性率为93.5％; ADC型β-内酰胺酶基因分子进化显示,可分为4个簇群.结论 ADC型β-内酰胺酶基因在多重耐药的鲍曼不动杆菌中广泛存在,这有可能是造成青霉素、第一至第三代头孢类药物和单环类β-内酰胺类药物耐药的主要原因.     

泛耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺类耐药机制研究

目的调查泛耐药鲍曼不动杆菌(pandrug-resistant Acinetobacter baumannii,PDR-ABA菌)临床分离菌株中β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白基因的存在和变异情况。方法收集2010年3月到2010年5月临床标本中分离的PDR-ABA菌20株,采用微量肉汤烯释法进行抗菌药物敏感性试验,聚合酶链反应(PCR)和基因测序方法分析36种β-内酰胺酶基因和carO膜孔蛋白基因。结果本组20株PDR-ABA菌TEM-1、ADC-30-1ike、OXA-23型3种β-内酰胺酶基因全部阳性,CARB-2和DHA-1型阳性率为5.0%。在鲍曼不动杆菌中发现CARB-2型为国内首次报道。膜孔蛋carO基因突变率达100.0%。结论本组PDR-ABA菌对多种β-内酰胺类药物耐药与产TEM、ADC-30-like、OXA-23、CARB-2、DHA-1型5种13-内酰胺酶相关外,还与膜孔蛋白编码基因carO突变有关。     

三维试验的改良及对鲍曼不动杆菌的产酶现状和耐药性分析

目的 了解我院鲍曼不动杆菌产β-内酰胺酶的现状及对临床常用12种抗菌药物的耐药性.方法 对我院临床感染标本分离的120株鲍曼不动杆菌使用Cefinase纸片法进行β-内酰胺酶初筛检测;采用改良三维试验大平皿法进行β-内酰胺酶分型;药敏试验采用琼脂平板倍比稀释法测定MIC,按CLSI/NCCLS标准进行.结果 除亚胺堵南外,120株鲍曼不动杆菌对其余11种抗菌药物的耐药率均超过50%.cefinase纸片法检测到114株产β-内酰胺酶(95%),其中63株(55.24%)经改良三维试验大平皿法进行酶分型.在63株鲍曼不动杆菌中,单产碳青霉烯酶4株(3.51%)、产ESBLe 15株(13.16%)、产AmpC酶5株(4.39%)及产耐酶抑制剂β-内酰胺酶(IRTs)18株(15.78%);同时产碳青霉烯酶和ESBLs的有5株(4.39%);产AmpC酶和ESBLs的分别有9株(7.89%),同时产碳青霉烯酶和IRTs的有7株(6.14%).结论 我院鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物耐药性较高,可能与产多型β-内酰胺酶有关.三维试验结果以产ESBLs最多且复杂,其次是IRTs.本研究建立的改良三维试验大平皿法能在同-平板上进行几种常见β-内酰胺酶的筛选分型,取得了很好的效果.     

多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白基因研究

目的 检测分析鲍曼不动杆菌的耐药性、全面了解多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺类耐药机制;方法 药敏试验为Kirby-Bauer法、基因检测采用PCR对20株多药耐药鲍曼不动杆菌进行了22种β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白carO基因检测;结果 20株鲍曼不动杆菌耐药率除亚胺培南外,其余药物耐药率均在95％以上、共有TEM、PER、ADC等3种β-内酰胺酶基因呈阳性,阳性率分别为95.0.0％(19/20)、25.0％(5/20)、100.0％(20/20).膜孔蛋白carO基因突变率达100.0％;结论 本组MDR-ABA菌多种β-内酰胺类药物耐药与产TEM、PER、ADC等3种β-内酰胺酶相关外,还与膜孔蛋白编码基因carO突变有关.     

颅脑外伤者痰标本鲍曼不动杆菌多重耐药性及机制研究

目的了解浙江湖州解放军第98医院分离自颅脑外伤者痰标本鲍曼不动杆菌的（Acinetobacter baumannii）多重耐药性以及耐药机制。方法收集自2000年7月至2002年12月所分离到的27株鲍曼不动杆菌，采用ATB药敏试验条板微量肉汤法测定14种抗菌药物的敏感性，采用聚合酶链反应及序列分析的方法检测16种耐药相关基因，采用Average法对耐药基因进行聚类分析。结果除1号株外，其余26株均同时耐经典β-内酰胺类、氨基糖苷类和环丙沙星等抗生素，这些菌株在其染色体编码基因（gyrA基因）存在突变的同时还获得了1～2种β-内酰胺酶基因和1～4种氨基糖苷类修饰酶基因。根据耐药基因的聚类分析该27株鲍曼不动杆菌可分三群，为院内感染所致。结论鲍曼不动杆菌已呈多重耐药，β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因携带率较高，gyrA基因突变是对环丙沙星耐药的主要原因。     

耐头孢哌酮对头孢哌酮/舒巴坦敏感的革兰阴性杆菌β-内酰胺酶分析

目的分析对头孢哌酮耐药但对头孢哌酮／舒巴坦敏感的革兰阴性杆菌β-内酰胺酶。方法用PCR方法扩增62株临床分离菌TEM型及SHV型β-内酰胺酶耐药基因并对从65株临床分离的革兰阴性杆菌及7株铜绿假单胞菌中分离提取的β-内酰胺酶进行等电点测定。结果62株临床分离菌PCR扩增结果表明，58．1％（36／62）对头孢哌酮耐药但对头孢哌酮／舒巴坦敏感的革兰阴性杆菌含有TEM型β-内酰胺酶；32．3％（20／62）含有SHV型β-内酰胺酶。65株临床分离的革兰阴性杆菌产生的β-内酰胺酶等电点的测定结果表明36．9％（24／65）的革兰阴性杆菌产生一种β-内酰胺酶，29．2％的革兰阴性杆菌产生2种β-内酰胺酶，13．8％的革兰阴性杆菌产生3种β-内酰胺酶，10．7％的革兰阴性杆菌产生4种β-内酰胺酶，6．1％的革兰阴性杆菌产生5种β-内酰胺酶。6株铜绿假单胞菌产生1种β-内酰胺酶，1株铜绿假单胞菌产生2种β-内酰胺酶。β-内酰胺酶的等电点介于4．95—9．36之间。72株临床分离菌共产生160种β-内酰胺酶。全部β-内酰胺酶能够水解头孢哌酮，而舒巴坦可以抑制酶的活性。β-内酰胺酶对头孢哌酮／舒巴坦（1：1）的水解率与头孢他啶相似，但低于对阿莫西林／克拉维酸（1：5）和哌啦西林／三唑巴坦（1：8）的水解率。包括7株铜绿假单胞菌在内的72株产生β-内酰胺酶的革兰阴性杆菌对头孢哌酮／舒巴坦敏感。结论大部分对头孢哌酮耐药但对头孢哌酮／舒巴坦敏感的革兰阴性杆菌产生TEM型β-内酰胺酶，舒巴坦可以增强头孢哌酮对包括铜绿假单胞菌在内的产酶革兰阴性杆菌的抗菌活性。