大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性和示踪标记

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,观察绿色荧光蛋白(GFP)基因通过慢病毒载体感染MSCs的表达.方法 采用原代贴壁法获得骨髓MSCs,观察细胞形态和生长变化,流式细胞仪鉴定细胞表面标志,体外诱导MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化.采用含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因慢病毒载体感染培养的MSCs,比较细胞感染前后生物学特性.结果 原代贴壁筛选结合差异传代培养的MSCs表面标志阳性率分别为CD44 94.81%,CD90 99.53%,CD106 76.34%,MSCs在pH值稳定于7.2～7.4的环境可传20代.体外MSCs诱导分化后特异性染色显示脂质沉淀和骨结节,表达脂肪细胞和成骨细胞特异基因.慢病毒载体可有效感染大鼠MSCs,加入聚凝胺感染效率达到80%,EGFP在MSCs感染后1个月仍持续表达.结论 骨髓MSCs可长期培养,具有良好的多向分化能力.携带EGFP基因慢病毒载体能高效感染MSCs,EGFP可作为MSCs体内研究的示踪标记.     

绿色荧光蛋白基因逆转录病毒载体转染人骨髓间充质干细胞及表达的研究

目的　绿色荧光蛋白 (EGFP)基因的逆转录病毒载体转染人骨髓间充质干细胞(MSCs)及其表达情况。方法　pEGFP与逆转录病毒载体经过酶切、连接等构建重组的EGFP 逆转录病毒载体 ,转染PA3 17细胞 ,用G418筛选出抗性克隆 ,获病毒上清 (滴度达到 8.5× 10 5cfu/ml)并感染人MSCs。流式细胞仪测定转染效率后加入成骨细胞分化培养夜 (地塞米松 (10 -7mol/L)、β 甘油磷酸钠 (10mmol/L)、维生素C(5 0mg/L ) ) ,2周后观察转染细胞的分化情况。 结果　 48h后细胞转染效率为 7% ,G418筛选 2周后约 97%细胞出现抗性克隆 ,表达维持 4周。基因转染细胞能够分化为成骨细胞。结论　重组EGFP逆转录病毒载体能转染MSCs ,且不影响细胞的功能。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 观察人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因体外转染对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)bFGF表达的影响.方法 密度梯度离心、贴壁法培养分离SD雄性大鼠MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达.利用慢病毒载体系统介导将具有人源性bFGF基因转染至第2代MSCs,在倒置荧光显微镜下观察转染后细胞形态和生长的变化,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法鉴定bFGF在MSCs中的表达.结果 密度梯度离心、贴壁法培养分离可获得MSCs,P3代大鼠细胞利用流式细胞仪检测CD11b/c阳性细胞表达率为(13.2±0.6)%,CD34阳性细胞表达率为(1.2±0.5)%,CD44阳性细胞表达率(97.8±0.9)%,CD90阳性细胞表达率(96.8±1.4)%.MSCs转染48 h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强.RT-PCR证实转基因MSCs表达bFGF mRNA明显增强,Western blot检测证实转基因MSCs在49 KDr出现特异性条带,而空白和空载组的MSCs则未见阳性条带.结论 采用慢病毒介导的基因转染技术可以将bFGF基因转染至MSCs中,并有外源性bFGFmRNA和蛋白的有效表达,MSCs可作为bFGF基因治疗的载体.     

PDX-1促进大鼠骨髓间质干细胞体外分化为胰岛素分泌细胞

目的:研究胰腺十二指肠同源框-1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)基因在骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外分化中的作用.方法:构建含有PDX-1基因的真核表达载体,转染介质Superfect介导重组载体转染MSCs,G418筛选阳性细胞后对转染组(PDX-1+MSCs)和未转染组(PDX-1-MSCs)均体外进行诱导分化,流式细胞仪检测胰岛素阳性细胞的比例,胰岛素ELISA试剂盒测定转染组诱导后细胞的胰岛素分泌功能.结果:限制性酶切分析和序列测定证实成功构建了含有PDX-1基因的真核表达载体,荧光显微镜观察证实Supefect高效介导重组载体转染MSCs;流式细胞仪发现PDX-1+MSCs分化为胰岛素分泌细胞的数量较PDX-1-MSCs明显增多(阳性率分别为28.23%±2.56%和7.08%±2.69%),25 mmol高浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌量(115.29±2.56 μ U/mL),5 mmol低浓度葡萄糖刺激的分泌量明显增高(56.61±4.82 μ U/mL).结论:PDX-1能增强大鼠MSCs体外分化为功能性胰岛素分泌细胞的能力,对开展胰岛移植治疗1型糖尿病有重要价值.     

人前脑啡肽基因修饰人胚胎肾细胞的构建

目的 构建人前脑啡肽基因(hPPE)修饰的人胚胎肾细胞(HEK293细胞).方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/hPPE经限制性内切酶HindⅢ和Not Ⅰ进行双酶切获得hPPE基因,运用基因重组技术将hPPE基因与表达载体同源重组,转染293T细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,测定病毒滴度,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞.用Western blot法检测hPPE基因在HEK293细胞中的表达.结果 重组慢病毒载体阳性克隆测序结果和基因库的hPPE基因序列完全一致.含有hPPE基因的慢病毒载体,滴度为2.07×108TU/ml.转染慢病毒载体后的HEK293细胞,在荧光显微镜下未见到GFP荧光.转染Ubc-GFP-L.V.空病毒载体的HEK293细胞,可见到较强的荧光.Western blot法检测到经慢病毒载体转染后的HEK293细胞中hPPE基因表达呈阳性.结论 成功构建了hPPE基因修饰的HEK293细胞,使hPPE基因可在HEK293细胞中稳定表达.     

人肝细胞生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞系的构建

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞系(MSCs).方法 采用脂质体法将hHGF基因慢病毒载体质粒(lenti-hHGF)转染至293FT细胞,收集病毒上清液感染大鼠MSCs细胞,经过G418筛选得到稳定分泌hHGF的MSCs细胞株(hHGF-MSCs细胞).以转染空载体细胞(eGFP-MSCs)、未转染慢病毒载体的MSCs细胞作为对照.采用免疫印迹法检测hHGF的表达.hHGF-MSCs细胞分别加入成骨诱导剂或成脂诱导剂培养,分别采用茜素红染色和油红O染色鉴定成骨细胞和脂肪细胞表型.结果 与未转染慢病毒载体的MSCs细胞和eGFP-MSCs细胞比较,hHGF-MSCs细胞hHGF表达上调(P＜0.01).hHGF-MSCs细胞体外诱导培养后具有明显的成骨和成脂表型,可向成骨细胞和脂肪细胞分化.结论 成功构建hHGF基因修饰大鼠MSCs.     

不同血清型腺相关病毒介导的增强绿色荧光蛋白转染犬骨髓间充质干细胞的比较

间充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能,增殖能力强,是组织工程种子细胞研究热点之一[1].腺相关病毒(AAV)载体是已知可整合在染色体上长期表达而不致病的病毒载体.为明确AAV1与AAV2载体对MSCs的转染特点和表达效率,我们就rAAV载体介导的增强绿色荧光蛋白(EGFP)对体外培养犬MSCs的转染情况进行了观察.     

BMP-12重组腺病毒载体转染外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化研究

目的探讨携带BMP-12基因的腺病毒载体转染诱导外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化的效果。方法取3~4月龄新西兰兔外周血,体外分离培养外周血MSCs至第3代。采用Ad Easy腺病毒载体系统制备BMP-12重组腺病毒载体。将BMP-12重组腺病毒体体外转染第3代外周血MSCs,转染后24 h通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测转染效率,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,转染后8、24 h在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达;转染后0、7、14 d,采用免疫组织化学染色观察I型胶原表达情况;实时定量PCR检测肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin m RNA表达水平,并设未转染细胞作为对照组。结果转染后24 h,倒置相差显微镜观察示细胞生长增殖缓慢,细胞形态清晰;FCM检测示,转染组转染效率为99.57%,未转染组为2.46%;转染后8 h,荧光显微镜下即可见GFP表达,随培养时间延长GFP表达逐渐增多,24 h时几乎所有细胞均可见GFP表达。免疫组织化学染色示,随转染时间延长,Ι型胶原表达逐渐增强;转染组转染后14 d,肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin m RNA表达水平分别为0.061±0.013、0.029±0.008、0.679±0.067,均显著高于未转染组的0.004±0.002、0.003±0.001、0.142±0.024,差异有统计学意义(t=—7.700,P=0.031;t=—5.741,P=0.020;t=—12.998,P=0.000)。结论 BMP-12重组腺病毒载体可明显促进外周血MSCs向肌腱/韧带成纤维细胞表型分化,并促进肌腱/韧带特异基因表达和细胞外基质产生,为外周血MSCs用于肌腱/韧带再生提供了依据。     

腺病毒载体介导的自杀基因对MFC小鼠前胃癌细胞的体外杀伤作用

提高转基因效率,建立高效自杀基因杀伤胃癌肿瘤细胞的方法。方法：首先构建含CD基因的重组腺病毒载体并对载体进行包装、收获病毒上清并纯化。将重组病毒液转染MFC胃癌细胞进行体外抑瘤实验。结果：含CD基因的重组腺病毒载体经酶切鉴定选出：包装纯化后,检测病毒浓度为1.2×1012颗粒/ml。体外实验中,转CD基因的MFC细胞在5-FC作用下生长明显受抑(P<0.01,n＝9)。结论：腺病毒载体转导的CD基因提高了转染效率,为大量杀伤胃癌细胞奠定了基础。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的体外构建

目的探讨猕猴骨髓间充质干细胞作为种子细胞与去细胞同种异体神经作为支架，体外构建人工神经的研究。方法采用密度梯度离心的方法分离并培养猕猴骨髓间充质干细胞，利用相差显微镜观察细胞生长情况并描绘其生长曲线；取猕猴3段4cm的周围神经，其中2段用4％triton—X-100及4％脱氧胆酸钠液分别萃取1次和2次，在新鲜神经和萃取神经中段取材，组织学检测及电镜学观察萃取前后的形态学变化；采用显微注射的方法把猕猴骨髓间充质干细胞种植到萃取两次的异体神经内，HE染色观察细胞在支架内的生长情况。结果猕猴骨髓间充质干细胞自我增殖能力强；萃取1次的异体神经细胞及髓鞘结构仍部分存留，而萃取2次的其细胞及髓鞘结构消失；HE染色可见细胞在萃取2次的异体神经内可爬行生长。结论猕猴骨髓间充质干细胞与化学萃取的去细胞同种异体神经适合体外构建人工神经。     

Hepatocytic gene expression in cultured rat mesenchymal stem cells

The origin of liver cells from distinct bone marrow stem cells, eg, hematopoietic stem cells or multipotent adult progenitor cells has been recently described using in vitro studies. Cell culture experiments revealed the key role of growth factors and the organ-specific environment for the induction of liver-specific genes. We investigated the in vitro potential of rat mesenchymal stem cells to differentiate into hepatocytic cells in cocultures with isolated rat liver cells. Rat mesenchymal stem cells (MSCs) propagated in culture, and transduced with green fluorescent protein (GFP) were cloned. Cells from selected clones were either cultured under liver-stimulating conditions, using serum free medium supplemented with HGF, EGF, SCF, and FGF-4 alone on fibronectin-coated surfaces, or cocultured with freshly isolated rat liver cells. Cocultured cells were harvested after two weeks and sorted into GFP-positive (GFP+) and GFP-negative (GFP-) cells. RT-PCR for liver specific markers CK-18 and albumin were performed on the different cell populations. After 2 weeks, the specified culture conditions led to the expression of albumin and CK-18 RNA in GFP-positive sorted MSCs from the cocultures, whereas MSCs cultured without liver cells did not express the studied genes. The results indicate, that when cocultured with liver cells MSCs from the bone marrow have the potential to differentiate toward hepatocytic cells in vitro. We conclude that MSC may possess an enhanced capacity to differentiate into functional liver cells. Additionally, environmental factors seem to be crucial for specific and directed differentiation.     

体外转染GFP-Bcl-2基因对低氧条件下间充质干细胞细胞周期的影响

目的探讨低氧条件下诱导骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）向目标细胞分化为相关疾病提供了潜在的临床治疗途径。方法将表达GFP-Bcl-2的慢病毒载体转染大鼠骨髓MSCs使其过量表达（GFP-Bcl-2-MSCs）。在低氧环境下诱导其分化并检测细胞凋亡和增殖。采用流式细胞术检测MSCs和GFP-Bcl-2-MSCs在低氧条件下MSCs细胞细胞周期分布。采用Western blot检测不同组细胞cyclinD1、cyclinE及PCNA表达变化。结果在体外低氧诱导条件下,Bcl-2基因对MSCs有明显的抗凋亡功能。与空载体对照组相比：实验组（GFP-Bcl-2-MSCs）细胞凋亡率下降27%,细胞增殖率升高了58%。但细胞周期分布及cyclinD1、cyclinE、及PCNA的表达无明显差异。结论研究证实了抗凋亡基因修饰的MSCs（GFP-Bcl-2-MSCs）在低氧环境下可抑制细胞凋亡,但细胞周期的相关机制需要进一步研究。     

骨髓间质干细胞体外定向肌样分化的研究

目的 研究兔骨髓间质干细胞经5—氮杂胞苷诱导，在体外定向肌样分化的情况。方法 取兔胫骨骨髓，分离并培养骨髓间质干细胞，用5—氮杂胞苷苦(10μmol/L)定向诱导，分别在培养的第7、14、2l、28天用免疫组织化学的方法检测细胞中的肌球蛋白重链，取未经5—氮杂胞苷诱导正常培养的细胞为对照组。结果 兔骨髓间质干细胞经5—氮杂胞苷诱导，在其培养的第21、28天免疫组织化学染色方法检测细胞中的肌球蛋白重链呈阳性，而在其培养的第7、14天以及对照组，免疫组织化学染色方法检测细胞中的肌球蛋白重链呈阴性。结论 骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞，在5—氮杂胞苷的定向诱导下，可以肌样分化。     

MSCs在缺氧状态下的基因差异性表达

目的 探讨MSCs在缺氧环境中细胞生物学特性及相关生长因子的变化,为修复组织损伤提供临床应用依据。方法 体外进行MSCs缺氧处理,免疫荧光染色观察细胞特性,RT-PCR检测VEGF、b FGF、TGF-β和IL-1α基因,从细胞分化、生长因子和细胞信号通路等方面,来探讨MSCs在缺氧环境下发生的转变。结果 MSCs经1%O2缺氧培养24 h后,镜下观察示细胞成活良好,未见形态、生长方式等发生明显变化。免疫荧光及双荧光染色观察缺氧处理24 h的MSCs有向内皮细胞,特别是血管内皮转化的趋势。VEGF、b FGF、TGF-β和IL-1α在缺氧处理后的MSCs中表达均增强,而未经缺氧处理的MSCs相关因子表达微弱。结论 在缺氧的环境下,MSCs可向血管内皮细胞方向分化,并且与促进血管形成和生长相关的VEGF、b FGF、TGF-β和IL-1α基因表达均增强,可直接或间接促进损伤组织的血管化。     

IL‐7 overexpression enhances therapeutic potential of rat bone marrow mesenchymal stem cells for diabetic wounds

This study was aimed to enhance the healing potential of rat bone marrow mesenchymal stem cells against chronic diabetic wounds through interleukin‐7 (IL‐7) transfection. IL‐7 plays an important role in wound healing and acts as a survival factor in some cell types. This study involves isolation, propagation, and characterization of mesenchymal stem cells (MSCs) and their modification with IL‐7 gene via retroviral transfection. Transfected MSCs were assessed for their effect on angiogenic genes by qPCR. Wound healing potential of transfected MSCs was analyzed by scratch assay in vitro and by transplanting these cells in rat diabetic wound models in vivo. Wound area was measured for a period of 15 days and subsequent histological analysis was performed. qPCR results showed increased expression of IL‐7 gene (p ≤ 0.05) and also principal angiogenic genes, vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), VEGF receptor 1 (FLT‐1), and VEGF receptor 2 (FLK‐1) (p ≤ 0.05). Neuropilin‐1 (NRP‐1) did not show any significant change. In vitro analysis of IL‐7 MSCs showed intense cell–cell connections and tube formation as compared to the normal MSCs. Rate of wound closure was more (p ≤ 0.001) in case of diabetic group transplanted with IL‐7 MSCs. Histological examination revealed enhanced vascular supply in skin tissues of diabetic animals transplanted with IL‐7 transfected MSCs as compared to normal MSCs. Immunohistochemical results showed significantly higher expression of IL‐7 (p ≤ 0.001) and α‐smooth muscle actin(p ≤ 0.001) in the tissue sections of IL‐7 transfected group as compared to normal MSCs and the diabetic control group; the latter indicates increase in the number of blood vessels. It is concluded from this study that IL‐7 overexpression in MSCs can enhance the healing potential of MSCs and aid in wound closure in diabetic animals through the induction of angiogenic genes.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的建立一种兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）体外分离培养、扩增及鉴定的方法。方法骨髓穿刺法抽取新西兰白兔髂骨骨髓5ml，应用密度梯度离心法分离纯化MSC并进行体外扩增，倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况，计数细胞数目，绘制细胞乍长曲线。HE染色光镜观察细胞形态，采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。结果成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法。生长动力学分析发现，传代细胞随传代次数的增加其增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强，生长旺盛。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞，第3～5代细胞增殖能力强，可用于进一步的研究工作。     

人脐血间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究

目的 研究人脐血间充质干细胞(MSCs)分离培养的生物学特性及其向成骨、成脂诱导分化的能力.方法 从人脐血中分离扩增MSCs,显微镜下观察其形态及生长情况,绘制生长曲线,电镜下观察超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标志物;成骨、成脂诱导后以碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色鉴定MSCs成骨分化潜能,油红O染色鉴定成脂分化潜能.结果 人脐血MSCs为成纤维细胞样,漩涡状贴壁生长排列,传至第110代细胞形态无明显变化;电镜下显示为低分化细胞;细胞表面不表达CD34和CD45,强表达CD29、CD44和CD90;成骨诱导后可检测到ALP表达及钙化结节形成;成脂诱导后可检测到脂滴形成.结论 人脐血中可分离出MSCs,与其他来源的MSCs具有类似的生物学特性及多向分化潜能,脐血有可能成为骨组织工程种子细胞的来源.