脐血CD+34细胞体外扩增新进展

造血干细胞(hematepoietic stein cell，HSC)是各种血细胞和免疫细胞的始祖，具有极重要的生理功能。脐带已经成为近年来研究的热点，但单份脐血中造血干细胞理论上不少，但实际上数量往往不足以支持成人的造血重建，需要体外加以扩增。影响脐血CD34^ 细胞体外扩增的因素有很多，现就几种关键因素对脐血CD34^ 细胞体外扩增作用的研究新进展综述如下。     

人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用

目的研究人脐血基质细胞(hUCBSCs)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用. 方法应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34+细胞,按照DEXTER法行脐血基质细胞培养,观察hUCBSCs的生长状态及细胞表面分子的表达情况.建立以hUCBSCs为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩增体系,并对脐血CD34+细胞短期扩增后行集落形成单位(CFU)-GM、CFU-E和CFU-Mg半固体培养. 结果脐血基质细胞为混合细胞群,包括CD68(+)、Fn(+)、CD31(+)和CD34(-);以hUCBSCs为滋养层的体外扩增体系对脐血CD34+细胞具有明显的扩增作用,体外液体扩增后的脐血CD34+细胞集落形成能力明显高于对照组,其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合hUCBSCs体系的扩增作用最强,hUCBSCs在促进CFU-Mg集落形成的作用中具有明显优势. 结论hUCBSCs具有体外支持造血作用,与细胞因子联合对促进脐血CD34+细胞扩增作用更加明显.hUCBSCs对促进巨核细胞扩增可能具有特殊的意义.     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的：探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间。方法：脐血CD34^ 细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液。对其有核细胞数（NC）、表面抗原以及集落形成能力进行监测。结果：同对照组相比，扩增组的NC和CD34^ 细胞均有不同程度的扩增，扩增高峰分别为第10d和第6d；其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多。第6d，CD34^ 细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍，第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍。而D组（含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L）扩增的细胞中CD34^ 及CD34^ CD38^-含量最高。提示E组细胞分化较D组明显。结论：体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题，但扩增中应注意其过度分化，扩增时间以6-10d为宜。     

多种细胞因子组合对脐血CD34+细胞的体外扩增

目的 探讨不同细胞因子组合在无血清、无基质条件下对脐血干／祖细胞的调控作用。方法 将SCF、Flk2／Flt3配体(FL)、TPO、IL-6及IL-6受体的可溶性形式(sIL-6R)进行不同组合扩增脐血CD34^ 细胞。结果 ①SCF FL ／-TPO组合能有效快速扩增脐血CD34^ 、CD34^ Thy-1^ 、CD34^ CD33^ 及长期培养启始细胞(LTC—IC)；②该组合同时加入IL-6及sIL-6R后，脐血干／祖细胞显著增殖；单独加入IL-6(不含sIL-6R)时，早期CD34^ 细胞和LTC—IC含量无明显增加，而且CFU-Mix、BFU—E的扩增不如CFU—GM明显；③通过细胞凋亡早期膜变化标记FITC—Annexin—V检测细胞凋亡率，加入Flt3L和／或IL-6 sIL-6R后Annexin-V阳性细胞由15．2％～19．1％降至2．8％～3．5％。结论 在SCF TPO Flt3L IL-6 sIL-6R组合的无基质、无血清悬浮体系中，脐血既能产生大量定向祖细胞，又能保持一定数量的早期造血细胞，这一体外培养体系具有重要的临床意义。     

脐血单个核细胞和CD34+细胞体外扩增造血干/祖细胞

考察了脐血单个核细胞(MNC)和CD34+富集细胞在SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性.实验发现CD34+富集细胞具有很高的扩增潜力,通过3周培养总细胞扩增了(883.2±322.4)倍,而MNC仅扩增了(53.3±6.2)倍.对比细胞集落生成和CD34+细胞的扩增发现,MNC的集落密度由最初的(270.9±54.9)CFCs/105cells上升至第7天的(1 496.3±417.7)CFCs/105cells,CD34+细胞百分比则由最初的(0.99±0.18)%上升至第7天的(4.4±1.9)%,而CD34+富集细胞在培养过程中,虽然集落总数和CD34+细胞总数始终呈上升趋势,但是其集落密度和CD34+细胞百分比则始终呈下降趋势.在两种起始细胞培养中,CFU-GM(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位)在集落中的含量逐渐增加,BFU-E(爆式红细胞集落形成单位)含量则逐渐降低.在3周的短期培养中,MNC可以得到更多的集落形成细胞(CFC)和CD34+细胞.     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间.方法脐血CD34+细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液.对其有核细胞数(NC)、表面抗原以及集落形成能力进行监测.结果同对照组相比,扩增组的NC和CD34+细胞均有不同程度的扩增,扩增高峰分别为第10d和第6d;其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多.第6d,CD34+细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍,第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍.而D组(含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L)扩增的细胞中CD34+及CD34+CD38-含量最高.提示E组细胞分化较D组明显.结论体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题,但扩增中应注意其过度分化,扩增时间以6～10d为宜.     

成人骨髓间充质干细胞对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的: 探讨骨髓间充质干细胞(MSCS)对脐血CD34 细胞体外扩增作用. 方法: 分离培养成人MSCS作为滋养层,联合SCF, IL-11和GM-CSF分别组成对脐血CD34 细胞的不同扩增体系,培养3 wk后观察脐血有核细胞、CFCs以及CD34 细胞扩增倍数的变化. 结果: MSCS联合细胞因子组较其他组培养体系对有核细胞总数、CFCs含量及CD34 细胞含量均具有明显的扩增作用,分别扩增了114.2±2.4, 40.5±8.6, 11.3±0.4 倍. 结论: 成人MSCS协同其他细胞因子可增强脐血CD34 细胞的体外扩增作用.     

CD34+HPC来源的树突状细胞体外扩增和功能研究

目的研究脐血CD34^ HPC体外扩增诱导产生功能性树突状细胞(DCs)的有效方案。方法Ficoll分离脐血获得单个核细胞。免疫磁珠阳性分选CD34^ HPC,^sH^-TdR检测DCs激发异体T细胞增殖的能力。MTT法检测特异性CTL的杀伤能力。结果SCF FL GM—CSF IL-4诱导生成的DCs激发T细胞增殖和特异性CTL的杀伤能力均高于其他组。结论SCF FL GM—CSF IL-4可有效扩增CD34^ HPC并诱导产生功能性DCs。     

脐血CD34^＋细胞体外扩增的实验研究

目的 探讨脐血造血细胞体外扩增及其移植的最佳时期。方法 用免疫磁珠法分离纯化人脐血CD34^ 细胞,从CD34^ 细胞不同体外培养系中取样检测细胞总数、CD34^ 细胞百分率和ＣＦＣ（包括ＣＦＵ－ＧＭ和ＢＦＵ－Ｅ）。结果 Ａ组（加rhSCF、rhIL-3、rhG-CSF、rhＴＰＯ）与Ｂ组（加rhFL、rhＩＬ－3、rhG-CSF、rhEpo及rhTPO)对各阶段造血细胞扩增效果无显差异。Ｃ组（加rhSCF、rhCSF与rhFL有明显的协调效应;培养７d时开始增多,培养１４d进入高峰。培养２１d开始下降。培养２８d明显下降。结论 Ｃ组能明显扩增人脐血造血细胞,培养７－１４d造血细胞达高峰。为移植最佳时间。     

体外培养与扩增对脐血CD34^＋细胞及HLA抗原表达的影响

采用免疫组织化学方法,观察脐血细胞体外培养与扩增前后ＣＤ３４＾＋细胞的比例以及ＨＬＡ抗原的表达。结果表明：脐血ＣＤ３４＾＋细胞的百分比以及ＨＬＡ抗原的表达于达体外培养前后无显著性变化（Ｐ〉０．０５）,而在细胞因子的联合作用下,经一定时间的扩增后,ＣＤ３４＾＋细胞百分比下降（Ｐ〈０．０１）,ＨＬＡ抗原的表达有一定程度的提高。提示：体外扩增对脐血ＣＤ３４＾＋细胞的比例以及ＨＬＡ抗原的表达有一定的影响,     

G-CSF动员的外周血与骨髓CD34+细胞黏附分子的表达

目的：研究黏附分子在外周血干细胞动员机制中的作用。 方法：应用流式细胞仪检测粒细胞集落刺激因子G-CSF动员的外周血细胞与骨髓CD34⁺细胞表达的黏附分子非常延迟抗原4(VLA-4)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)和L-选择素(CD62L)。 结果：G-CSF动员后的外周血CD34⁺细胞表达的VLA-4、LFA-1与骨髓CD34⁺细胞相比明显减少,CD62L无明显改变。 结论：黏附分子VLA-4及LFA-1降低可能是G-CSF动员造血干细胞进入外周血过程中的一个重要环节。     

脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

Separation of CD34 positive cells and determinationof surface homing antigen

Immunomagnetic beads were magnetic particlescoated with-monoclonal antibody. They could specifi--.cafly combine with target substances and enable thelatter to respond to magnetism. When they were putinto a magnetic field, the magnetic beads binding thetarget substances were retarded thereby being separated from other elements. Matters of interest couldbe purified and enriched by this technique. Themethod has been used to separate different kinds of 'bone marrow (BM) and blood cells, tumor cel…     

细胞因子介导的体外扩增对脐血干/祖细胞粘附分子表达的影响

目的：比较脐血（CB）AC133^ 细胞扩增前后CD34^ 细胞亚群表面归巢相关粘附分子VLA－4（CD49d),VLA-5(CD49e),LFA-1(CD11a),L-selectin(CD62L)和PECAM－1（CD31）等的表达情况,以评价细胞因子介导的体外扩增对干／祖细胞（HSPC）归巢功能的影响。方法：将从新鲜CB标本中纯化的AC133^ 细胞接种于无血清基QBSF－60的无基质悬浮体系培养扩增14d,加入早期作用因子FL,SCF和TPO组合（FST）,并在接种0d时添加一剂IL－3,分别于培养0,7,10和14d检测扩增有和上述几种粘附分子的表达情况。结果：（1）在14d的培养扩增中,各阶段的HSPC均得到有效扩增,至14d时AC133^ 和CD34^ 细胞分别增加33．50和64．56倍;（2）表达上述粘附分子的各CD34^ 细胞亚群均有不同程度（约20－160倍）的扩增;（3）扩增后CD34^ 细胞表达的粘附分子CD11a,CD49e和CD49d的表达与原代CD34^ 细胞持平或上升,而CD62L和CD31的表达则有不同程度的下调。结论：我们建立的短期培养体系不仅可以支持CB HSPC的有效扩增,而且扩增后HSPC总体上保持原有的归巢相关粘附分子的表达。     

CD34抗原在小鼠造血基质细胞的表达及其意义

目的 了解造血基质细胞CD34抗原的表达情况并探讨其可能的意义。方法 用RT－PCR、斑点杂交和原位杂交的方法检测了BALB／C小鼠骨髓原代培养的基质细胞、传代培养的基质细胞及小鼠胚胎基质细胞系NIH3T3细胞CD34的表达。结果 传代培养的小鼠骨髓基质细胞CD34为强阳性表达，原代培养的骨髓基质细胞则表达很弱，NIH3T3细胞的表达强度介于前两者之间。结论 造血基质细胞也有强弱不等的CD34抗原的表达，其表达量的差别是否可能与造血基质细胞的增殖能力、细胞组成及其体外支持造血的能力等相关，有待进一步研究证实。     

CD34+细胞体外定向诱导分化的实验研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对CD34+细胞体外定向诱导分化作用.方法:应用阴性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC),在液体培养体系加入不同组合细胞因子对CD34+细胞进行诱导,检测细胞总数、CD71+细胞和CD15+细胞比例及粒单系祖细胞和红系祖细胞扩增数量.结果:液体培养体系中,以FL+Tpo+SCF+IL-3+Epo细胞因子组合对CD34+细胞向红系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD71+细胞比例为61.20%±5.31%,BFU-E、CFU-E分别扩增27.12±3.95和30.65±40.26倍.以FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF细胞因子组合对CD34+细胞向粒系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD15+细胞比例为56.18%±6.57%,CFU-GM扩增29.87±10.52倍.结论:合理组合生长因子,可定向诱导CD34+细胞生成大量血细胞,将有助于满足临床应用的需要.     

不同组合方式的细胞因子对人骨髓AC133+和CD34+细胞增殖的影响

目的：探讨细胞因子不同的组合方式对人骨髓CD34⁺富集细胞及AC133⁺富集细胞体外扩增潜能的影响。方法：常规富集人骨髓CD34⁺及AC133⁺细胞,应用本研究组设计并已经证实的细胞因子组合方式,对人骨髓CD34⁺及AC133⁺富集细胞进行体外对照培养,分别观察CD34⁺和AC133⁺富集细胞的扩增情况;应用甲基纤维素半固体培养法,观察不同组别培养7、14、21d CD34⁺和AC133⁺富集细胞的集落形成情况及细胞凋亡率。结果：AC133⁺细胞实验组在相同条件下细胞扩增倍数以及集落生成数目上均明显高于CD34⁺细胞实验组,相同条件下细胞凋亡率明显低于CD34⁺细胞实验组。结论：AC133⁺细胞包含有更多原始的造血干细胞,AC133作为造血干细胞抗原标记明显优于CD34。     

脐血CD34+细胞向巨核细胞的分化扩增及基因的表达变化

目的研究脐血CD34+细胞向巨核细胞的诱导分化及体外扩增,并观察此过程中巨核细胞特异性基因表达的变化。方法免疫磁珠法分离获得CD34+细胞培养在无血清无基质培养基中,采用TPO+SCF+IL 3+IL 6、 TPO+SCF+IL 3、 TPO+SCF三种不同因子组合对其诱导分化及扩增。收集3、7、10、14?d的扩增产物,运用荧光显微镜检测巨核细胞的表面标志;流式细胞术（FCM）检测巨核细胞的凋亡;对巨核细胞进行DNA含量检测以及荧光定量PCR检测特异性基因表达的变化。结果分离获得的CD34+细胞在体外可以有效扩增,随培养时间的延长,CD34+/CD41+细胞数第7天达最高值,之后逐渐下降;而CD41+、CD42b+、CD61+细胞随培养时间的延长表达量逐渐增高。DNA含量检测发现,随着培养天数的增加,多倍体细胞所占的百分比增加。三种因子组合中TPO+SCF+IL 3+IL 6组扩增效率最高。荧光定量PCR显示转录因子GATA 1、NF E2、TXS、GPIIb和HPRT在第7天表达量最高,之后下降。凋亡转录因子APAF 1随培养天数的延长表达量增加。结论脐血CD34+细胞在体外可向巨核细胞诱导分化及扩增,其基因表达的变化也支持这一结论。     

层流流体剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响

目的本实验系在考察层流剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响作用。方法从脐血中分离出CD34＋细胞,接种入实验室自制的层流剪切力实验装置中,在不同大小的层流流体剪切力（0.5,1,2,4dyn/cm2）加载下进行体外扩增培养。结果较小的层流剪切力（0.5,1dyn/cm2）可促进造血干/祖细胞扩增,有利于早期造血干/祖细胞的维持,并能促进更多的细胞由G0/G1期进入S期 较大的层流剪切力（2,4dyn/cm2）抑制了造血干/祖细胞的扩增,导致其迅速分化 并使S期细胞的比例减小。结论在生物反应器体外扩增培养脐血CD34＋细胞时,其层流流体剪切力应控制在1dyn/cm2范围内。