体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化的研究

目的 探讨体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向耳蜗毛细胞样细胞分化的可行性.方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并加以鉴定.分离出生1～3 d的乳鼠耳蜗Corti器,与骨髓间充质干细胞在体外共培养14 d.通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学染色对分化细胞的特异性分子指标(myosinⅦa、math1及calretinin)进行鉴定.结果 免疫细胞化学染色显示诱导分化后的细胞myosinⅦa、math1和calretinin表达阳性,RT-PCR提示分化后的细胞可表达毛细胞的标志物myosinⅦa和math1.结论 体外培养的骨髓间充质干细胞可诱导分化为具有毛细胞分子标志物的毛细胞样细胞.     

大鼠嗅球神经干细胞培养

目的　建立大鼠嗅球神经干细胞 (neuralstemcells,NSC)体外培养方法 ,研究其增殖和分化特性。方法　采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养新生第 1天和成年大鼠嗅球NSC ,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSC及自然分化为特异性神经细胞的类型 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定嗅球NSC的生长曲线。结果　从生后第 1天和成年大鼠嗅球分离、培养出表达巢蛋白(nestin) ,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSC。生后第 1天和成年大鼠嗅球的神经球形成率分别为 2 0 %～ 30 %和 0 1%。嗅球NSC的增殖依赖表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (fibroblastgrowthfactor basic,bFGF) ,其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF。结论　从生后第 1天和成年大鼠嗅球可以培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSC。     

大鼠嗅球神经干细胞培养

目的建立大鼠嗅球神经干细胞(neural stem cells，NSC)体外培养方法，研究其增殖和分化特性。方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养新生第1天和成年大鼠嗅球NSC，应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSC及自然分化为特异性神经细胞的类型，四甲基偶氮唑盐(MTY)法测定嗅球NSC的生长曲线。结果从生后第1天和成年大鼠嗅球分离、培养出表达巢蛋白(nestin)，并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSC。生后第1天和成年大鼠嗅球的神经球形成率分别为20％～30％和0．1％。嗅球NSC的增殖依赖表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor—basic，bFGF)，其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF。结论从生后第1天和成年大鼠嗅球可以培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSC。     

miR-182可以促进耳蜗前体细胞分化为毛细胞

目的探讨miR-182诱导耳蜗前体细胞向毛细胞分化的作用及机制。方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞并用血清诱导分化,BrdU、Nestin免疫荧光染色鉴定细胞自我增殖能力;myosinⅦa和phalloidin免疫荧光染色鉴定其是否具有分化为毛细胞的潜能。分别利用miR-182 mimics和siRNA在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182,然后在细胞诱导分化7天后,用流式细胞仪检测分化细胞中myosinⅦa阳性细胞比例,用Western-blot检测支持细胞标志分子中Sox2的变化。结果使用miR-182 mimics进行过表达后,耳蜗前体细胞分化为myosinⅦa阳性表达的细胞比例显著高于对照组,使用miR-182 siRNA进行低表达后此比例显著低于对照组。Western-blot检测显示,Sox2在miR-182 mimics组较对照组降低,miR-182 siRNA组较对照组增加。结论过表达miRN182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞方向分化,ox2可能是此过程中的靶基因。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养和鉴定及标记

目的:探索胚胎大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记的方法.方法:分离胚胎大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;5-溴脱氧尿嘧啶(BrDU)掺入试验,并用免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况.采用荧光染料Hoechest33342标记神经干细胞并诱导其分化,用神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞.结果:①获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养8代后仍具干细胞特性;②荧光染料的标记率可达97%,细胞传8代后荧光亮度无明显衰减,并且分化后的细胞核中仍有荧光表达.结论:成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及核多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞;荧光染料的标记可获得较高的标记率,可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞.     

增强声环境中嗅球神经前体细胞在耳蜗核的迁移

目的观察增强声环境中移植到大鼠耳蜗核的嗅球神经前体细胞的迁移特点,是否产生部位特异性的修复过程。方法培养嗅球神经前体细胞取自孕14-16d胚胎大鼠,荧光染色Hoechst33342标记后移植到成年大鼠的耳蜗核内侧缘。移植大鼠分为A、B两组,A组置于增强声环境,B组在正常环境中饲养。14d取材观察移植细胞的迁移和分化。结果A组移植细胞有沿听觉神经通路移动的趋势。免疫荧光技术观察到Hoechst33342和神经元核蛋白（NeuN）、谷氨酸阳性三重标记的移植细胞。结论嗅球神经前体细胞移植耳蜗核短期存活良好,增强声刺激可能促进前体细胞在听觉系统的迁移。     

羊水干细胞拟胚体与耳蜗基底膜共培养向神经元分化的可行性

目的探讨人来源的羊水干细胞以拟胚体样结构与小鼠耳蜗基底膜组织共培养,分化为神经元的可行性。方法分离培养人来源的羊水干细胞,悬滴法培养,观察羊水干细胞拟胚体形成情况;免疫荧光检测拟胚体细胞干性标记物的表达;将拟胚体与小鼠基底膜组织共培养,不添加神经生长因子及神经元信号诱导因子,观察拟胚体向神经元分化情况。结果羊水干细胞经悬滴培养可形成拟胚体样结构,表达神经干细胞标记物Sox2、Nestin;与小鼠耳蜗基底膜组织共培养,拟胚体细胞有神经元标记物Tuj1表达,但无神经元形态特征。结论羊水干细胞体外悬滴后可形成形态均一且具有神经干性的拟胚体,与耳蜗基底膜组织共培养,不能诱导拟胚体细胞向形态典型的神经元分化。     

c-myc在大鼠耳蜗组织发育和耳蜗前体细胞分化过程中的表达变化

目的 通过检测c-myc基因在大鼠耳蜗组织发育及前体细胞分化过程中的表达情况,探讨其在哺乳动物耳蜗发育中的作用.方法 ①取E10、E15、P1、P7和P14的SD大鼠耳蜗组织,应用RT-PCR、Western blot的方法检测c-myc在大鼠耳蜗组织发育过程中的表达情况.②取耳蜗前体细胞和分化7天后的分化细胞,用RT-PCR、免疫细胞化学染色和Western blot的方法检测c-myc在耳蜗前体细胞分化过程中的表达情况.结果 从胚胎至出生后的耳蜗发育过程中,c-myc表达量呈现逐渐下降趋势;在前体细胞的分化过程中,c-myc的表达量也呈现下降趋势.结论 c-myc可能参与调控大鼠耳蜗组织的发育及前体细胞的分化.     

脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞初步观察

目的探讨骨髓间充质干细胞（bone-marrow mesenchymal stem cells,BMscs）转染人脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）基因后在体外分化为神经元样细胞的功能。方法克隆人BDNF基因并构建其真核表达载体;分离培养5只豚鼠BMscs,观测其形态并用流式细胞仪鉴定;将人BDNF基因电穿孔法转染BMscs,G418筛选后用维甲酸诱导分化,免疫细胞化学法对分化细胞进行鉴定。结果分离培养的细胞具有典型的BMSCs形态和标志,转染诱导后的细胞表达神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白（Nestin）和胶质纤维酸性蛋白,并能分泌BDNF。结论BDNF基因转染的BMscs在体外能分化为神经元样细胞,电穿孔法能提高转染率,RA有促诱导作用。     

应用酶消化耳蜗基底膜上皮细胞的研究

目的比较联合应用嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶消化对耳蜗基底膜上皮细胞的分离效果。方法分离P0-3天SD大鼠基底膜,并将其分为四组,分别为:A组胰酶消化组;B组嗜热菌蛋白酶消化组;C组I型胶原酶消化组;D组嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶消化组。收集各组消化的细胞进行悬浮培养和诱导分化,分别计数各组形成的细胞球数目,应用免疫荧光对获得的细胞来源进行鉴定,并比较各组Cytokeratin-18阳性细胞的百分率。结果从4种方法分离得到的细胞经培养后均可形成细胞球,表达干细胞标记物Nestin和细胞分裂标记物Brd U。获得细胞大部分均表达上皮来标记物E-cadherin和cytokeratin-18,而不表达间质细胞标志物Vimentin,经过诱导分化后可以分化成毛细胞样细胞。应用嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶消化获得的细胞球数目显著高于其它组(P<0.05);而采用胰酶消化获得的细胞cytokeratin-18阳性率显著低于其它组(P<0.05)。结论联合应用嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶消化耳蜗基底膜上皮细胞可以显著提高基底膜上皮细胞的分离效果,从而耳蜗前体细胞的研究提供有力研究基础。     

小鼠耳蜗感觉上皮细胞的自然培养诱导毛细胞的产生

目的 培养小鼠耳蜗上皮细胞,寻找听觉毛细胞的前体细胞,从而研究听觉毛细胞的再生。方法 改良细胞培养基和培养技术,建立小鼠耳蜗听觉上皮细胞的培养;用免疫细胞化学方法和BrdU标记法检测培养细胞的性质和分裂状态。结果 培养的听觉上皮细胞表现为大而扁平的上皮细胞形态,并且表达上皮细胞的标志F-actin和cytokeratin,部分新生的细胞可被早期毛细胞的特异标志calretinin着染,表明有听觉毛细胞样的细胞产生,这种现象经3次传代培养后仍然存在。结论 自然细胞培养方法可能诱导小鼠听觉毛细胞的产生,在小鼠的耳蜗内可能存在听觉毛细胞的前体细胞,而这些前体细胞是否是组织特异性干细胞还需要更进一步的研究。     

大鼠椭圆囊感觉上皮细胞长期培养体系的建立及毛细胞标记物表达的意义

目的：建立椭圆囊感觉上皮细胞（USEC）长期培养体系，为内耳毛细胞再生研究提供稳定的活性细胞。方法：取1d龄wistar大鼠，在显微镜下取出椭圆囊上皮，嗜热菌蛋白酶处理，获得具活性的纯椭圆囊感觉上皮，胰蛋白酶＋胶原酶消化，培养传代，传25代。取第25代USEC在倒置显微镜、透射电镜下对USEC的生长特征、形态结构进行观察；免疫细胞化学检测细胞角蛋白18、波形蛋白、Brn3．a及Calretinin的表达。RT—PCR检测毛细胞的特征性标记物AchRa9、MyosinVIIamRNA的表达。结果：USEC细胞培养达6个月传25代，第25代USEC均呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态，细胞之间连接紧密，形成单层时均呈“铺路石样”外观，可见dome结构。该细胞表达角蛋白18和不表达波形蛋白，微绒毛丰富，细胞间连接紧密，提示其上皮起源。第25代USEC表达毛细胞的特征性标志物Brn3．a、Calretinin及AchRa9、Myosin Ⅶa mRNA，表明长期培养USEC仍具有毛细胞的前体细胞的特性。结论：本实验成功建立了USEC长期培养体系。长期培养的USEC性状未发生明显改变，表达上皮细胞及毛细胞的特征性标志物，具有毛细胞前体细胞的特征。这为毛细胞再生的机制及内耳分子、基因研究提供了稳定的细胞来源。     

大鼠耳蜗感觉上皮细胞的原代培养及其意义

目的：建立大鼠耳蜗感觉上皮细胞（CSEC）的原代培养体系，为研究毛细胞再生的分子机制提供大量来源一致的细胞。方法：取出生1d（P1）的大鼠耳蜗感觉上皮（Corti器）作组织块培养，选择性消化抑制成纤维样细胞（FLC）生长；应用有限稀释法纯化CSEC，倒置显微镜下观察CSEC的形态、生长特征；应用细胞角蛋白18、波形蛋白、Brn3．a和Calretinin的免疫细胞化学及透射电镜等进行鉴定。Brdu标记CSEC核DNA观察CSEC有丝分裂活动。结果：培养第2天CSEC从组织块迁移出来，呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态，细胞之间连接紧密，形成单层时呈“铺路石样”外观；FLC呈梭形“鱼群样”包绕CSEC生长，增殖速度快于CSEC。由纯化的CSEC构成的上皮单层可见由成百个CSEC包绕液体形成的dome。CSEC表达毛细胞的特征性标志物，证实培养的CSEC具有毛细胞前体细胞的特征；并通过有丝分裂活动产生新的细胞即毛细胞样细胞。结论：体外培养的CSEC表达毛细胞特征性标志物，具有毛细胞前体细胞的特征。CSEC原代培养体系的建立，为进一步探讨毛细胞再生的分子机制提供了实验条件。     

成年大鼠耳蜗血管纹缘细胞的体外培养

目的:建立成年大鼠耳蜗血管纹缘细胞(MC)的体外培养体系。方法:采用活体组织分离及培养技术,获取培养的大鼠耳蜗MC,透射电镜观察细胞超微结构,免疫组织化学法检测上皮细胞标志性中间丝角蛋白的表达及纯度,RT-PCR检测MC特征性的中间丝角蛋白mRNA的表达。结果:体外培养的MC呈不规则多角形,细胞增殖相互连接,紧密排列呈现培养上皮细胞典型的"铺路石"样外观,并可见由数百个MC密集生长组成的折光性强的球形结构(dome);透射电镜观察可见细胞周围有微绒毛样结构;免疫细胞化学检查,纯化后95%以上的MC细胞质呈桔黄色,而对照组无此着色。RT-PCR扩增出标志中间丝角蛋白基因表达的PCR产物,条带位于300~400 bp,与目的条带(368 bp)相符。结论:采用组织块培养技术成功建立成年大鼠耳蜗血管纹MC的体外培养体系,为进一步研究成熟期MC的功能提供合适的细胞模型。     

大鼠嗅上皮神经干细胞的分离及培养

目的：从新生及成年大鼠嗅上皮分离培养嗅上皮神经干细胞（NSC）,研究其增殖及分化特性。方法：采用含10％胎牛血清的DMEM／F12（1：1）培养液,分离、培养生后第3天和硫酸锌原位创伤后6d的成年大鼠嗅上皮NSC,应用间接免疫荧光染色鉴定培养的NSC及分化的特异性神经细胞类型,四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定嗅上皮NSC的生长曲线及生长因子的影响。结果：从生后第3天和成年大鼠嗅上皮分离、培养出巢蛋白免疫反应阳性而细胞角蛋白免疫反应阴性,并能分化为神经元和星形胶质细胞的NSC。生后第3天和成年大鼠嗅上皮NSC生存能力的差异无统计学意义（P〉O．05）,细胞克隆形成率为0．05％～0．10％。碱性成纤维细胞生长因子可以显著促进嗅上皮NSC的增殖。结论：从生后第3天和成年大鼠嗅上皮可培养出具有自我复制和多向分化潜能的NSC。     

胚胎大鼠神经干细胞体外培养及分化为类毛细胞的研究

目的探讨体外培养和鉴定胚胎大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)及诱导其分化为类毛细胞。方法从SD系胚鼠大脑分离NSCs,在无血清培养基中培养,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导其分化为神经元和星形胶质细胞:将NSCs球放到含鼠尾胶原包被的盖玻片6孔培养板中培养,然后将乳鼠基底膜体外培养后汲取其上清液与NSCs一起培养,14～21天后通过免疫荧光和免疫组化法检测毛细胞标志物肌球蛋白(myosin)Ⅶa和钙视网膜蛋白(calretinin)。结果培养的NSCs胞体透亮,折光性好,分化后的细胞免疫组化示神经元特异性烯醇化酶、胶原纤维酸性蛋白、myosinⅦa和calretinin阳性。结论在无血清条件下能培养出活性很好的NSCs,并且能诱导其分化为神经元、星形胶质细胞和类毛细胞。     

人头颈部骨骼肌干细胞的分离培养及生长特性研究

目的 体外建立人骨骼肌干细胞的纯化及鉴定方法,并对所分离干细胞的生物学特性进行分析研究.方法 分离人头颈部正常骨骼肌组织,采用无血清培养基,悬浮状态培养技术得到人骨骼肌干细胞,体外扩增并观察生长特性.细胞免疫荧光染色和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术鉴定标记物的表达情况,单细胞克隆观察单个细胞生长特性.将分离来的细胞分别转移至采用成平滑肌、成脂、成骨诱导培养基内,观察细胞的生长分化特性,并通过特异性染色予以鉴定.结果 悬浮培养条件下,倒置相差显微镜观察示骨骼肌干细胞在培养基内不断增殖形成细胞球.免疫荧光染色示细胞球表达卫星细胞的标记物Pax7及ALDH1,贴壁生长扩增传代后表达肌原细胞标记物Myod及Desmin;RT-PCR检测示表达干细胞标记物Oct3/4,Nanog,Sox2和Pax7;单克隆形成实验显示单个细胞可在悬浮状态下形成新的细胞克隆.骨骼肌细胞在体外可以诱导分化为平滑肌、骨和脂肪细胞.结论 在体外可以成功分离、纯化和扩增人骨骼肌干细胞,其具有干细胞的自我更新和多向分化潜能.