乙醇与铅单独及联合染毒对胎鼠脑新皮质神经干细胞自我更新的抑制作用

目的研究乙醇和乙酸铅联合染毒对胎鼠脑新皮质神经干细胞自我更新的影响及其机制。方法取SpragueDawley胎鼠脑新皮质的神经干细胞悬液,分设对照组、乙醇(25、50 mmol/L)单独染毒组、乙酸铅(0.01、0.1、1μmol/L)单独染毒组和乙醇+乙酸铅联合染毒组。培养48 h后,采用台盼蓝试验检测细胞存活率,采用流式细胞术检测细胞周期,采用qRT-PCR法检测神经干细胞标志物nestin和细胞周期相关基因p16和p21 mRNA表达。结果乙醇与乙酸铅联合染毒组胎鼠脑新皮质神经干细胞存活率下降,细胞周期延缓、G0/G1期阻滞和S期DNA合成抑制,nestin mRNA表达下降均存在协同效应(P0.05);对p16和p21 mRNA表达水平增高亦呈一定协同作用(P0.05)。结论乙醇和乙酸铅联合染毒能抑制胎鼠脑新皮质神经干细胞的自我更新,并且存在一定协同作用。     

百草枯对人胚胎神经干细胞分化过程中Wnt通路分子表达的影响

[目的]通过对神经干细胞Wnt信号通路中关键分子β-catenin/D VL2基因表达的研究,探讨百草枯对分化中的神经干细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响. [方法]以人胚胎神经干细胞为研究对象,观察体外诱导分化情况,并采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定不同浓度百草枯对细胞活力的影响,选取未观察到细胞毒性的浓度为0.10、1.00、10.00 μmol/L的百草枯染毒,在分化2、4、8、12d利用实时荧光定量多链聚合反应技术检测Wnt信号通路关键分子β-catenin和DVL2 mRNA的表达情况. [结果]百草枯在100.00 μmol/L时可明显抑制细胞活力(P＜0.01).百草枯在神经干细胞分化期2、8、12d明显下调β-catenin mRNA的表达,除10.00μmol/L染毒组在分化期8d以外,其余各剂量组与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.01).百草枯在神经干细胞分化期2、12d DVL2 mRNA的表达明显下调,除0.10μmol/L染毒组在分化期12d该基因mRNA表达升高外,其余各剂量组与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.01);在分化期4dDVL2 mRNA的表达明显上升,各剂量组与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01). [结论]百草枯抑制Wnt信号通路中关键分子β-catenin和DVL2基因mRNA的表达,最终可影响神经干细胞的分化过程.     

p73在苯并(a)芘致人肺纤维细胞株MRC-5和人肺腺癌细胞株H1299(p53-null)周期阻滞中的作用

目的 研究p73在苯并(a)芘[B(a)P]致人肺纤维细胞株MRC-5和人肺腺癌细胞株H1299(p53-null)周期阻滞中的作用.方法 采用0(溶剂对照)、8、16、32、64和128 μmol/L的B(a)P分别处理处于对数生长期的MRC-5和H1299细胞24 h.采用MTT比色法检测两种细胞系的生长率,采用流式细胞术检测细胞周期各时相的细胞百分比,采用实时荧光定量PCR方法测定p53,p73,p21和Gadd45的mRNA表达水平.结果 与溶剂对照组比较,8、16、32、64μmol/L B(a)P染毒组MRC-5细胞和H1299细胞的增殖活性均升高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).16μmol/L B(a)P染毒组MRC-5细胞和32 μmol/LB(a)P染毒组H1299细胞的增殖活性达到峰值,与溶剂对照组相比,分别增加了40%和30%.与溶剂对照组比较,8、16、32、64和128μmol/L的B(a)P染毒组MRC-5细胞的p53.p73和p21基因mRNA表达水平上升,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),细胞阻滞在G1期.与溶剂对照组比较,8 μmol/L的B(a)P染毒组H1299细胞p73和p21基因mRNA表达的表达水平上升,差异均有统计学意义(P＜0.05),细胞阻滞在G1期;但各处理组Gadd45基因的mRNA表达水平间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 一定浓度B(a)P可通过p53介导引起MRC-5细胞周期G1期阻滞,而对于p53缺失的H1299细胞,其细胞周期G1期阻滞可能依赖于p73参与的细胞信号通路的调节.     

cdk5、p35和p53基因在砷诱导的神经细胞凋亡中的改变

目的 研究cdk5、p35和p53基因表达量在As2O3诱导的神经细胞凋亡中的改变,为探讨As2O3神经毒性的机制提供基础资料.方法 将原代培养的大鼠神经元分为未处理对照组,DMSO溶剂对照组,1、5、10 μmol/L As2O3染毒组,分别用1、5、10 μmol/L As2O3溶液染毒,未处理对照组只加入培养液.染毒8h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测神经细胞活力,用流式细胞仪检测神经细胞凋亡率,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测cdk5、p35、p53基因的表达.结果 1、5、10 μmol/L As2O3染毒组神经细胞活力抑制率分别为16.77％、19.72％、27.81％.与未处理对照组和溶剂对照组相比,5和10μmol/L As2O3染毒组细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).各染毒组cdk5、p35、p53基因的表达量随着染毒剂量的增加而升高,各组间p35基因表达量的差异无统计学意义(P＞0.05);cdk5和p53基因表达量的组间差异有统计学意义(P＜0.05),5和10 μmol/L As2O3染毒组cdk5基因表达量明显高于未处理对照组和溶剂对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);1、5和10 μmol/L As2O3染毒组p53表达量明显高于未处理对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);其中10 μmol/L As2O3染毒组p53基因表达量明显高于DMSO溶剂对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 cdk5、p35和p53可能参与了As2O3诱导的神经细胞凋亡过程.     

乙醇对胎鼠脑新皮质神经干细胞凋亡的影响

目的探讨乙醇对胎鼠神经干细胞凋亡的影响。方法将妊娠14 d胎鼠脑新皮质来源的神经干细胞暴露于终浓度分别为0(对照)、25、50、100 mmol/L的乙醇培养基溶液3 d。采用Annexin V/PI法检测细胞早期和晚期凋亡情况,采用JC-1探针法检测线粒体膜电位的改变,并检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达。结果与对照组比较,50、100 mmol/L乙醇染毒组神经干细胞的早期凋亡细胞率明显升高,差异有统计学意义(P0.05);而各浓度乙醇染毒组神经干细胞的晚期凋亡率无明显改变。且随着乙醇染毒浓度的升高,神经干细胞的早期凋亡细胞率呈上升趋势。仅100 mmol/L乙醇染毒组神经干细胞线粒体膜电位低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,各浓度乙醇染毒组神经干细胞Bax mRNA的表达水平均上升,差异有统计学意义(P0.05);而Bcl-2和Caspase-3 mRNA的表达水平均无明显改变。且随着乙醇染毒浓度的升高,Bax mRNA表达量呈上升趋势。与对照组比较,50、100 mmol/L乙醇染毒组神经干细胞Bax蛋白的表达水平均升高,而Bcl-2/Bax蛋白的比值均降低,差异有统计学意义(P0.05);各浓度乙醇染毒组神经干细胞Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达水平均无明显改变。结论乙醇可引起神经干细胞早期凋亡,其机制可能与线粒体损伤和Bax表达上调有关。     

苯并[a]芘暴露的小鼠原代支气管上皮细胞中miR-320对细胞周期的影响

目的检测miR-320在苯并[a]芘(B[a]P)暴露的小鼠原代支气管上皮细胞的表达水平,探讨B[a]P染毒的小鼠支气管上皮细胞中miR-320对细胞周期的影响。方法以1.00μmol/LB[a]P染毒原代培养小鼠支气管上皮细胞。以定量PCR检测染毒细胞中miR-320的表达。以FACSArray流式液相芯片分析仪检测细胞周期和细胞周期素依赖性激酶6(CDK6)的表达水平。结果 miR-320在B[a]P染毒细胞中表达上调。染毒细胞出现G1期阻滞现象,与溶剂对照组的[(62.70±1.54)%]G1期细胞比例相比,(84.28±0.36)%的细胞停留在G1期。抑制miR-320表达后G1期阻滞现象缓解。染毒细胞中的CDK6表达降低,抑制miR-320表达后,与B[a]P组相比,CDK6的表达量有(2.0±0.3)倍的升高。结论 miR-320在一定程度上通过对CDK6表达的调控影响B[a]P暴露的细胞的细胞周期。     

miR-138-5p在锰致SH-SY5Y细胞自噬中的作用

[目的]探讨miR-138-5p在氯化锰(MnCl_2)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬中的作用及其机制。[方法]以生理盐水处理组作为对照,0.125、0.25、0.5、1 mmol/L MnCl_2染毒SH-SY5Y细胞6 h后,利用MTT法检测细胞活力;0.25和0.5 mmol/L MnCl_2处理细胞6 h后,采用Western blot检测自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达;MnCl_2染毒6 h后,使用反转录PCR和Western blot检测miR-138-5p和组蛋白脱乙酰酶SIRT1 mRNA以及蛋白表达的变化;使用miRNA模拟物转染细胞实现miR-138-5p过表达,然后0.25 mmol/L MnCl_2染毒6 h,检测SIRT1 mRNA和蛋白的表达以及自噬相关蛋白LC3和Beclin1的变化。[结果]MnCl_2可剂量依赖性地降低SH-SY5Y细胞活力(趋势χ~2=12.42,P0.05)。与对照组相比,0.25、0.5 mmol/L MnCl_2染毒后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值和Beclin1表达水平明显增加(P0.05);miR-138-5p表达下调,SIRT1 mRNA及蛋白表达上调(均P0.05)。miR-138-5p过表达后,相比未过表达的MnCl_2染毒组,SIRT1 mRNA及蛋白表达均出现下调,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及Beclin1蛋白表达也相应下调(P0.05)。[结论]miR-138-5p过表达可通过调节SIRT1的表达抑制锰诱导的SH-SY5Y细胞自噬。     

miR-181a对耳蜗毛细胞c-fos表达调控的研究

目的 探讨在耳蜗毛细胞氧化损伤中表达异常的miR-181a对原癌基因c-fos的生物学调控作用.方法 采用叔丁基过氧化氢(t-BHP)染毒,设50、100、200μmol/L 3个浓度组和未染毒对照组对HEI-CO1细胞染毒12h,提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用荧光定量PCR(qPCR)检测miR-181a/-181d表达;选择表达异常的miR-181a为研究对象,检索生物信息学网站,对c-fos 3'端非翻译区域(3'-UTR)上miR-181a可能的作用靶序列进行预测分析;用脂质体转染入miR-181a的mimics,qPCR检测转染效率;qPCR观察c-fos mRNA水平表达量的改变;免疫印迹(Western blotting)法观察毛细胞中c-fos蛋白表达量的改变;构建野生型的融合c-fos-3' UTR的重组pGL3质粒(pGL3-c-fos-3' UTR-WT),利用双荧光素酶报告基因检测系统检测在高表达miR-181a后荧光素酶活力的改变情况.结果 qPCR结果显示,miR-181a在100、200 μmol/L染毒浓度组表达下调,低表达倍数分别为0.744和0.766,差异均有统计学意义(P＜0.01);而miR-181d在50 μmol/L浓度组表达升高,高表达倍数为1.29,差异亦有统计学意义(P＜0.01),在100、200 μmol/L 2个染毒浓度组中的表达变化的差异无统计学意义(P＞0.05);通过预测显示,在人类和小鼠中,c-fos均受miR-181a的调控,在种子区域完全互补,靶序列在物种之间也十分保守;脂质体转染入miR-181a mimics 24h后,qPCR结果显示,在miR-181a mimics转染组中miR-181a升高892.979倍;与对照组相比,在miR-181a mimics转染组的耳蜗毛细胞中c-fos mRNA的表达增高,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blotting观察结果显示,与对照组相比,c-fos蛋白在miR-181a mimics转染组中表达升高,差异有统计学意义(P＜0.01);成功构建pGL3-c-fos-3' UTR-WT的重组质粒,双荧光素报告基因检测系统结果显示,在高表达miR-181a时,野生型pGL3-c-fos-3' UTR-WT报告载体的荧光素酶活力并未受到抑制,反而增强.结论 miR-181a对c-fos mRNA和蛋白的表达无直接抑制作用.c-fos可能不是miR-181a的靶基因,生物信息学预测结果可能是假阳性的.     

不同剂量γ射线对人外周血miRNA的表达影响

目的 利用高通量miRNA测序和生物信息学技术，筛选人外周血中辐射敏感的miRNA分子，为辐射损伤提供早期诊断指标。方法 采集健康成年男性的外周血，给予0.2 Gy和2.0 Gy γ射线照射，于照射后6 h提取总RNA，应用高通量miRNA测序手段获得差异的miRNA，qRT-PCR方法验证部分差异的miRNA，通过mirdbV6和Target Scan7.1数据库预测共同差异miRNA的靶基因，并进行KEGG生物信息学分析。结果 人外周血经不同剂量 γ 射线照射后6 h，0.2 Gy组差异miRNA有10个，2 个表达上调，8 个表达下调；2.0 Gy作用后共鉴定出9 个表达上调、12 个表达下调miRNA分子，差异有统计学意义（P < 0.05）。其中有5个miRNA在2个剂量组均发生显著变化。RT-PCR实验结果表明有4个miRNA，miR-23c、miR-1287-5p、miR-219a-3p、miR-320d与测序结果一致。生物信息学结果表明，在2个剂量组均差异表达的miRNA可能通过参与调控MARK、RAS、P53、RIG-I等信号通路影响细胞增殖、凋亡、DNA损伤修复及免疫调控。结论 miR-23c、miR-1287-5p、miR-219a-3p、miR-320d分子有望成为辐射损伤新的血液标志物。     

自体DC CIK NK αβT γδT细胞治疗乳腺组织细胞肉瘤的临床研究

目的观察细胞因子诱导的自体DC、CIK、NK、αβT、γδT细胞治疗组织细胞肉瘤疗效。方法抽取患者自体外周血60~100 m L,采用血细胞分离机收集其单核细胞,经细胞因子诱导并扩增C I K、N K、αβT、γδT细胞及DC细胞;用流式细胞仪检测其表型后,静脉回输CIK、NK、αβT、γδT细胞,皮下注射DC细胞,观察组织细胞肉瘤变化。结果患者左乳肿块缩小＞50%,生活质量明显改善。结论细胞免疫治疗是一种化疗后组织细胞肉瘤有效的治疗手段,具有广阔的临床应用前景。     

无动物源性培养系统对人胚胎干细胞生长的支持作用

目的:建立完全非动物源性培养系统,为人胚胎干细胞定向诱导为各系统细胞应用于临床、消除动物源性污染打下基础。方法:分别采用人包皮成纤维细胞、胎儿肌肉细胞及人子宫内膜基质细胞为饲养层细胞,以血清替代品取代动物血清,支持人胚胎干细胞生长,观察其增殖和分化情况。结果:人包皮成纤维细胞、胎儿肌肉细胞均能很好支持人胚胎干细胞生长增殖,并保持90%左右未分化表型:AKP染色强阳性,SSEA-4、TRA-1-81表达强阳性,可见OCT-4 mRNA表达,核型正常。人子宫内膜基质细胞不能支持hESC的生长。结论:完全可以使用非动物源性培养系统支持人胚胎干细胞增殖,从而为胚胎干细胞定向诱导分化应用于临床打下坚实基础     

孕期母胎界面及母血中T、NK细胞研究进展

胚胎对于母体来说是半异己的同种移植物,母体免疫系统中的免疫细胞能否识别并耐受胚胎抗原,直接影响妊娠的建立与维持.所以研究孕期母胎界面及母血系统免疫中T细胞和NK细胞免疫状态可以帮助了解妊娠免疫耐受的机制,也可以认识一些严重影响妊娠结局的病理妊娠的发病机制.该文主要对孕期母胎界面及母血系统免疫中T细胞表面标记、辅助细胞1/辅助细胞2模式、自然杀伤细胞分泌细胞因子及自然杀伤细胞表面标记与杀伤活性的变化的研究进展作以综述.     

BRL-CM小鼠胚胎干细胞及体外诱导的研究

目的 探讨以Buffalo大鼠肝细胞培养上清(BRL-CM)替代含LIF培养液体外培养小鼠胚胎干细胞(ESC)的可行性；无血清体外诱导ESC为神经前体细胞(NPC)。方法 以BRL-CM维持ESC生长并抑制其分化，用含LIF的培养液作为对照，硝基四氮唑蓝／5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸(NBT／BCIP)显色检测碱性磷酸酶。采用N2选择性无血清培养法获取NPC，免疫组化法检测巢蛋白(Nestin)鉴定。结果 BRL-CM与含LIP的培养液一样能维持ESC未分化状态，无血清培养基诱导。ESC后获得细胞的86％为NPC。结论 BRL-CM可替代LIF用于ESC培养，且经济、简便。采用N2选择性培养基可获得较高纯度的NPC。     

米非司酮对早孕小鼠促性腺激素细胞的形态学影响

研究米非司酮终止早孕时小鼠垂体促性腺激素细胞——FSH细胞、LH细胞的形态学变化。方法:应用免疫组织化学PAP方法,对FSH细胞与LH细胞的阳性细胞密度,细胞质内激素颗粒进行观察。结果:实验组与对照组比较,FSH细胞的阳性细胞密度,细胞质内FSH颗粒无显著性差异;LH细胞的阳性细胞密度,细胞质内LH颗粒均明显减少,有显著性差异(P<0.05)。结论:米非司酮对早孕小鼠的FSH细胞的功能无明显影响;对LH细胞的功能有显著的抑制作用。     

甲基丙烯酸环氧丙酯对人支气管上皮细胞周期及凋亡影响的研究

目的探讨甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)对人支气管上皮细胞周期及凋亡的影响。方法人支气管上皮细胞(16HBE)经1~16μg/ml剂量的GMA染毒不同次数后,应用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期及凋亡率的改变,同时测定细胞分裂指数(MI)。结果经1次染毒处理后,随着染毒剂量的增加,G0/G1期细胞显著减少(P<0.01),S期和G2/M期细胞显著增加,凋亡细胞数增多,细胞分裂指数下降;随着染毒次数的增加,各剂量组细胞周期均明显阻滞于G0/G1期,但高剂量组细胞仍表现出S期和G2/M期增多现象;经3次染毒后,高剂量组细胞出现凋亡率下降、分裂指数升高现象。结论经GMA染毒处理后,16HBE细胞周期由G0/G1期向S期和G2/M期移动而呈现增殖性改变。     

血小板衍化内皮细胞生长因子在结直肠癌细胞及间质细胞中的表达及意义

目的 探讨血小板衍化内皮细胞生长因子（PD-ECGF）在结直肠癌组织的肿瘤细胞和肿瘤间质细胞中的表达及与Dukes分期、组织分化程度、淋巴结转移的关系。方法 采用免疫组化染色法对41例手术切除的结直肠癌组织（结直肠癌组）的肿瘤细胞、肿瘤间质细胞以及25例正常结直肠组织（对照组）的黏膜上皮细胞及间质细胞进行PD-ECGF测定。结果 结直肠癌组肿瘤细胞PD-ECGF阳性表达率明显高于对照组黏膜上皮细胞（P〈0．05）；肿瘤细胞PD-ECGF阳性表达与淋巴结转移密切相关（P〈0．05）；结直肠癌组和对照组间质细胞PD-ECGF阳性表达率比较差异有统计学意义（P〈0．05）；结直肠癌组肿瘤间质细胞PD-ECGF阳性表达与肿瘤细胞是否PD-ECGF阳性表达无相关关系（P〉0．05）。结论 肿瘤细胞PD-ECGF阳性表达与淋巴结转移密切相关；肿瘤间质细胞是PD-ECGF的重要来源。     

肺炎链球菌疫苗抗原促进CRTH2(CD4~+CD294~+Th2)细胞增殖的实验研究

目的研究肺炎链球菌疫苗通过树突状细胞抗原递呈作用对CRTH2(CD4~+CD294~+Th2)细胞促增殖作用,为扩增及分选Th2细胞提供新方法。方法外周血单核细胞培养为树突状细胞,负载肺炎链球菌疫苗抗原后与T淋巴细胞共培养,CCK8法测定混合淋巴细胞反应,流式细胞仪分析DC及CRTH2细胞。结果肺炎链球菌疫苗可促进树突状细胞成熟,与TNF-a共同是DC成熟佐剂。DC负载肺炎链球菌疫苗抗原能使第5天CRTH2细胞亚群比率[(0.93±0.10)%]较首日[(0.70±0.02)%]升高,其绝对数也升高(均P0.05)。结论树突状细胞负载肺炎链球菌疫苗抗原能够促进CRTH2细胞增殖,可能是扩增Th2细胞有效方法之一。     

Experimental Study on Differentiation of Human Hepatocarcinoma Cells Induced by Zhengganfang Drug Serum in Vitro

Objective To study the effect of Zhengganfang （ZGF） drug serum in inducing differentiation of BEL - 7402 human hepatocarcinoma cell （ HHC ） and its influence of the telomerase activity. Methods Rats were fed with ZGF decoction to prepare the drug - serum of ZGF, and the drug - serum was used for Bel - 7402 HHC culture. Serum of normal rat was taken as negative control and retinoic acid （RA） as the positive control, cell proliferation was detected by MTr colorimetric assy, nucleocytoplasm ratio by image assay, a - fetoprotein （ AFP） by RIA alkaline phosphatase （ ALP） activity and T - glutamy transpeptidase （γ- GT） by dynamic colorimetric assy, and telomerase activity of Bel- 7402 cell by PCR - ELISA. Results Drug - serum of ZGF could inhibit the prohferation of Bel - 7402 cell, markedly reduce the nucleocytoplasm ratio and the secretion of AFP, decrease γ - GT activity, increase ALP activity, and suppress the telomerase activity of Bel - 7402 cell. Conclusion ZGF can induce the differentiation of Bel - 7402 HHC, the main mechanism maybe through the supression of the telomerase activity.