食管癌细胞中T钙黏蛋白基因启动子区异常甲基化的研究

目的 探讨食管癌细胞中T钙黏蛋白( T-cadherin)基因启动子区甲基化状态,以及5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用对食管癌细胞生长、侵袭以及T-cadherin基因甲基化状态与表达的影响.方法 采用甲基化特异性PCR分析经5-Aza-CdR处理前后食管癌细胞EC1和EC109中T-cadherin启动子甲基化状态,Western印迹检测经5-Aza-CdR处理前后两种细胞中T-cadherin蛋白表达,以MTT比色法与侵袭实验测定细胞增殖与侵袭能力的变化.结果 EC1和EC109细胞中T-cadherin基因启动子区域存在异常甲基化现象,经5-Aza-CdR作用后可逆转启动子异常甲基化,显著上调食管癌细胞中T-cadherin的蛋白表达,同时显著抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭能力(P＜0.01).结论 启动子区异常甲基化是导致食管癌细胞中T-cadherin表达水平下调的重要机制,应用5-Aza-CdR可恢复T-cadherin表达并抑制肿瘤细胞的恶性表型.     

5-杂氮-2’-脱氧胞苷对BGC823胃癌细胞株RIZ1基因去甲基化转录调控作用

目的:探讨5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdB)对人胃癌细胞系BGC823细胞株RIZ1基因的去甲基化转录调控作用及对细胞株生长增殖的影响,寻找胃癌治疗的新靶点.方法:使用3种不同浓度5-Aza-CdR干预胃癌BGc823细胞,甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCB)检测药物干预前后RIZ1基因的甲基化状态和RIZ1 mBNA的表达;MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果:未经5-Aza-CAR处理的BGC823细胞中MZ1基因启动子区域cpG岛高甲基化,且RIZ1 mRNA不表达,经2,5,10 μmol/L 5-Aza-CdB处理48 h后,RIZ1基因启动子区域高甲基化得到逆转,细胞中均有RIZ1 mRNA表达,相对定量值分别为0.509,0.716,0.831;3种浓度5-Aza-CdR处理BGC823细胞后,与对照组比较,细胞增殖速度出现不同程度减慢(P<0.05),随着浓度的增加其抑制作用增强;并显著抑制BGC823细胞生长周期,与对照组相比,G0/G1期细胞数增加,S期细胞数减少,细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论:5-Aza-CdR能有效逆转胃癌BGC823细胞RIZ1基因的异常甲基化,从而激活因高甲基化导致RIZ1基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,抑制肿瘤细胞生长.     

5-Aza-CdR体外诱导人肺癌细胞株p16基因去甲基化

目的观察人肺癌细胞株H719p16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导H719细胞株高甲基化失活的pl6基因重新表达的可能性。方法MSP法检测体外培养的人肺癌细胞株p16基因启动子区甲基化状态,并应用不同浓度的5-Aza-CdR处理人肺癌细胞株H719,MSP法检测用药后细胞中p16基因的甲基化状态,并用RT-PCR方法及Western Blot方法检测用药前后细胞中p16基因mRNA和蛋白水平变化。结果p16基因在人肺癌细胞株H719中启动子区呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA及蛋白恢复表达。结论启动子区异常甲基化是人肺癌细胞株p16基因失活的可能原因,5-Aza-CdR能逆转p16基因甲基化状态。     

上皮性钙黏素及其基因启动子区甲基化与葡萄胎恶变关系

目的研究上皮性钙黏素(E-cadherin)及其基因启动子区CpG岛甲基化在葡萄胎恶变中的作用,探讨去甲基化制剂5′-氮杂-2′脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导绒癌细胞株中E-cadherin基因恢复表达的可能性。方法采用免疫组化SP法,检测10例正常早孕绒毛和37例葡萄胎组织中E-cadherin的表达。采用甲基化特异性PCR(MSP)检测正常早孕绒毛、非恶变葡萄胎、恶变葡萄胎及绒癌细胞株JAR中E-cadherin基因CpG岛的甲基化状态,并用RT-PCR检测绒癌细胞株JAR经5-Aza-CdR处理后E-cadherin mRNA表达。结果正常早孕绒毛、非恶变葡萄胎、恶变葡萄胎组织E-cadherin蛋白表达阳性率及甲基化率分别为100%、90.00%、41.18%和0、15.00%、41.18%,差异均有显著性(χ2=12.903、4.573,P0.05)。E-cadherin蛋白表达在甲基化组低于非甲基化组(Ken-dall tau-b=0.769,P0.05),且恶变葡萄胎组织中E-cadherin基因甲基化率与解剖学分期、预后评分有关(Kendalltau-b=-0.757、-0.663,P0.05)。在JAR细胞株中E-cadherin基因启动子区呈甲基化状态,且其mRNA弱表达,经5-Aza-CdR处理后的JAR细胞株E-cadherin mRNA表达明显增强。结论 E-cadherin基因启动子区过度甲基化可能是E-cadherin失活的机制之一,与葡萄胎的恶性进展有关。5-Aza-CdR能逆转JAR细胞株中E-cadherin基因甲基化状态,从而恢复E-cadherin基因的转录活性。     

胃癌细胞对TRAIL的敏感性与caspase-8基因甲基化状态的关系

目的探讨caspase-8基因启动子区5′CpG岛甲基化状态与TRAIL抗癌作用的关系.方法采用甲基化特异PCR方法检测5种胃癌细胞株caspase-8基因启动子区的甲基化状态;采用MTT方法检测TRAIL蛋白的抗癌活性.结果 5种胃癌细胞株对TRAIL的敏感性不尽相同,caspase-8基因启动子区均为非甲基化状态;5-Aza-CdR处理可提高耐药细胞对TRAIL的敏感性,但不影响胃癌细胞的甲基化状态.结论 5-Aza-CdR可提高多数胃癌细胞对TRAIL的敏感性,胃癌细胞对TRAIL的敏感性与caspase-8基因甲基化状态无关.     

胃癌中IRX1的表达与启动子区甲基化的相关性

目的探讨胃癌中同源盒基因IRX1的表达与启动子区甲基化修饰之间的关系。方法生物信息学软件分析IRX1基因启动子区;RT-PCR检测胃癌细胞株及手术切除胃癌组织IRX1基因mRNA表达水平;MSP及BSP法检测启动子区甲基化状态;检测去甲基化试剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷的干预对胃癌细胞IRX1基因表达的逆转效应。结果经生物信息学预测IRX1基因转录起始点上游启动子区富含CpG岛;胃癌细胞株及胃癌组织IRX1基因表达有不同程度下调;MSP及BSP检测显示所有胃癌细胞株启动子区呈高甲基化状态;经5-Aza-CdR处理的细胞株IRX1基因的表达有不同程度上调。结论胃癌中IRX1基因的表达下调与启动子区甲基化修饰有一定关系,为探讨IRX1基因作为去甲基化治疗靶点的可能性提供了实验数据。     

５ 氮杂 ２′ 脱氧胞苷诱导肝癌细胞株ＳＬＩＴ２基因去甲基化的实验研究

目的：观察肝细胞癌（HCC）细胞株SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B及epG2中SLIT2基因在5-Aza-CdR作用后,其启动子区甲基化状态及表达的变化,探讨HCC细胞株中SLIT2基因调控规律及甲基化调节抑制剂5-Aza-CdR对SLIT2基因转录的影响。方法对上述 HCC 细胞株体外培养,MSP法检测 HCC 细胞株中 SLIT2启动子相关区域的甲基化状况。应用10 mmol／L浓度的5-Aza-CdR处理体外培养的5种HCC细胞后,MSP法检测用药前后细胞中SLIT2基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞中SLIT2 mRNA的变化。结果 SLIT2基因在各细胞株中启动子区呈异常高甲基化状态,mRNA低表达。经过5-Aza-CdR处理后,SLIT2基因启动子区呈显著去甲基化状态,其mRNA表达增强。结论启动子区异常甲基化是HCC细胞SLIT2基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能逆转SLIT2基因甲基化状态,从而调控SLIT2基因表达。     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷抑制人鼻咽癌CNE细胞生长的机制

目的探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)抑制人鼻咽癌CNE细胞系生长增殖的机制,寻找鼻咽癌治疗的新靶点。方法用5-Aza-CdR处理人鼻咽癌CNE细胞,应用MTT试验观察不同浓度的5-Aza-CdR对癌细胞生长增殖的影响。用甲基化特异性PCR(MSP)分析死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因甲基化状态;逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、流式细胞仪检测用药前后DAPK mRNA、蛋白的表达情况及细胞凋亡和细胞周期的变化。结果从CNE细胞生长曲线知各浓度的5-Aza-CdR对细胞生长均有抑制作用。未经5-Aza-CdR处理的CNE细胞中DAPK基因CpG岛过甲基化,且DAPK mRNA不表达。经5-Aza-CdR处理后,甲基化的DAPK基因部分去甲基化,用药组的细胞中均有DAPK mRNA表达,且表达随药物浓度增高而增强。免疫细胞化学结果显示,经药物处理后的CNE细胞中DAPK蛋白表达呈阳性,而对照组不表达。流式细胞分析结果显示,药物处理后细胞凋亡率明显增加,且G0/G1期细胞增加,G2/M期减少。结论5-Aza-CdR对体外培养的鼻咽癌细胞生长增殖的抑制作用,可能是由于其能使因甲基化而失活的DAPK基因再转录,诱导该基因重新表达的结果。     

5-Aza-CdR对肾细胞癌Caki-1细胞生长及E-钙黏蛋白基因表达的影响

目的:研究甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肾细胞癌细胞株Caki-1增殖抑制作用、对E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)甲基化状态及E-cad蛋白状态的影响。方法:不同浓度5-Aza-CdR处理肾细胞癌细胞株Caki-1后,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验观察细胞经药物处理前后的生长活性;甲基化特异性PCR(methylationspecial PCR,MSP)检测细胞处理前后E-cad基因的甲基化状态;蛋白质印迹法检测5-Aza-CdR处理细胞前后E-cad蛋白的表达。结果:5-Aza-CdR能抑制肾细胞癌细胞株Caki-1的增殖;未经药物处理组的基因高甲基化,经10-6mol/L5-Aza-CdR处理72 h,E-cad基因启动子区域高甲基化得到逆转,同时E-cad蛋白表达也得到增强。结论:5-Aza-CdR能够有效逆转Caki-1细胞E-cad基因的异常甲基化,恢复E-cad蛋白表达。     

5-杂氮-2''-脱氧胞苷抑制人鼻咽癌CNE细胞生长的机制

目的 探讨5-杂氮-2‘-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)抑制人鼻咽癌CNE细胞系生长增殖的机制,寻找鼻咽癌治疗的新靶点.方法 用5-Aza-CdR处理人鼻咽癌CNE细胞,应用MTT试验观察不同浓度的5-Aza-CdR对癌细胞生长增殖的影响.用甲基化特异性PCR(MSP)分析死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因甲基化状态;逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、流式细胞仪检测用药前后DAPK mRNA、蛋白的表达情况及细胞凋亡和细胞周期的变化.结果 从CNE细胞生长曲线知各浓度的5-Aza-CdR对细胞生长均有抑制作用.未经5-Aza-CdR处理的CNE细胞中DAPK基因CpG岛过甲基化,且DAPK mRNA不表达.经5-Aza-CdR处理后,甲基化的DAPK基因部分去甲基化,用药组的细胞中均有DAPK mRNA表达,且表达随药物浓度增高而增强.免疫细胞化学结果显示,经药物处理后的CNE细胞中DAPK蛋白表达呈阳性,而对照组不表达.流式细胞分析结果显示,药物处理后细胞凋亡率明显增加,且G0/G1期细胞增加,G2/M期减少.结论 5-Aza-CdR对体外培养的鼻咽癌细胞生长增殖的抑制作用,可能是由于其能使因甲基化而失活的DAPK基因再转录,诱导该基因重新表达的结果.     

卵巢上皮性癌中RIZ1基因表达缺陷的意义及其与甲基化的关系

目的:研究抑癌基因RIZ1在卵巢上皮性癌组织及卵巢癌细胞系中的表达变化,分析其表达变化与甲基化的关系。方法:以卵巢癌组织及卵巢癌细胞系为研究对象。RT-PCR检测RIZ1 mRNA水平;MSP检测RIZ1基因甲基化状况;蛋白印迹检测RIZ1蛋白表达。结果:卵巢癌组织、卵巢癌细胞系及正常卵巢组织中RIZ1 mRNA相对含量的平均值分别为0.32±0.14,0.26±0.11和1.17±0.08。RIZ1蛋白相对含量的平均值分别为0.38±0.11,0.34±0.06和1.56±0.14。卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中RIZ1的甲基化率分别为25.8%、20%。卵巢癌组织、卵巢癌细胞系分别与正常卵巢组织比较,RIZ1基因的表达差异均有统计学意义(P<0.05);存在甲基化的卵巢癌组织及细胞系中,RIZ1基因表达缺失或下降。5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理RIZ1基因发生甲基化的卵巢癌细胞系后,RIZ1基因重表达;且去甲基化处理后,卵巢癌细胞生长均减慢。结论:RIZ1基因表达缺陷与卵巢癌的发生有关,DNA甲基化是其表达缺陷的原因之一;去甲基化处理可使RIZ1基因重表达,并抑制卵巢癌细胞的增殖。     

CDH13基因在乳腺癌细胞株MCF-7中表达及甲基化调控

目的探讨5-氮杂-2＇脱氧胞嘧啶（5-aza-2＇-deoxycytidine,5-Aza-CdR）诱导CDH13阴性人乳腺癌细胞株MCF-7中CDH13基因去甲基化后恢复表达情况及其功能状态。方法 5-Aza-CdR作用乳腺癌细胞株MCF-7后,MTT法及FCM法检测对细胞增殖和周期的影响。RT-PCR检测5-Aza-CdR对CDH13阴性人乳腺癌细胞MCF-7中CDH13表达的影响。结果 5-Aza-CdR能明显抑制MCF-7细胞生长,细胞周期阻滞在G0/G1期,恢复CDH13在MCF-7细胞株中表达。结论 CDH13启动子甲基化导致细胞株MCF-7中CDH13表达沉默,5-Aza-CdR能重新激活CDH13阴性乳腺癌细胞株MCF-7细胞中CDH13表达,抑制MCF-7细胞增殖,这可能是其引起乳腺癌细胞株MCF-7生物学行为改变的机制之一。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷逆转RASSF1A基因甲基化对人乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的：探讨启动子甲基化对乳腺癌MCF-7细胞RASSF1A基因的作用及5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）干预对启动子甲基化的影响,为临床治疗乳腺癌奠定理论基础.方法：用1,3,5,7,9μmol/L不同浓度的5-Aza-CdR处理MCF-7乳腺癌细胞株,通过MTT检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株存活率的影响;建立5μmol/L,10μmol/L的浓度梯度流式细胞仪检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株生长周期及凋亡率的影响,MSP（甲基化PCR）检测5-Aza-CdR处理前后RASFF1A抑癌基因的甲基化状态,RT-PCR检测处理前后抑癌基因RASSF1A mRNA表达情况.结果：5-Aza-CdR抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞,诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和细胞周期停滞在G0/G1期,呈浓度依赖性.经5-Aza-CdR处理人乳腺癌MCF-7细胞后,MSP检测RASSF1A基因发生了甲基化,RT-PCR检测RASSF1A mRNA恢复了表达.结论：RASSF1A基因启动子甲基化是导致其失活的主要原因,5-Aza-CdR可以逆转乳腺癌细胞株MCF-7细胞RASSF1A基因启动子甲基化状态,使其重新表达．     

5-Aza-CdR对膀胱癌EJ细胞系生长及Apaf-1基因异常甲基化的影响

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2-′deoxyc ityd ine,5-Aza-CdR）对体外培养的膀胱癌EJ细胞增生、细胞周期影响及其对此细胞株中Apaf-1基因的甲基化状态的影响。方法不同浓度5-Aza-CdR处理体外培养膀胱癌EJ细胞后,用MTT法检测药物处理24、48、72 h后的细胞增殖活性;PI染色和流式细胞仪检测药物处理72 h后的细胞周期分布;MSP法检测用药前后细胞中Apaf-1基因的甲基化状态;Real-time RT-PCR法检测用药前后细胞中Apaf-1的mRNA表达变化。结果2×10^-6、5×10^-6、1×10^-5mol/L 5-Aza-CdR处理膀胱癌EJ细胞24、48、72 h后,细胞增生受到抑制,有时间和剂量依赖性。流式细胞仪分析表明,不同药物浓度处理EJ细胞72 h后细胞增殖指数降低明显：5×10^-6、1×10^-5mol/L组分别为（34.09±0.79）、（28.55±1.76）,与对照组（42.78±1.23）相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。在5-Aza-CdR处理前未检测到膀胱癌EJ细胞系的Apaf-1基因的mRNA表达,经过5-Aza-CdR处理后,Apaf-1基因在膀胱癌EJ细胞系中甲基化状态得到了逆转,Apaf-1基因的mRNA重新表达。结论5-Aza-CdR对膀胱癌EJ细胞具有增生抑制作用;Apaf-1基因的表达情况与其甲基化状态的改变有关。