β-淀粉样蛋白对海马神经元钙离子浓度的影响及其机制研究

目的　观察β-淀粉样蛋白 (Aβ1 -40 )对海马神经元内钙离子浓度的影响及尼莫地平的拮抗作用。方法　采用大鼠海马神经元的原代培养技术 ,分别用 MTT法和激光扫描共聚焦显微镜结合 Fluo-3 /AM标记观察神经元存活率和细胞内游离钙离子浓度变化。结果　 Aβ1 -40在较高浓度 (1μmol/L和 1 0μmol/L )下 ,对神经元存活率和 [Ca2 + ]i 的影响与对照组相比 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1 ) ;5 μmol/L尼莫地平可部分降低Aβ1 -40引起的 [Ca2 + ]i 升高。结论　 Aβ1 -40可引起培养海马神经元存活率下降及胞内钙离子浓度升高 ,尼莫地平有部分拮抗作用。     

阿托伐他汀对淀粉样β蛋白诱导大鼠原代海马神经元损伤保护作用的研究

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin,Ato)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的体外培养原代海马神经元损伤保护作用。方法选用出生0~24hSprague-Dawley大鼠乳鼠,解剖显微镜下分离海马,进行海马神经元体外培养,培养10d后用于实验。将培养的海马神经元分为3组:(1)正常对照组:加入含有1%(质量浓度)DMSO培养基;(2)Aβ1-42组:加入1.25μmol/L Aβ;(3)Aβ(1.25μmol/L)+不同浓度阿托伐他汀组(0.1、0.5、1、2.5μmol/L)。应用CellTiter-GloTM荧光细胞活性试剂盒检测培养海马神经元ATP含量,用以反映神经元活力;通过CytoTox-ONETM试剂盒测定培养细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用以测定神经元细胞膜的损伤程度;应用免疫荧光染色观察神经元突触素(SYP)、突触后致密蛋白95(PSD-95)、bassoon蛋白表达。Western印迹法半定量检测海马神经元突触蛋白SYP、PSD-95、bassoon的改变。结果与正常对照组比较,培养10d海马神经元经1.25μmol/L Aβ1-42作用48h后,其ATP和LDH水平均明显降低(均P0.01),而0.5、1.0、2.5μmol/L Ato组能够明显抑制Aβ1-42引起的ATP和LDH水平降低(P0.01)。免疫荧光及Western blot结果显示,1.25μmol/L Aβ1-42可使海马神经元SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达明显降低,而Ato能够明显抑制Aβ1-42引起的SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达降低。结论 Ato对Aβ诱导的体外培养海马神经元毒性有保护作用,这种保护作用可能与Ato对抗Aβ1-42引起的海马神经元SYP、PSD-95、bassoon表达降低有关。     

β-淀粉样蛋白25-35杏仁核注射对大鼠空间学习记忆及海马突触素表达的影响

目的探讨β-淀粉样蛋白25-35（Aβ25-35）杏仁核注射所造痴呆模型大鼠海马突触素的改变及其与空间学习记忆力的关系。方法雄性Sprague-Dawley大鼠24只，随机分为正常对照组、假手术组（颅内注射5．0nmol 0．1％三氟乙酸）、痴呆模型组（颅内注射5．0nmol Aβ25-35），每组各8只。采用杏仁核注射Aβ25-35的方法建立大鼠痴呆模型；通过Morris水迷宫测试观察大鼠空间学习记忆能力的改变；应用免疫组织化学染色测定模型大鼠海马突触素表达的水平。结果大鼠痴呆模型建立6周后，痴呆模型组大鼠存在明显的空间学习记忆力障碍，为期6d水迷宫测试的平均潜伏期均明显长于正常对照组及假手术组，其中第4～6天与正常对照组的差异有统计学意义（P〈0．01）。免疫组织化学染色，痴呆模型组大鼠海马突触索表达的阳性数及着色密度均明显少于正常对照组及假手术组，其中与正常对照组的差异均有统计学意义（P均〈0．01）。结论Aβ25-35杏仁核注射所造痴呆模型的大鼠海马突触数量明显减少，其空间学习记忆力功能障碍可能与突触的减少有关。     

海马注射β淀粉样蛋白对大鼠学习记忆及局部神经元的损伤作用

目的 探讨β淀粉样蛋白海马内注射的神经毒性,并对应用此方法建立阿尔茨海默病（ＡＤ）的动物模型进行初步评价。     

脑梗死患者海马β-淀粉样蛋白的表达

目的研究人脑梗死后β-淀粉样蛋白(Aβ)1-40和Aβ1-42在海马CA1区神经元中的表达。方法选取因脑梗死而死亡的尸检脑标本43例,并按缺血时间(发病至死亡时间)分为7组,选取因其他疾病死亡(非脑缺血)的尸检脑标本6例为对照组;应用苏木素-伊红(HE)染色方法观察海马神经元形态变化;应用Aβ1-40和Aβ1-42免疫组织化学方法检测人脑梗死后海马CA1区两种蛋白在神经元中的表达情况;用末端脱氧核糖转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)标记凋亡神经元。结果海马CA1区,对照组Aβ1-40和Aβ1-42在神经元中均有微量表达,并且于缺血2 h后表达均迅速增加,Aβ1-40在72 h后达高峰[(36.30±2.67)个/高倍视野],Aβ1-42在24~47 h达高峰[(30.87±4.62)个/高倍视野],以后有所回落,但仍高于对照组。缺血6~23 h可检测到TUNEL阳性细胞,48~71 h达高峰[(27.56±6.76)个/高倍视野]。2~5 h受损神经元形态基本正常,24~47 h神经元形态学变化较为明显,72 h后,大部分神经元出现坏死特征。结论人脑梗死后海马CA1区Aβ1-40和Aβ1-42在神经元中的表达均增加,表明脑缺血可能导致这两种蛋白的聚集,同时Aβ的毒性作用可能对脑梗死后CA1区神经元的迟发性死亡起着一定的作用。     

Aβ对原代培养海马神经元NO、NOS和LDH影响及bFGF保护作用

目的　探讨β-淀粉样蛋白 (amyloid-beta protein,Aβ)对原代培养海马神经元一氧化氮 (NO)、一氧化氮合酶 (NOS)和乳酸脱氢酶 (LDH)的影响及碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)的保护作用。方法　通过测定原代培养新生大鼠海马神经元培养液中 NO、NOS及 LDH的含量变化 ,观察 Aβ1 -40对神经元的损伤及 b FGF的保护作用。结果　Aβ1 -40作用于海马神经元 2 4h后 ,培养上清液中 NO、NOS含量增加 ,LDH活性升高 ,与对照组比较差异有显著性 (P<0 .0 5 ,P<0 .0 1 )。经 b FGF预处理的海马神经元暴露于 Aβ1 -40 2 4h后 ,NO、NOS含量及 LDH活性均降低 ,且与损伤组比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　 b FGF对 Aβ诱导海马神经元损伤具有一定的保护作用。     

β淀粉样蛋白_(1-42)寡聚体和人重组α-突触核蛋白对原代培养神经元突触的影响

目的探讨α-突触核蛋白(α-Syn)和β淀粉样蛋白(Aβ1-42)寡聚体对小鼠原代皮质、海马神经细胞突触功能和活性的影响。方法分别采用二甲基亚砜、Aβ42-1寡聚体、α-Syn、Aβ1-42寡聚体、α-Syn+Aβ42-1寡聚体、α-Syn+Aβ1-42寡聚体干预小鼠原代皮质和海马神经元,按不同干预方法分为6组。干预24 h后用免疫荧光、FM1-43染色法检测神经元的突触数量及活性,同时用Western blot法检测半胱氨酸伸展蛋白α(CSPα)表达。结果与其余5组比较,α-Syn+Aβ1-42寡聚体组可使突触相关CSPα表达明显下降(P0.01)、与突触数目相关的突触蛋白Ⅰ明显降低(P0.01),同时突触活性也明显下降(P0.01)。结论α-Syn和Aβ1-42寡聚体可协同作用于神经元,减少CSPα表达,降低细胞突触数目及其功能。     

β淀粉样蛋白25-35诱导皮质神经元tau蛋白过度磷酸化

目前阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)研究仍缺乏理想的动物模型,细胞模型通过复制AD的某些分子生化改变,可用于研究AD的发病机制和筛选治疗药物。脑内β淀粉样蛋白(Aβ)的大量沉积和tau蛋白过度磷酸化是AD的两大主要分子生化改变。淀粉样瀑布学说认为Aβ可直接诱导神经元tau     

降低细胞胆固醇水平对β-淀粉样肽生成的影响

目的观察降低细胞胆固醇水平对β-淀粉样肽(β-amyloid,Aβ)生成的影响,初步探讨胆固醇和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的相关性。方法以稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为模型,分别给予β-甲基环糊精或洛伐他汀对细胞系进行处理;胆固醇定量试剂盒测定细胞内胆固醇水平的变化,放射免疫法测定细胞培养液中Aβ的含量,Western Blot方法半定量检测全长型APP和可溶性APPα的水平。结果β-甲基环糊精和洛伐他汀处理组分别降低细胞胆固醇水平67.5%和49.5%(P<0.05),细胞培养液中Aβ含量分别降低39.5%和25.7%(P<0.05),sAPPα含量分别增加3.5倍和2.0倍(P<0.05)。结论降低细胞胆固醇水平使细胞外Aβ含量减少,sAPPα含量增加,这提示胆固醇可能通过影响APP代谢途径而参与AD的病理过程。     

Aβ25-35注射诱导大鼠海马神经元tau蛋白异常磷酸化

目的　观察大鼠海马背侧注射凝聚态Aβ2 5 3 5后 ,神经元ser199/ser2 0 2、ser396、thr2 31等位点tau蛋白磷酸化的水平以及糖原合成激酶 3β(GSK 3β)的活性变化 ,探讨Aβ2 5 3 5与tau蛋白异常磷酸化的关系及机制。方法　应用脑立体定向技术给成年大鼠海马背侧注射凝聚态Aβ2 5 3 55nmol,术后 14d ,采用镀银染色方法观察海马组织神经元病理改变 ,免疫组织化学染色方法和免疫蛋白印迹技术观察大鼠海马tau [pS3 96]、tau [pSpS199/ 2 0 2 ]、tau [pT2 3 1]的表达水平 ,免疫蛋白印迹技术检测海马GSK 3β和磷酸化GSK 3β的水平变化。 结果　凝聚态Aβ2 5 3 5组神经元纤维走行紊乱、增粗、肿胀 ,密集成宽带状 ,轴突深染。海马神经元tau [pS3 96]、tau [pSpS199/ 2 0 2 ]、tau [pT2 3 1]的阳性表达数 (分别为 38 2± 5 9,10 7 6± 8 4 ,78 4± 3 7)明显高于正常组和生理盐水组 (P <0 0 1) ,GSK 3β和磷酸化GSK 3β的水平亦明显高于正常组和生理盐水组。 结论　海马背侧注射Aβ2 5 3 5可通过激活GSK 3β诱导tau蛋白发生异常磷酸化。     

糖皮质激素促β-淀粉样蛋白致海马神经元损伤

目的 探讨糖皮质激素(glucocoricoids, GCs)促进β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)引起海马神经元损伤的机制.方法 地塞米松(dexamethasone, DEX)和β-淀粉样蛋白与胎鼠海马神经细胞共同孵育后,用Western blot方法检测空白组、DEX组、Aβ组、DEX+Aβ组核因子KB (nuclear factor KB, NF-KB)、 p-tau在细胞内的表达情况.结果 与同剂量Aβ组相比,DEX+Aβ组的核NF-KB蛋白含量降低约49.2%, p-tau蛋白含量增加约150%,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 在体外条件下GCs可能通过下调NF-KB蛋白水平、上调p-tau蛋白水平促进Aβ引起海马神经元损伤.     

一氧化氮供体SNP和DEA对培养海马神经元L-型钙电流的影响

目的观察NO供体DEA和SNP对大鼠海马培养神经元L-型钙电流的影响并对其机理进行初步探讨。方法L-型钙电流用膜片钳的全细胞模式进行记录。结果DEA和SNP这二种NO供体的主要效应为抑制作用。3 mmol/L DEA可抑制L-型钙电流,当电压去极化至10mV时,电流被抑制了29%。SNP对通道也主要起抑制作用,并且呈现剂量依赖性。当用NEM预处理以阻断S-亚硝化通路后,SNP仍对L-型钙电流产生相似的抑制作用,表明S-亚硝化机制不参与该调控作用。用10μmol/L ODQ预处理以阻断cGMP途径后,SNP仍对通道有抑制作用,表明存在另一种非cGMP通路的抑制性机制。结论上述结果表明,NO供体DEA和SNP对海马神经元L-型钙电流具有抑制作用,其作用机理主要是通过与cGMP途径和S-亚硝化修饰无关的途径。     

碱性成纤维细胞生长因子对β-淀粉样蛋白和H2O2致培养海马神经元损伤的保护作用研究

探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对β-淀粉样蛋白(Aβ1-40)和过氧化氢(H2O2)致海马神经元损伤的保护作用和机制，我们对培养海马神经元分别施加损伤或保护因素后，检测神经元存活率和细胞内游离钙离子浓度([Ca^2 ]i)。     

β-淀粉样蛋白对大鼠海马和额叶细胞外液氨基酸的影响

为研究β 淀粉样蛋白 (Ａβ)的神经损害机制 ,我们观察了Ａβ注入大鼠迈内特基底核 (ＮＢＭ)后学习记忆的改变 ,额叶皮层、海马区细胞外液谷氨酸 (Ｇｌｕ)、甘氨酸 (Ｇｌｙ)、牛磺酸(Ｔａｕ)和γ氨基丁酸 (ＧＡＢＡ)等的浓度改变以及尼莫地平的作用。材料和方法 :　健康雄性ＳＤ大鼠 3～ 4月龄 ,体重 180～2 5 0ｇ ,随机分成对照组、模型组和治疗组 ,每组 8只。将 10μｌ的Ａβ(ＲＢＩ,美国 )在立体定位仪下注入大鼠ＮＢＭ。对照组在ＮＢＭ处注入 10 μｌ生理盐水 ,治疗组在建立模型后每天腹腔注射尼莫地平 (Ｂａｙｅｒ公司 ,5 0 μｇ/ 10 0…     

β-淀粉样蛋白对海马长时程增强的影响及作用机制

阿尔茨海默病(AD)是老年人群中最普遍的神经退行性疾病,其主要特征是海马区淀粉样蛋白寡聚体的沉积.β-淀粉样蛋白(Aβ)聚合成寡聚状态被认为是AD发病过程中最重要的环节,而海马区是AD发病中的最敏感的区域.AD的早期临床症状即包括与海马相关的认知功能的下降,如空间学习和记忆能力的下降等.长时程增强(LTP)是反映突触可塑性的重要指标之一,被认为与学习和记忆的形成有关.本文结合近年来相关研究,就Aβ对海马LTP的影响及其主要机制作一阐述.     

NGF和MK801对Aβ25-35诱导海马细胞损伤的干预作用

目的 探讨神经生长因子（NGF）和MK801对Aβ25－35的细胞毒性的干预作用。方法 将培养7天的3天内新生大鼠海马细胞分别加入NGF（10ng/ml)、MK801（10μg/ml)、等体积培养液前后，加入b-淀粉样蛋白25－35（Aβ25－35，10μg/ml)，采用β－tublin、MAP2免疫组化鉴定是否为结构完整的海马神经元，MTT检测细胞活力，以及ChAT免疫组化检测免疫阳性细胞数目。结果 β－tublin、MAP2免疫组化证实所培养的为特异性结构完整的海马神经元。MTT及免疫组化检测显示Aβ25－35导致细胞活力显降低及ChAT免疫阳性细胞明显减少，NGF、MK801可有效预防Aβ25－35诱导的神经毒作用（P＜0．01），以及可轻度改善Aβ25－35诱导的神经毒作用，但无统计学意义（P＞0．05）。结论 NGF和MK801能有效地阻和轻度地修复Ab25-35诱致的海马细胞损伤，对阿尔茨海默病的防治提供了一定的实验依据。     

人脑梗死后海马β-淀粉样蛋白及载脂蛋白E的表达

目的 研究人脑梗死后海马β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)、β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)和载脂蛋白E(ApoE)在海马神经元中表达的时空变化.方法 选取因脑梗死尸检脑标本43例以及因其它疾病死亡(非脑缺血)的尸检脑标本6例(对照组),应用HE染色方法观察海马神经元形态变化,应用免疫组化方法检测人脑梗死后这3种蛋白分别在海马CA1和CA3区神经元中的表达情况.结果 在对照组和梗死组中,这3种蛋白在神经元中均有表达,且均主要表达于胞浆.Aβ1-40和Aβ1-42的表达于梗死后均迅速增加,ApoE的表达在梗死后亦增加.结论人脑梗死后海马CA1和CA3区Aβ1-40、Aβ1-42和ApoE在海马CA1和CA3区神经元中的表达均增加,脑梗死可能导致了这3种蛋白的聚集,同时Aβ和ApoE表达的上调可能部分解释了脑梗死在AD的发病机制中所起的作用.     

海马注射β-淀粉样蛋白建立阿尔茨海默病大鼠模型的实验研究

目的：海马注射β-淀粉样蛋白（Aβ）建立阿尔茨海默病（AD）大鼠模型，并进行初步评价。方法：应用凝聚态Aβ1-40进行大鼠右侧海马齿状回（DG）背侧细胞带微量注射，2周后从学州记忆、海马组织病理和异常磷酸化tau蛋白表达的变化3个方面评价大鼠模型。结果：Aβ1-40注射后大鼠Morris水迷宫学习记忆能力明显受损（P〈0．01）；注射区内DG背侧细胞带神经元丢失（P〈0．01）；注射侧海乌内Aβ沉积；海马神经元内异常磷酸化tau蛋白的表达显著增加（P〈0．01）。结论：凝聚态Aβ1-40海马注射具有明确的在体神经毒性作用，可导致大鼠认知功能下降以及海马内Aβ沉积、神经元丢失和神经元内异常磷酸化tau蛋白的表达，可成功建立AD大鼠模型。     

大鼠前脑不全缺血再灌注后海马区β-淀粉样蛋白的表达

目的　观察大鼠不全性脑缺血再灌注损伤后海马区神经细胞死亡及β 淀粉样蛋白 (Aβ)的表达。方法　应用HE和免疫组化染色方法观察大鼠 2条血管闭塞致大脑不全性缺血再灌注后 6h及 2、3、7、14和 35d不同时间海马区神经细胞死亡和Aβ的表达。 结果　大鼠不全性脑缺血再灌注损伤 3d后 ,海马CA1区神经细胞发生迟发性死亡 ;再灌注 2d后 ,Aβ的表达开始增强 (A值为 0 0 82±0 0 11) ;再灌注 7d达到高峰 (A值为 0 175± 0 0 2 4) ,35d时消失 (A值为 0 0 12± 0 0 0 3)。结论　大鼠短暂性不全性脑缺血再灌注损伤后 ,海马CA1区神经细胞发生迟发性死亡 ,同时Aβ表达上调 ,提示Aβ可能在再灌注损伤后海马CA1区神经细胞迟发性死亡过程中起重要作用。     

凝血酶对原代培养海马神经元游离钙浓度的影响

目的研究原代培养的海马神经元内游离Ca2 水平及凝血酶的影响.方法大鼠海马神经元进行体外原代培养,用钙离子指示剂Fura-2双波长法测定海马神经元内游离[Ca2 ]i及不同浓度的凝血酶作用后细胞内[Ca2 ]i.结果原代培养的海马神经元生长旺盛,密度高,符合实验要求.在胞外Ca2 浓度为0.0 mmol/L时,静息状态下海马神经元游离[Ca2 ]i为(79.83±18.78)nmol/L.当胞外Ca2 浓度为1.3 mmol/L时,海马神经元游离[Ca2 ]i为(106.41±22.53)nmo1/L.(1～40)U/ml凝血酶可使海马神经元内游离Ca2 水平显著升高,与对照组相比均有显著性差异(P＜0.01).随凝血酶浓度的增加,胞内游离[Ca2 ]i之呈剂量依赖性增加.结论凝血酶可使原代培养的海马神经元内游离Ca2 浓度明显升高.