体外培养的人脂肪间充质干细胞生物学特性的研究

目的:了解体外培养的人脂肪间充质干细胞的生物学特性及其体外成脂和成骨的能力.方法:体外培养人脂肪间充质干细胞并传代计数,行成骨和成脂诱导,流式细胞仪检测其细胞增殖周期与表面分子.结果:人脂肪干细胞经过体外培养均一的阳性表达CD44、CD106,而CD49d、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G 2/M所占比例分别为79.1%、19.7%和1.3%.分离细胞在诱导体系下可以向成骨和成脂方向分化.结论:脂肪间充质干细胞具有特殊的生物学特点,体外能够向成骨和成脂方向分化.     

高成脂脂肪干细胞系的分子克隆筛选

目的 探讨并筛选具备高成脂能力的脂肪干细胞系表面标志、可应用于脂肪组织工程的种子细胞,以提高组织工程化脂肪的构建效率.方法 胶原酶消化人脂肪组织,获得脂肪干细胞,培养扩增后成脂诱导,收集诱导成熟的脂肪细胞,天花板贴壁培养得到去分化脂肪细胞.比较去分化脂肪细胞与人脂肪干细胞的增殖能力,成脂分化能力及表面抗原表达的变化.结果 去分化脂肪细胞与脂肪干细胞的形态和增殖能力相似;去分化脂肪细胞的成脂分化能力高于脂肪干细胞;两种细胞表面抗原的表达大致相同,但去分化脂肪细胞的CD54的阳性表达高于脂肪干细胞.结论 CD54的表达可能与去分化脂肪细胞的高成脂分化能力密切相关,可能是高成脂系干细胞的特异性表面抗原标志.     

不同冻存方法对大鼠脂肪来源干细胞生物学特性的影响

目的：研究不同冻存方法对脂肪来源干细胞（Adipose-derivedstemcells,ADSCs）生物学特性的影响。方法：体外分离培养SD大鼠腹股沟及附睾周围的脂肪组织，取第三代ADSCs冻存于液氮。实验分为三组：对照组A组为非冻存细胞，B组使用无血清非程序冻存液冻存细胞，C组使用传统冻存液（DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1）冻存细胞。12个月后复苏ADSCs，通过对比ADSCs的表面抗原、细胞凋亡、增殖及成骨分化情况，分析各组ADSCs生物学性能的差异。结果：各组细胞高表达CD29、CD90;A、B两组细胞的凋亡率显著低于C组（P<0.05）;B、C两组的增殖情况和A组相比，差异无统计学意义（P>0.05）,B组细胞的成骨分化能力要优于C组（P<0.05）。结论：无血清非程序冻存液冻存ADSCs的效果要优于传统冻存液。     

骨质疏松小鼠模型骨髓间充质干细胞特性的研究

目的 探讨骨质疏松小鼠模型骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells ,MSCs）生物学特性的改变。方法 通过皮下注射地塞米松构建小鼠骨质疏松动物模型（OP组）,同时设立对照（NC组）,分离OP组及NC组骨髓MSCs进行体外培养;通过流式细胞术检测细胞表面分化抗原;运用CKK-8实验检测细胞增殖活力;通过脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡水平;运用碱性磷酸酶（ALP）活性检测、油红O染色及Western blot法检测两组细胞成骨分化及脂肪分化能力。结果 经过骨组织学检测证明模型建立成功,体外培养OP组及NC组骨髓MSCs细胞形态无差异。OP-MSCs细胞表面分化抗原Scal1及CD44为阳性, CD34及CD11b为阴性,与NC-MSCs相似,但OP-MSCs增殖活力下降（P<0.05）;此外两组细胞凋亡水平类似（P>0.05）。成骨分化诱导7 d后OP-MSCs的ALP活性显著低于对照组（P<0.01）,21 d后矿化小结明显减少（P<0.001）;脂肪分化诱导8 d后OP-MSCs形成更多脂滴（P<0.05）。Western blot结果显示OP-MSCs在成骨分化中低表达转录因子Runx2（P<0.05）及Osterix (P<0.001）,但在脂肪分化早期高表达PPARγ（P<0.001）及C/EBPα（P<0.01）。结论 骨质疏松小鼠骨髓MSCs的增殖及分化潜能显著下降。     

人瘢痕角质形成细胞原代培养中胰酶配方及浓度的探讨

目的:研究不同配方及浓度的胰蛋白酶对人瘢痕角质形成细胞(Ker at i nocyt e,K)生物活性影响。探索一种更适于瘢痕角质形成细胞原代培养消化的方法。方法:温消化法分离瘢痕组织表皮、真皮后,分别采用0.1%胰蛋白酶和0.05%胰蛋白酶-0.025%EDTA对表皮片进行消化,培养角质形成细胞,用台盼蓝染色法和24h细胞贴壁率观察K存活率及细胞活性。结果:两种配方胰酶消化K,细胞存活率均达80%以上,结果无统计学差异(P>0.05)。与单独使用胰蛋白酶相比,经胰蛋白酶-EDTA组消化后的细胞贴壁率增加,结果有统计学差异(P<0.05)。结论:胰蛋白酶-EDTA能较温和地消化角质形成细胞,较大程度地保留细胞活性,与胰蛋白酶消化法相比,此方法更适合K的消化及培养。     

组织工程学黄韧带干细胞的筛选与鉴定

【摘要】 目的：通过Fibronectin介导进行差别粘附法筛选出人黄韧带干细胞并进行鉴定,探讨其作为组织工程种子细胞的可行性。方法：从椎间孔镜或椎间盘镜微创手术中获取10例人黄韧带标本,机械-酶消化法联合获取原代细胞,扩增第二代后接种于Fibronectin包被过的培养瓶。流式细胞仪检测细胞表面特异性标志物。免疫组化方法测定干细胞表达相关特异性蛋白。使用干细胞诱导培养基（实验组）向成骨、成脂、成软骨多向诱导分化,使用常规生长培养基培养者作为阴性对照（对照组）,分别行茜素红染色、油红O染色、阿利辛兰染色鉴定。PT-PCR检测成骨、成脂肪、成软骨基因表达。取同一患者的髂骨骨髓提取骨髓间充质干细胞,统计学分析黄韧带干细胞与骨髓间充质干细胞的细胞周期、增殖能力和干性基因表达差异。结果：原代细胞形态呈三角形或多角形,经Fibronectin介导粘附培养后形态比较均一,呈长梭形克隆群。流式细胞仪检测筛选后的黄韧带干细胞CD90、CD73阳性率＞96.8%,CD105阳性率＞95.9%,而stro-1为阴性。实验组茜素红染色呈强阳性,油红O染色可见大小不等脂滴呈红色,阿利辛兰染色大量蛋白聚糖聚集呈蓝色,对照组均为阴性。PT-PCR测定实验组成骨基因（OC、ALP、RUNX-2）、成脂肪基因（LPL、APP、PPAR2）、成软骨基因（COL Ⅱ、AGG、SOX9）显著上调,其中RUNX-2在对照组有低水平表达。免疫组化显示黄韧带干细胞和骨髓间充质干细胞均表达a-SMA、Ⅰ型胶原、纤连蛋白,但均不表达Ⅱ型胶原。两种干细胞均超过80%的细胞比例处于G0/G1期提示都有很强自我更新能力（P>0.05）。CCK-8检测不同时间点两种细胞的增殖能力,在第1～10天时OD值逐渐增加,第10～14天达稳定状态,二者有相似的增殖能力（P>0.05）。两种干细胞均表达干性基因NONAG、OCT-4、SOX2,组间差异无显著性（P>0.05）。结论：通过Fibronectin差别粘附筛选法可有效筛选纯化出黄韧带干细胞,其可向成骨、成脂、成软骨多向分化,为组织工程技术治疗退变椎间盘提供了新的种子细胞。     

人脂肪间充质干细胞冻存方法的改进

目的：探索理想的冷冻人脂肪间充质干细胞的方法。方法：采用常规方法体外培养并扩增人脂肪间充质干细胞,消化细胞并洗涤离心加入10%二甲基亚砜、30%胎牛血清、60%MEM的细胞冻存体系,直接置-70℃冰箱贮存。冻存4、8和12周后,37℃水浴复温,通过检测细胞周期﹑细胞表型和成脂的多向分化潜能,以鉴定该方法的可行性。结果：消化后不经过传统的程序性降温冻存技术,直接在-70℃冰箱贮存,其细胞生物学特性无明显改变,细胞仍存在成脂的多向分化潜能。结论：人脂肪间充质干细胞悬液直接-70℃冰箱贮存不影响其生物学特性,是冷冻保存的一种可行方法。     

乳腺癌干细胞含量及其耐药相关蛋白表达的临床病理意义

目的：探讨乳腺癌中癌干细胞含量与临床病理参数的关系,以及P-糖蛋白（P-gp）,谷胱甘肽S转移酶π（GST-π）,肺耐药蛋白（LRP）和拓扑异构酶II（TOPO-II）在乳腺癌干细胞和分化细胞中的表达及其意义。 方法：选取乳腺浸润性导管癌新鲜标本30例制备成单细胞悬液,通过免疫磁珠两步法从中分离出癌干细胞（CD44+/CD24-细胞）和分化细胞（CD24+和CD44-CD24-细胞）并计数,分析癌干细胞含量与乳腺癌患者临床病理参数的关系;应用免疫细胞化学方法检测以上两种细胞P-gp,GST-π,LRP和TOPO-II的表达情况。 结果：乳腺癌干细胞含量与患者的年龄、肿块大小、组织学分级及淋巴结转移均无明显关系（均P>0.05）。乳腺癌干细胞P-gp的阳性表达率明显高于分化细胞（73.3% vs. 40.0%）,而TOPO-II的阳性表达率明显低于分化细胞（40.0% vs. 76.7%）（P<0.05或P<0.01）;GST-π和LRP的表达在两种细胞间无统计学差异（均P>0.05）。 结论：乳腺癌干细胞含量与患者的临床病理参数无关,但乳腺癌干细胞中P-gp高表达与TOPO-II低表达可能是导致乳腺癌化疗失败和复发的重要原因。     

脂肪干细胞向软骨细胞方向诱导的初步研究

目的 :研究脂肪干细胞的分离及向软骨方向定向诱导的方法。方法 :从成年兔颈后部或腹股沟处脂肪组织取材 ,酶消化法分离、培养脂肪干细胞 ;免疫荧光测定CD3 4 抗原的表达 ;流式细胞仪测定CD3 4 抗原百分比 ;分别用15 %牛血清、少血清 (5 % )及无血清诱导培养基定向软骨细胞方向诱导 ;组化及免疫组化鉴定软骨细胞特性。结果 :从兔脂肪组织中能分离出生长旺盛的干细胞 ,CD3 4 抗原表达阳性 ,表达百分比与骨髓干细胞无明显差异 ;定向诱导后表现出软骨细胞的特性 ,诱导效果无血清诱导培养基效果最好。结论 :从兔脂肪组织中能分离出干细胞 ;生物学特性与骨髓干细胞相似 ;能向软骨细胞方向诱导 ;无血清诱导培养基效果最好。     

大鼠真皮多能干细胞分离培养及其多分化潜能特性

目的建立分离培养大鼠真皮来源多能干细胞（SKPs）的方法并探讨其生物学特性。方法0．25％中性蛋白酶（protease）选择性的消化表皮与真皮的细胞连接，剥离真皮，采用0．25％的胰蛋白酶消化真皮层细胞于超低黏附培养板中进行悬浮无血清培养，机械法传代，免疫荧光染色法检测细胞表面分子的表达，体外诱导其向脂肪细胞分化，研究其多分化潜能。结果体外培养2～3d后真皮多能干细胞聚集成球悬浮生长，培养4代后去除生长因子后并添加血清培养，细胞帖壁生长，呈长梭形成纤维样，免疫荧光染色显示，体外培养的真皮多能干细胞可表达CD29和Nestin，不表达CD34与vimentin。体外诱导实验结果显示体外培养的真皮多能干细胞能够被诱导成脂肪细胞，油红染色阳性。结论采用悬浮培养方法可成功分离培养大鼠真皮多能干细胞，培养的细胞可表达神经干细胞标志并具有多分化潜能。     

不同层次脂肪干细胞在裸鼠脂肪移植的比较研究

目的探讨静置后脂肪颗粒提取脂肪干细胞(PLA-ADSC)和静置后下层滤液提取的脂肪干细胞(LAF-ADSC)诱导裸鼠成脂的机制, 为细胞辅助的脂肪颗粒移植提供思路。方法 2019年6月至2021年3月, 于成都八大处医疗美容医院整形外科和成都市第三人民医院医学美容部手术室行正常人体的脂肪抽吸手术, 将通过手术获得的脂肪组织抽吸物静置, 得到上层脂肪颗粒组织进行消化、分离培养PLA-ADSC并鉴定;得到下层液体组织离心后取沉淀物, 沉淀物进行消化、分离培养LAF-ADSC并鉴定;比较PLA-ADSC和LAF-ADSC分化特性及其生长能力。动物实验分实验1组和实验2组, 将基质胶Matrigel移植至裸鼠体内设为对照组, 比较3组裸鼠体内的成脂能力。结果细胞实验结果显示, 静置后脂肪颗粒及下层滤液沉淀物提取细胞均能贴壁生长并顺利传代, 上述两种不同来源细胞均表达CD44、CD73、CD105, 阳性率分别为99.5%、99.99%、99.7%, CD19、CD31、CD45则为阴性表达。成脂诱导分化结果显示, 胞质内有脂滴形成, 细胞油红O染色后可见脂滴呈橘红色。动物实验结果显示, 移植后...     

Mesen PRO RS Medium对人脂肪干细胞增殖与分化的影响

目的探讨MesenPRO RS Medium对人脂肪干细胞增殖与分化的影响。方法应用MesenPRO RS Medium与DMEM＋10％FBS两种培养基培养人脂肪干细胞,比较两者在细胞形态、体外增殖能力、成纤维细胞集落形成（CFU—F）能力及多向分化潜能的差异。结果MesenPRO RS Medium培养的人脂肪干细胞具有良好的细胞形态,在增殖速度、细胞集落,以及成脂、成骨及成软骨能力等方面均优于DMEM＋10％FBS。结论MesenPRO RS Medium是人脂肪干细胞优良的培养基。     

脂肪干细胞诱导分化成淋巴管内皮样细胞的初步研究

目的 探讨利用血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C) (156s)等生长因子诱导脂肪干细胞成为淋巴管内皮样细胞的方法. 方法 取健康成人脂肪组织,胰酶消化法获得脂肪组织来源的间质干细胞(adipose-derived stem cell),通过流式细胞仪检测其表面标记,并进行成脂肪、成骨诱导等体外分化能力鉴定.取生长状态良好的P3代细胞进行诱导实验:设置含VEGF-C156 s、bFGF等生长因子的诱导液组为实验组,并设空白对照组(常规L-DMEM培养基).观察诱导前后两组细胞的形态变化,并于10 d后进行LYVE-1免疫荧光的鉴定. 结果 成功分离纯化脂肪干细胞,流式细胞结果显示,CD13、CD29、CD44、CD105高表达,CD31、CD34、CD45、HLA-DR极低表达,具有间充质干细胞特性;体外成脂和成骨能力鉴定也取得成功;在体外成功利用含VEGF-C156 s、bFGF等生长因子的诱导液将脂肪干细胞诱导为淋巴管内皮样细胞,实验组LYVE-1免疫荧光显色呈强阳性,而对照组则未见到阳性染色;荧光强度定量结果差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 利用含有VEGF-C156 s的诱导液可以将脂肪干细胞诱导分化为淋巴管内皮样细胞.     

人髌下脂肪垫干细胞的分离培养鉴定及初步研究

目的建立人髌下脂肪垫干细胞分离、培养和鉴定的平台，验证其可作为可靠的干细胞来源，并可作为细胞模型参与科学研究。 方法人髌下脂肪垫取自膝关节置换手术患者，经Ⅰ型胶原酶消化，在高糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)内扩增，取P5代细胞用于检测其"干性"及三向分化能力。与微尺度支架结合，通过RT－PCR检测成骨基因的表达，应用最小显著性差异法进行组间两两比较，用于验证微尺度支架的成骨诱导特性。 结果人髌下脂肪垫干细胞具备间充质干细胞相关特性，包括黏附贴壁性；成脂肪、成软骨及成骨分化；表达相关表面标记，如分化抗原簇(CD)73、CD90和CD105；不表达造血细胞系的分子表面标记，如c-kit、CD14、CD11b、CD34、CD45、CD19、CD79和人白细胞抗原(HLA)-DR。本课题中人髌下脂肪垫来源干细胞成功作为一种干细胞模型，证明HaCG微尺度支架具备成骨诱导特性，表现为三组中成骨基因ALP、COL1、Runx2表达差异有统计学意义(分别为F＝150，P<0.01；F＝68，P<0.01；F＝16，P<0.01)。HaCG微尺度支架组高于纯明胶微尺度支架组及二维培养组，纯明胶微尺度支架组高于二维培养组(P值均小于0.05)。 结论人髌下脂肪垫干细胞分离、培养和鉴定平台的建立，未来可作为细胞模型应用于多种不同实验。     

人脂肪组织来源干细胞体外增殖分化中端粒酶的表达

目的 探讨体外培养条件下人脂肪干细胞增殖和分化过程中端粒酶的表达水平,为其作为种子细胞的应用研究提供理论基础.方法 体外分离、培养人脂肪干细胞并传代,行流式细胞表面抗原分析,并用油红O染色及茜素红染色行成骨和成脂诱导分化的鉴定;采用TRAP法分别检测新鲜的不同时间培养的人脂肪干细胞和诱导分化为脂肪细胞的人脂肪干细胞的端粒酶活性.结果 脂肪干细胞具有向脂肪细胞、成骨细胞多向分化的能力,且表达干细胞相关表面标志物.新鲜分离和传代的脂肪干细胞,在体外培养12代内端粒酶活性呈阴性或低水平表达;一旦经过成脂诱导分化,细胞端粒酶活性表达上调,培养3～6 d后端粒酶活性开始出现逐渐降低.结论 用胶原酶消化法从脂肪抽吸术中得到的细胞主要是人脂肪干细胞;在体外培养增殖的过程中,人脂肪干细胞的端粒酶活性未见异常表达;成脂诱导分化早期人脂肪干细胞端粒酶活性增高,其后开始出现下降趋势.     

正常与退变髓核的髓核间充质干细胞代谢活性及干性基因表达的比较

【摘要】 目的：比较来源于正常与退变髓核的髓核间充质干细胞（NPMSCs）的细胞代谢活性及干性基因表达情况。方法：收集6例非退变患者髓核组织（正常组）与6例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织（退变组）,采用酶消化法分离细胞,应用标准间充质干细胞培养基（standard MSC culture medium）进行细胞培养并观察细胞形态。两组内各取1例分离得到的细胞进行流式细胞仪检测间充质干细胞表面蛋白分子标记CD90、CD105、CD73、CD45、CD34及人类白细胞抗原（HLA）-DR表达情况;并进行成骨、成脂及成软骨诱导分化,诱导28d后分别应用茜素红染色鉴定细胞成骨能力、油红O染色鉴定细胞成脂能力、甲苯胺蓝染色鉴定细胞成软骨分化能力,并按照国际干细胞治疗协会（ISCT）提出的间充质干细胞的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定。采用CCK-8检测两组P2代NPMSCs的代谢活力。提取两组每例P2代细胞总RNA,行RT-PCR检测P2代细胞“干性维持”相关基因Oct4及Nanog表达情况。结果：两组P0代细胞均贴壁生长,形态学方面两组并无明显差异。免疫表型鉴定显示正常组和退变组间充质干细胞表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96％、98％、95%以上,两组均低表达造血细胞标志物CD45、CD34、HLA-DR（均低于4%）。茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实正常组与退变组细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化。上述结果证实分离得到的细胞即NPMSCs。细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后5d、7d、9d、11d、13d正常组细胞活性均强于退变组,两组细胞活性有统计学差异（P<0.05）。正常组“干性维持”相关基因Oct4及Nanog表达量分别为退变组的4.63±1.17、7.36±1.19倍,正常组均明显高于退变组（P<0.05）。结论：正常与退变髓核组织内均存在NPMSCs,但正常椎间盘来源的NPMSCs具有较强的细胞代谢活性,较”强的“干性维持”基因表达。     

人腹膜中间充质干细胞生物学特性的初步研究

目的探讨人腹膜中是否含有间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC),并研究其生物学特性。方法腹膜取自接受胃大部切除及腹腔淋巴结清扫术的胃癌患者。将腹膜剪碎,Ⅰ型胶原酶消化后以低密度接种,2周后计算细胞群中成纤维细胞集落形成单位(Colony-forming unit-fibroblast,CUF-F)数量;流式细胞分析贴壁细胞表型;定向诱导2周后,碱性磷酸酶和油红O染色,观察细胞体外成骨和成脂肪能力。结果贴壁的细胞呈成纤维细胞样,消化的腹膜细胞群中,CFU-F比例平均为0.574‰(0.26‰～0.84‰)。流式分析显示,细胞均一表达CD29、CD44和CD73,不表达CD31、CD34和CD45。成骨细胞定向诱导后,细胞呈现碱性磷酸酶活性;成脂诱导后细胞内出现脂肪滴,油红O染色阳性。结论人腹膜中富含MSC,可作为一个含有生物支架的干细胞来源。     

脂肪干细胞在皮下软组织充填中的研究进展

脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem CeLIs ADSCs)具有一般干细胞的特点,即多向分化潜能和稳定的体外多代增殖能力,其免疫相容性好,来源丰富,易于获得,可反复取材,无伦理学问题,作为组织工程的种子细胞有着非常重要的实际研究和应用价值.本文着重对脂肪干细胞在生物学特性、体外成脂诱导分化,以及与之相配的生物学载体支架方面的最新进展进行阐述.     

腺病毒介导HGF基因转染对人脂肪干细胞生物学特性影响的研究

目的观察腺病毒介导的HGF基因转染对人脂肪干细胞(Human adipose-derived stem cells,hADSCs)生物学特性的影响。方法利用腺病毒介导HGF(MOI=200)转染hADSCs,检测转染组细胞目的基因HGF表达情况,并与未转染组细胞的形态、细胞生长曲线、细胞表面标志物、细胞周期和成脂、成骨诱导分化能力进行比较。结果 hADSCs转染24 h后,即可检测出HGF,并于48 h后达到高峰,1周后HGF表达逐渐降低。hADSCs转染后仍呈成纤维细胞样生长,其生长增殖能力与未转染hADSCs无明显差别;转染后的hADSCs仍表达CD44、CD90、CD49d、CD105,不表达CD45、CD34、CD31、CD106和STRO-1。转染组与未转染组细胞周期、成脂和成骨诱导分化能力无明显差别。结论腺病毒表达载体介导HGF基因转染hADSCs并不影响其生物学特性,是将hADSCs用于基因治疗的良好途径。     

人脂肪干细胞的培养及鉴定

目的:探讨人脂肪干细胞的分离、培养并鉴定。方法:采用胶原酶法消化人脂肪组织,培养原代脂肪干细胞,通过多种方法检测鉴定。结果:细胞贴壁生长,形态呈梭形,并呈旋涡状或放射状排列;细胞生长曲线为典型的"S"形,细胞倍增时间为26h。流式细胞仪检测结果显示CD29、CD105、CD44为阳性;CD45为阴性;成脂诱导分化的细胞经油红O染色为阳性,成骨诱导分化后茜素红染色亦为阳染。结论:通过获取人腹部脂肪组织进体外分离培养及鉴定,证实其为脂肪干细胞。