pPICZαA-CDK2重组质粒的构建及表达

目的:构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的胞外分泌型pPICZαA-CDK2重组质粒,利用毕赤酵母表达体系表达CDK2蛋白。方法:从人白细胞中提取总RNA,逆转录后采用聚合酶链反应扩增出CDK2基因,并将其插入pPICZαA质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌JM109进行克隆。重组质粒pPICZαA-CDK2转化毕赤酵母菌株GS115,甲醇诱导酵母细胞进行蛋白表达,SDS-PAGE和Western-Blot鉴定蛋白表达情况及抗原性。结果:PCR电泳及DNA测序证实CDK2基因已正确克隆到表达载体中;重组质粒转入酵母菌GS115,酵母经甲醇诱导表达后经SDS-PAGE检测发现在34000左右有条带,Western-Blot检测发现有与CDK2单抗结合蛋白。结论:成功构建重组质粒,初步判断CDK2全长蛋白在毕赤酵母中表达成功且抗原性良好。     

Stathmin基因毕赤酵母表达体系的构建及鉴定

目的构建Stathmin基因毕赤酵母表达体系,并对表达产物进行纯化和鉴定,为Stathmin相互作用蛋白的进一步研究提供实验基础。方法通过PCR方法从SKBR3乳腺癌细胞中扩增出人Stathmin基因片段,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC3.5K,构建重组载体pPIC3.5K-Stathmin,转化GS115工程菌,经含基因素(G418)的酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基筛选出阳性克隆。用0.5%甲醇诱导表达,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western Blotting鉴定表达产物。结果 DNA测序结果表明,所获基因片段与Stathmin基因序列一致。在含有G418 600μg/mL的YPD培养基上筛选出的pPIC3.5K-Stathmin转化子,经PCR鉴定为阳性克隆。SDS-PAGE可见约37×103处有目的条带表达,经Western Blotting鉴定,此条带为Stathmin蛋白。结论成功构建了Stathmin酵母表达载体,并在毕赤酵母中表达成功,为Stathmin相互作用蛋白研究以及生物治疗药物的制备奠定了基础。     

血栓调节蛋白表皮生长因子样结构功能域在毕赤酵母中的表达

目的 :构建血栓调节蛋白表皮生长因子样结构功能域(thrombomodulin-domain 2,TM-D2)的毕赤酵母表达体系,以获得重组TM-D2蛋白。方法:以人cDNA序列为模板,用PCR扩增出TM-D2片段,并将其插入pPICZaB质粒,构建重组表达质粒TM-D2-pPICZaB,重组质粒电击转化入毕赤酵母菌株GS115,用甲醇诱导酵母进行蛋白表达,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白印迹法鉴定蛋白表达及纯化情况。结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和质粒测序证实,TM-D2片段已正确克隆到表达载体中;SDS-PAGE和蛋白印迹法检测结果证实,上清液中含His-tag的重组TM-D2的表达,且其相对分子质量约为55 000。结论:TM-D2-pPICZaB初步判断TM-D2蛋白可在毕赤酵母中表达。     

重组人α_1-微球蛋白在毕赤酵母中的高效分泌性表达

目的获得可溶、稳定、高纯度的α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG),为临床检测标准品、质控品制备奠定基础。方法制备构建重组人毕赤酵母真核分泌表达质粒,并对重组α1-MG进行诱导表达、纯化和鉴定。应用PCR方法扩增重组人α1-MG pET-15b质粒,得到N端带有6个组氨酸“标签”(6×His-tag)的α1-MG融合基因,将该基因插入到真核酵母分泌表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组分泌表达质粒pPIC9-MG、并转化毕赤酵母菌菌株GS115(Pichia pastoris GS115);用甲醇进行重组人α1-MG的诱导表达,摇瓶发酵,上清α1-MG含量测定;目的蛋白采用硫酸铵沉淀、一步亲和层析纯化并通过免疫学含量测定、PAGE电泳、Western blot以及生物质谱进行鉴定;初步进行稳定性观察。结果成功构建了重组人α1-MG真核酵母表达载体,核酸测序与预测一致,并在毕赤酵母中实现了重组人α1-MG的分泌性表达,表达量可达73 mg／L,约占总蛋白的30％。经纯化及鉴定,得到了可溶性的、具有天然蛋白生物学活性的PAGE纯目的蛋白。结论首次在毕赤酵母中实现重组人α1-MG的高效分泌性表达,表达目的蛋白具有良好的生物学活性、稳定性好、易纯化等优点。     

重组人α1-微球蛋白在毕赤酵母中的高效分泌性表达

目的 获得可溶、稳定、高纯度的α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG),为临床检测标准品、质控品制备奠定基础.方法 制备构建重组人毕赤酵母真核分泌表达质粒,并对重组α1-MG进行诱导表达、纯化和鉴定.应用PCR方法扩增重组人α1-MG pET-15b质粒,得到N端带有6个组氨酸"标签"(6 × His-tag)的α1-MG融合基因,将该基因插入到真核酵母分泌表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组分泌表达质粒pPIC9-MG、并转化毕赤酵母菌菌株GS115(Pichia pastoris GS115);用甲醇进行重组人α1-MG的诱导表达,摇瓶发酵,上清α1-MG含量测定;目的蛋白采用硫酸铵沉淀、一步亲和层析纯化并通过免疫学含量测定、PAGE电泳、Western blot以及生物质谱进行鉴定;初步进行稳定性观察.结果 成功构建了重组人α1-MG真核酵母表达载体,核酸测序与预测一致,并在毕赤酵母中实现了重组人α1-MG的分泌性表达,表达量可达73 mg/L,约占总蛋白的30%.经纯化及鉴定,得到了可溶性的、具有天然蛋白生物学活性的PAGE纯目的蛋白.结论 首次在毕赤酵母中实现重组人α1-MG的高效分泌性表达,表达目的蛋白具有良好的生物学活性、稳定性好、易纯化等优点.     

人LYVE-1的基因克隆及其在毕赤甲醇酵母细胞中的表达鉴定

目的获得可溶、稳定、与人淋巴管内皮特异性透明质酸受体(LYVE-1)具备相同抗原性的重组人LYVE-1,为进一步研究LYVE-1在淋巴管形成中的作用及临床肿瘤免疫学诊断打下基础、提供材料。方法采用逆转录-酶链聚合反应(RT-PCR)自人淋巴结获得LYVE-1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPICZα,构建含人LYVE-1的重组质粒(pPICZα-LYVE-1);经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入毕赤甲醇酵母细胞(GS115)中进行诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及免疫印迹试验(Western blot)鉴定。结果经甲醇诱导的含pPICZα-LYVE-1的酵母细胞表达出重组人LYVE-1的融合蛋白,此蛋白在凝胶上表现为一约70 000的区带,在Western blot实验中可被LYVE-1的特异多克隆抗体识别。结论人LYVE-1融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达,并具有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体.方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,RCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序.结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确.结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础.     

人LYVE-1的基因克隆及其在毕赤甲醇酵母细胞中的表达鉴定

目的获得可溶、稳定、与人淋巴管内皮特异性透明质酸受体（LYVE-1）具备相同抗原性的重组人LYVE-1,为进一步研究LYVE-1在淋巴管形成中的作用及临床肿瘤免疫学诊断打下基础、提供材料。方法采用逆转录-酶链聚合反应（RT-PCR）自人淋巴结获得LYVE-1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPICZα,构建含人LYVE-1的重组质粒（pPICZα-LYVE-1）;经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入毕赤甲醇酵母细胞（GS115）中进行诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析及免疫印迹试验（Western blot）鉴定。结果经甲醇诱导的含pPICZα-LYVE-1的酵母细胞表达出重组人LYVE-1的融合蛋白,此蛋白在凝胶上表现为一约70000的区带,在Western blot实验中可被LYVE-1的特异多克隆抗体识别。结论人LYVE-1融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达,并具有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

人内皮抑素-白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的构建编码人内皮抑素-白蛋白的融合基因,并在毕赤酵母(pichia pastoris)中获得高效表达。方法通过重叠延伸PCR的方法 ,构建编码人内皮抑素-白蛋白的融合基因,并克隆至pGEM-T载体中,测序正确后,将其亚克隆至酵母表达载体pPIC9中,然后将鉴定正确的重组表达载体pPIC9/ES-HSA线性化后转化入GS115宿主菌。采用原位双膜法筛选高表达菌株,对高表达菌株进行扩大培养,将表达上清液盐析后分别经阳离子交换层析、阴离子交换层析和亲和层析纯化,获得了重组融合蛋白,采用MTT法测定融合蛋白中内皮抑素的活性。结果成功构建了人内皮抑素-白蛋白融合基因和重组表达质粒pPIC9/ES-HSA,并筛选到表达较为理想的重组菌株pPIC9/ES-HSA/GS115,经甲醇诱导表达后纯化,融合蛋白的纯度达到92%以上,并具有抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞的增殖活性。结论本方法可成功获得具有人内皮抑素生物活性的重组人内皮抑素-人血清白蛋白融合蛋白。     

融合蛋白hJagged1^ext-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达

本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1^ext-Fc，并在毕赤酵母GS115中表达。用RT—PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段。在测序正确后，将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC—Fc载体，得到PIC—hJagged1^ext-Fc。用MD平板筛选重组子，G418法筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，采用SDS—PAGE分析表达蛋白。结果表明：hJagged1基因的胞外段被有效地扩增。序列分析显示所构建的含phJagged1^ext-Fc融合基因的质粒与设计相同，人IgG1Fc蛋白及融合蛋白hJagged11^extFc得到正确表达。结论：成功地构建了hJagged1^ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体，并在毕赤酵母中正确表达，为进一步研究Jagged1在造血干／祖细胞的体外扩增奠定了基础。     

重组人胰腺α-淀粉酶在毕赤酵母菌中的分泌性表达

目的:构建人胰腺!-淀粉酶(HPA)真核表达载体并在毕赤酵母中进行表达。方法:从人胰腺组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,RT-PCR法扩增HPA基因,将其插入到酵母分泌性表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组质粒pPIC9-HPA,用该质粒转化毕赤酵母菌GS115,PCR方法筛选阳性克隆,摇瓶培养、0.5%甲醇诱导重组HPA分泌性表达,测定培养上清中的淀粉酶活力;重组HPA用冷乙醇-糖原亲和沉淀、疏水层析纯化并以SDS-PAGE电泳和Westernblot方法鉴定。结果:成功构建了重组HPA真核酵母表达载体,重组质粒酶切和核酸测序结果与预期一致,显示HPA基因正确插入质粒pPIC9中;以pPIC9-HPA转化毕赤酵母菌GS115,实现了重组HPA在毕赤酵母菌分泌性表达;重组HPA经纯化后鉴定具天然HPA相同的免疫原性,其对可溶性淀粉酶的水解产物和酶动力学分析与天然HPA相近。结论:成功实现了HPA在毕赤酵母真核表达系统中的分泌性表达,重组HPA与天然HPA具有相似的催化和酶动力学性质。本实验为下一步作为临床HPA测定标准品的研制准备了实验基础。     

重组人胱蛋白酶抑制剂C在毕氏酵母菌中的高效表达

目的：构建人胱蛋白酶抑制剂C（Cystatin C)的表达载体并进行蛋白的初步纯化。方法：用逆转录聚合酶链反应从人胎盘组织中扩增含有380bp的Cystatin C cDNA基因片段，并将其插入到pPIC9质粒中，携带有Cystatin C片段的pPIC9质粒转化毕氏酵母菌菌株GS115，醇氧化脱氢酶1（AOX1）启动子被甲醇诱导而产生可溶性Cystatin C.重组Cystatin C采用Hitrap-SP阳离子交换柱进行初步纯化。结果：核酸序列测定与预期一致。Cystatin C 表达水平达到16mg/L，约占菌体总可溶性蛋白的60％，蛋白纯化回收率为40．5％，Cystatin C在表达体系中至少可稳定3d，结论：Cystatin C在毕氏酵母力胞外有较高水平的分泌，既可作为抗原免疫动物获取抗体，也可作为测定的标准品，为今后进行国产Cystatin C免疫学测定剂研制奠定了基础。     

Plackett-Burman设计与响应面法优化毕赤酵母产重组抗菌肽LL-37发酵培养基

目的通过优化毕赤酵母产重组抗菌肽LL-37的培养基组成,以最大程度提高重组蛋白产率。方法采用PlackettBurman设计法对培养基中相关影响因素的效应进行评价;然后进行最陡爬坡实验逼近最佳响应面(RSM)区域;最后通过中心组合设计RSM实验建立二次回归模型以确定最佳培养基配方。结果经优化后的培养基发酵产重组蛋白水平相较于初始培养基提高了约22%。结论 Plackett-Burman设计和RSM可以很好地对毕赤酵母产重组抗菌肽LL-37的发酵培养基进行优化。     

重组人Flt3配体在毕氏酵母中的表达及其对恶性造血细胞的体外作用

目的 用毕氏酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达人可溶性Ｆｌｔ３配体（ｒｈＦＬ）,并观察ｒｈＦＬ对恶性造血细胞增殖的作用;探讨地塞米松（ＤＸＭ）对Ｆｌｔ３受体（Ｆｌｔ３Ｒ）表达及ｒｈＦＬ介导的恶性造血细胞增殖的影响。方法 人工合成ＦＬ基因片段,经基因重组技术获得重组质粒ｐＰＩＣＺα－ＦＬ,电转化毕氏酵母,筛选分泌ｒｈＦＬ的基因工程菌株,用流式细胞仪测定恶性造血细胞表面Ｆｌｔ３Ｒ的表达,用ＭＴ     

The development of recombinant human serum albumin.

We have developed a fermentation process for recombinant human serum albumin (rHSA) production using an expression strain of the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The high productivity of the process enables it to compete with the production of plasma derived HSA. After purification of the rHSA, the content of yeast derived contaminants was less than 1 ng/250 mg of rHSA. The results from structural analyses suggested that purified rHSA possessed an identical conformation to plasma derived HSA. Furthermore, no neoantigenicity different from that of plasma derived HSA was observed. The efficacy and safety of rHSA were tested in clinical studies, and it was shown that there was no difference between rHSA and plasma derived HSA in a comparison study. The high efficacy of rHSA with little or no adverse reaction was confirmed in these studies.     

重组人血小板CD36基因真核表达载体的构建及蛋白表达

目的制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的纯化表达蛋白胞外区30～439氨基酸残基段。方法提取人肝细胞组织总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区(Gly30～Asn439)氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMD18并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒。经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10 his真核瞬时表达载体。采用lipofectamine 2000(invitrogen)转染法,将重组质粒转染HEK-293细胞,表达产物经Ni2+2NTA柱层析纯化。结果 RT-PCR扩增获得了1.4 kb的片段。invitrogen测序,该序列分析结果与Genebank中的NM_001001547.2完全一致。SDS-PAGE证实转染的HEK-293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段。结论利用构建的真核载体pTE2-s-CD36转染人胚肾细胞(HEK293)可高效表达CD36 Gly30～Asn439,得到纯化蛋白,为人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效影响的深入研究奠定基础。