晚期糖基化终末产物与糖尿病皮肤微血管病变的相关性研究

目的　研究晚期糖基化终末产物 (AGE)与糖尿病 (DM)皮肤微血管病变的关系 ,探讨DM创面新生血管化障碍或延迟的机制。方法　应用链脲佐菌素 (STZ)将SD大鼠诱导成速发型DM大鼠模型 ,并以正常SD大鼠作为对照 ,于致病后 12周获取大鼠背部中央的皮肤标本。应用F 30 10荧光分光光度计和免疫组织化学技术测定皮肤中AGE含量的变化 ;应用透射电镜观察皮肤微血管超微结构的改变。再选用人脐静脉内皮细胞株ECV30 4细胞与不同浓度的AGE修饰人血清白蛋白 (AGE HSA)在体外共同培养 ,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测AGE对人血管内皮细胞活性的的影响。结果　DM大鼠皮肤胶原提取液的荧光值明显高于相应年龄的正常大鼠 (P <0 .0 1) ;免疫组织化学检测显示DM大鼠皮肤中AGE呈片状或块状沉积 ,其表达阳性率和强阳性率显著高于正常大鼠 (P <0 .0 1) ;DM大鼠皮肤普遍存在微血管病变 ,主要表现为血管内皮细胞变性和基底膜增厚 ;内皮细胞经 10 0 μg/mlAGE HSA干预 6h后 ,采用MTT法测定其吸光度值显著低于正常大鼠 (P <0 .0 1) ,流式细胞仪测定的各时相点凋亡细胞百分率亦明显高于正常大鼠 (P <0 .0 1) ,且均呈时间和剂量的依赖性。结论　AGE是DM皮肤微血管病变的重要致病因素 ,亦是DM合并创伤后新生血管化障碍或     

晚期糖基化终产物刺激内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1信号传导途径

目的　研究晚期糖基化终产物 (AGE)修饰蛋白对人内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)的影响及其作用的信号传导途径。方法　将培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)和人内皮细胞株ECV30 4与不同浓度AGE修饰的人血清白蛋白 (AGE HSA)或牛血清白蛋白 (AGE BSA)共同培养。用Western印迹及酶联免疫吸附法 (ELISA)检测MCP 1蛋白合成及分泌 ,用逆转录PCR(RT PCR)法检测MCP 1mRNA表达 ,用流式细胞术观察细胞内氧化应激 ,用免疫沉淀 激酶活性测定法分析细胞p38丝裂素活化蛋白激酶 (p38 MAPK)活性。结果　AGE HSA和AGE BSA以时间和剂量依赖的方式上调内皮细胞MCP 1mRNA和蛋白的表达并诱导细胞氧化应激和活化p38 MAPK。 5 0 μg/mlAGE HSA与HUVEC共同培养 12h ,使细胞上清中的MCP 1浓度由 4 8 3pg/μg± 0 6pg/μg蛋白上升至 14 8 1pg/μg± 12 6pg/μg蛋白 (P <0 0 1)。5 0 μg/mlAGE HSA与HUVEC共同孵育 30min ,使p38 MAPK的磷酸化活性升高 91%± 14 % (P <0 0 1)。抗氧化剂或p38通路特异阻断剂SB 2 0 35 80能够阻断AGE修饰蛋白诱导的MCP 1表达。结论　AGE修饰蛋白能够通过p38 MAPK信号传导途径上调内皮细胞分泌MCP 1,这一作用是经氧化应激机制介导。     

去甲斑蝥素对人脐静脉内皮细胞株的细胞毒作用

研究中药抗癌与抑制血管形成之间的关系。应用细胞形态学、细胞生长曲线、MTT检测、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪检测方法等。结果表明去甲斑蝥素对体外培养的人脐静脉内皮细胞有显著的生长抑制作用 ,药效呈时间依赖性 ,并在一定范围内 (5～ 80 μmol/L)与剂量呈正相关 ,半有效量为 4 0 μmol/L。形态学观察证明给药后 2 4h ,坏死细胞数随给药浓度增多。分离提取细胞DNA ,在琼脂糖凝胶电泳后可见弥散状核酸降解带 ,未见典型的细胞凋亡梯状带。流式细胞仪检测表明 ,随着给药浓度增高 ,四倍体细胞数显著增多 ,不见明显的凋亡细胞峰。表明去甲斑蝥素对人脐静脉内皮细胞有较强的细胞毒作用 ,并能抑制细胞正常分裂。     

人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞的生物学特性研究

目的 获得人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞,了解其生物学特性.方法 采用本室建立的人永生化成骨细胞(hFOB1.19)恶性转化细胞株(转化细胞),用抗黏附培养法,模拟脱离基质情况,获得抗失巢凋亡细胞.电子显微镜、荧光显微镜和流式细胞仪观察悬浮培养后不同时相点细胞的形态学改变和凋亡率.MTT法、Transwell小室分别检测细胞增殖情况和细胞的迁移能力.结果 形态学观察可见到典型的凋亡细胞,流式细胞仪检测细胞悬浮后24、48、72 h的凋亡(PI染色)情况,凋亡率逐渐升高.抗失巢凋亡细胞再次悬浮同时相凋亡率与转化株相比下降;抗失巢凋亡细胞较对照组(转化细胞)的细胞增殖能力增强,迁移能力增强,转化细胞差异有统计学意义(P＜0.05).结论 经过14 d的悬浮培养处理后,获得的人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞小仅抗失巢凋亡能力有所增强,增殖能力和迁移能力也有增强.     

长春瑞滨联合外照射对人乳腺癌MCF-7细胞作用的研究

目的　研究长春瑞滨联合外照射对人乳腺癌MCF - 7细胞的抗肿瘤机制。方法　采用MTT法检测长春瑞滨对MCF - 7细胞毒作用 ,流式细胞仪检测各组细胞周期分布、细胞凋亡指数 ,电子显微镜观察MCF - 7细胞凋亡的形态学特征。结果　MTT检测表明 ,长春瑞滨给药 2 4h的IC50 为 7.2 0 μg/ml。流式细胞仪细胞周期分析显示 :C组细胞大多处于G1～S期 ,V组G2 相细胞明显高于对照组 ,V组G2 相细胞与C组及R组相比均差异显著 (均P <0 .0 5 )。流式细胞仪检测各组MCF - 7细胞凋亡结果显示 :R组、V组、V +R组在不同时间内的平均凋亡指数分别为 2 .98± 3 .90 %、8.0 1± 1.87%、15 .5 7± 5 .2 3 % ,(V +R)组与V组及R组相比均差异显著 (均P <0 .0 5 )。透射电镜观察到MCF - 7细胞凋亡的形态学表现为染色质边集 ,胞浆浓缩 ,核固缩 ,可见有膜包绕的凋亡小体脱落。结论　长春瑞滨对乳腺癌MCF - 7细胞具有显著的细胞毒作用。它可诱导乳腺癌MCF - 7细胞生长阻止在G2 期 ,并能诱导它的凋亡。在照射前使用 ,能增强放疗对MCF - 7细胞凋亡的诱导作用     

Baicalein抑制人血管内皮细胞ECV-304的增殖和迁移

目的　探讨选择性 12 -脂氧酶抑制剂baicalein对血管内皮细胞增殖和移行的抑制作用。方法　采用倒置显微镜、光镜、流式细胞仪进行细胞周期分析、MTT检测、缺损闭合实验观察分析不同浓度baicalein作用后 ,人脐静脉内皮细胞系ECV 30 4细胞形态、增殖和迁移的变化。结果　 (1)不同浓度 (0 .1～ 10 0 μM )的baicalein处理ECV 30 4细胞 2 4～ 12 0h后或一定浓度 (30 μM)的baicalein处理ECV 30 4细胞不同时间 (1～ 6d)后 ,内皮细胞变形 ,有不同程度的变性、坏死 ,与baicalein的浓度和作用时间成正比 ;(2 )细胞周期分析显示baicalein处理后细胞周期阻滞在G0 /G1期 ,4 8h时相点最为显著 ;并在G0 /G1期前出现高于对照的凋亡峰 (Sub G1) ,12h时相点最高(10 .6 % ) (P <0 .0 1) ;(3)缺损闭合实验baicalein处理组的ECV 30 4细胞缺损区面积显著大于对照组 (P <0 .0 1)。结论　选择性 12 脂氧酶抑制剂baicalein抑制血管内皮细胞的增殖和迁移 ,初步证明亦有诱导凋亡的作用 ,在影响血管生成中有一定意义     

白藜芦醇对鼻咽癌细胞株 CNE-2Z 增殖和凋亡的影响

目的　探讨白藜芦醇 (resveratrol,Res)对鼻咽癌细胞株 CNE- 2 Z增殖和凋亡的影响。方法　采用 MTT法检测 IC50 值 ,流式细胞术、Hoechst 332 5 8/PI荧光染色和 DNA琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡。结果　不同浓度Res分别处理细胞 2 4 ,4 8和 72 h,其 IC50 值分别为 (10 9.2± 7.5 ) ,(83.6± 6 .0 ) ,(5 4 .3± 2 .8) μmol/L,各 IC50 值间比较差异显著 (P<0 .0 1)。2 5 ,5 0 ,10 0和 2 0 0 μm ol/L Res分别处理细胞 2 4 h后 ,5 0 ,10 0 ,2 0 0 μmol/L Res处理组经流式细胞术和荧光染色检测出的细胞凋亡率均明显高于对照组 (P<0 .0 1) ,荧光染色可见典型的凋亡形态学改变 ,10 0 ,2 0 0 μmol/L Res处理组可见明显的 DNA梯带。结论　 Res可通过诱导 CNE- 2 Z细胞株凋亡而抑制其增殖。     

脱氧核酶对人食管癌细胞增殖的影响

目的 :探讨针对增殖细胞核抗原 (PCNA)基因起始密码AUG的脱氧核酶 (DNAzyme)对人食管癌细胞(EC970 6 )增殖的影响。方法 :设计合成DNAzyme ,应用脂质体转染法将其转入体外培养的hEC。采用流式细胞仪测细胞周期 ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法分析hEC增殖活性。采用免疫组化 (SABC法 )检测PCNA蛋白表达。结果 :2 .0 μmol/LDNAzyme干预EC970 6 3d后 ,MTT比色吸光度值低于对照组 (P <0 .0 1)和反义寡聚核苷酸 (ASODN)组 (P<0 .0 5 )。DNAzyme和ASODN对吸光度值的抑制呈剂量依赖性。细胞干预 2d后 ,DNAzyme和ASODN均减少细胞核中棕黄色颗粒的表达 ;DNAzyme、ASODN和对照组的G0 /G1期细胞的比率分别为 72 .5 %、6 6 .8%和 5 6 .7%。结论 :针对PCNA的DNAzyme能调控细胞周期 ,有效抑制EC970 6的体外增殖。     

β-淀粉样蛋白25-35片段诱导PC12细胞凋亡

目的　探讨 β -淀粉样蛋白 2 5 - 35片段 (Aβ2 5-3 5)对体外培养的PC12细胞的毒性作用机制。方法　用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)代谢率检测 ,光镜吖啶橙荧光染色术 ,透射电镜以及流式细胞仪技术研究Aβ2 5-3 5损伤PC12细胞的途径。结果　用Aβ2 5-3 5处理PC12细胞 2 4h ,Aβ2 5-3 5剂量依赖性地引起PC12细胞的MTT代谢率减少 ,荧光染色及电镜观察发现经Aβ2 5-3 5处理的PC12细胞表现出凋亡细胞的特征 ,流式细胞仪检测发现 ,对照组 2 0 μmol/L及 5 0 μmol/L的Aβ2 5-3 5组PC12细胞的凋亡率分别为 0 .0 8%± 0 .0 1% ,14 .8%± 1.13% ,2 5 .9%± 2 .34%。结论　Aβ对PC12细胞的损伤主要通过细胞凋亡的途径     

hTR反义寡核苷酸对急性白血病原代细胞端粒酶活性及凋亡的影响

目的　探讨端粒酶RNA(hTR)反义寡核苷酸 (ASODN)对急性白血病 (AL)原代细胞端粒酶活性及细胞凋亡的影响。方法　应用与人hTR起始密码子互补的硫代ASODN处理AL原代细胞 ,用台盼蓝拒染的方法计数活细胞 ,用端粒酶重复扩增分析 (TRAP) -PCR -ELISA检测法观察端粒酶活性的变化 ,用Giemsa染色、Hoechst332 5 8 PI双染荧光显微镜检查及流式细胞仪检测凋亡细胞的发生。结果　经hTR -ASODN作用后 ,AL原代细胞端粒酶活性明显受到抑制 ,并与ASODN的浓度和处理时间相关 ,10 μmol/LASODN在作用 72h时端粒酶活性为( 0 0 95± 0 0 6 ) ,较细胞对照组 ( 1 15 4± 0 15 )下调明显 (P <0 0 1) ;在作用第 5天经荧光显微镜可观察到ASODN组细胞凋亡形态学变化。流式细胞仪检测到其凋亡率为 ( 31 72± 8 6 4 ) ,与细胞对照组的凋亡率 ( 6 33± 0 91)比较 ,差异有显著性 (P <0 0 1)。结论　hTR -ASODN可明显抑制AL原代细胞端粒酶活性并诱导其凋亡 ,hTR可能成为白血病基因治疗新靶点     

晚期糖基化终产物通过p38信号通路抑制内皮细胞合成一氧化氮的研究

目的　研究晚期糖基化终产物 (AGE)修饰蛋白对内皮细胞生成一氧化氮 (NO)的作用及p38丝裂素活化蛋白激酶 (MAPK)信号传导通路在此病理过程中的作用。方法　用来自培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)和人内皮细胞株ECV30 4。将内皮细胞与不同浓度的AGE修饰人血清白蛋白(AGE HSA)、AGE修饰牛血清白蛋白 (AGE BSA)在体外共同培养。用Griess法检测培养上清的NO水平 ;用免疫沉淀 激酶活性测定法测定细胞p38 MAPK活性。结果　AGE HSA和AGE BSA以时间和剂量依赖的方式抑制内皮细胞生成NO ,同时导致p38信号通路激活 ;未经修饰的HSA和BSA无此作用 ,AGE HSA和AGE BSA的抑制作用亦无明显差异 (P >0 .0 5 ) ;p38通路特异阻断剂SB 2 0 35 80完全阻断AGE修饰蛋白对内皮细胞生成NO的抑制效应 ,提示AGE修饰蛋白对内皮细胞的这一生物学作用是由p38通路介导的。AGE修饰蛋白激活HUVECp38通路。在AGE修饰蛋白作用 10min时 ,p38激酶磷酸化活性明显升高 ,在 30min时到达高峰 ,在 12 0min时回到基础水平。p38磷酸化激酶的磷酸化作用随着AGE修饰蛋白浓度的增高而加强。以ECV30 4细胞株为靶细胞时 ,AGE修饰蛋白对p38通路的活化作用与对HUVEC相同。AGE BSA对内皮细胞p38通路的活化作用与AGE HSA相同。结论本研究证实 ,AGE修饰蛋白能     

银杏黄酮苷元对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响

目的：体外观察银杏黄酮苷元（GA）对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖作用的影响,初步探讨其对内皮细胞的保护作用。方法：分别设对照组、空白组和实验组;实验组设GA6.25、12.5、25、50、100、500 mg/L共6个浓度孵育ECV304 48 h,25 mg/LGA与ECV304共同孵育6、12、24及48 h共4个时间点,采用MTT比色法观察GA对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响。结果：6.25～50 mg/L GA与ECV304共同培养48 h,细胞形态基本正常,细胞增殖率均大于100%,与对照组（未加药）比较差异显著（P〈0.05）,且各组细胞增殖率随药物浓度增加而增加,P〈0.05;GA25 mg/L和脐静脉内皮细胞ECV304共培养6～24 h,各组细胞增殖率随作用时间延长而增加,各组间比较差异显著（P〈0.05）。结论：银杏黄酮苷元促进人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的作用具有时间和浓度效应,提示GA具有保护血管内皮细胞的作用。     

alphastatin抑制体外内皮细胞血管生成及其作用机制的实验研究

目的探讨人纤维蛋白原α链末端的24个氨基酸片断alphastatin对人脐静脉来源内皮细胞(ECV304)血管生成抑制作用及机理。方法体外培养ECV304细胞,分别测定alphastatin对其迁移、增殖和体外管状结构形成的作用。用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)定性检测ECV304细胞中鞘氨醇激酶(SPK)mRNA的表达。分别以10、100、1000nmol/Lalphastatin处理ECV304细胞,提取细胞蛋白质,通过三磷酸腺苷(ATP)检测细胞SPK酶活性。结果不同浓度alphastatin处理组中ECV304细胞迁移的数目,分别为(103±4)个、(75±3)个、(13±1)个,低于对照组的(131±4)个,均P<0·05。alphastatin浓度为100nmol/L、1000nmol/L时,形成管状结构的面积分别为(1509±30)μm2/视野和(1301±20)μm2/视野,也明显低于对照组的(2996±31)μm2/视野,均P<0·05。alphastatin对ECV304细胞增殖的影响差异无统计学意义。RT-PCR证实ECV304细胞SPKmRNA的表达。与对照组比较,alphastatin降低ECV304细胞内1-磷酸鞘氨醇(S1P)生成量,当其浓度为100nmol/L,作用时间为12h时,效应最明显。结论体外实验证实alphastatin具有明显抑制ECV304细胞血管生成的作用,这种效应与降低细胞SPK活性、减少S1P的生成有密切关系。     

糖尿病皮肤病理生理改变及其机制的研究

目的研究糖尿病皮肤伤前潜在的病理生理改变及其形成的机制。方法将16只8周龄雄性SD大鼠随机分为糖尿病组(8只)和正常对照组(8只)。致病12周后,肝素抗凝血收集血浆,取背部全层皮肤组织标本。测量血浆中糖化蛋白(GSP)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH);观察皮肤组织学的改变,检测表皮厚度、表皮细胞周期、皮肤组织糖和AGEs含量;建立AGE-HSA干预的细胞培养体系,观测AGEs干预后表皮细胞周期和ECV304细胞的生长抑制。结果糖尿病大鼠毛色灰暗、枯黄、体质量减轻,皮肤明显变薄,表皮细胞数量减少,复层排列缺乏,表皮厚度[(0.016±0.007)mm]明显薄于正常对照大鼠[(0.037±0.007)mm],差异有统计学意义(P<0.01);真皮层部分胶原萎缩、肿胀,退化变性,并伴随程度不等的炎性细胞浸润;皮下脂肪进行性萎缩或消失。糖尿病大鼠血浆GSP和MDA含量升高,GSH下降,皮肤糖含量和胶原提取液的荧光值也显著升高(P均<0.01),真皮基质AGEs蛋白表达强烈且广泛,有的相互连接呈片状,正常大鼠真皮基质中亦出现AGEs蛋白的阳性表达,但均散在且淡染。糖尿病大鼠皮肤组织S期表皮细胞百分数(4.83±2.16)%与正常大鼠(5.01±2.47)%相比,差异无统计学意义(P>0.05),但进入G2/M期表皮细胞百分数(0.80±0.62)%比正常大鼠(2.86±1.10)%明显减少(P<0.05),而原代培养的表皮细胞经150μg/ml AGE-HSA干预48 h后,S期和G2/M期细胞比例均显著低于对照组(P<0.05)。ECV304细胞在12.5、25及50μg/ml AGE-HSA作用48 h后,细胞凋亡百分率与对照组比较仍无显著性差异,而在100或200μg/ml AGE-HSA作用6、12、24及48 h后,各时相点的细胞凋亡百分率明显高于对照组(P均<0.01),且呈时间和剂量依赖性。结论糖尿病皮肤组织局部高糖和AGEs等毒性物质蓄积所致的皮肤组织自身的细胞或基质功能不良,是糖尿病皮肤损害的重要机制之一。     

晚期糖基化终末产物修饰人血清白蛋白对离体角质形成细胞迁移功能的影响

目的 探讨晚期糖基化终末产物(AGE)对大鼠离体表皮角质形成细胞迁移功能的影响及其可能机制.方法 制备AGE修饰人血清白蛋白(AGE-HSA),加入分离自正常SD大鼠背部表皮组织的角质形成细胞培养体系(终浓度60μg/ml,AGE-HSA组),并设空白对照组.以噻唑盐(MTT)比色法测定2组角质形成细胞培养12、24 h贴壁率(以吸光度值表示);划痕实验和Transwell实验观察细胞迁移数;流式细胞仪观察细胞整合素α3的表达;扫描电镜观察细胞伪足形成情况;免疫荧光染色法观察细胞微丝形态变化.结果 AGE-HSA组和空白对照组培养12 h的贴壁率分别为0.112±0.022、0.122±0.004(P<0.05),培养24 h的贴壁率分别为0.173±0.012、0.267±0.024(P<0.05);划痕实验迁移细胞数分别为(7±4)和(61±11)个/HP(P<0.05),Transwell实验迁移细胞数分别为(72±18)和(288±52)个(P<0.05);角质形成细胞整合素α3表达量分别为(3.2±1.2)%和(36.6±11.2)%(P<0.05).AGE-HSA组细胞的伸展、伪足形成及微丝形成均受到抑制.结论 高糖环境下AGE的大量蓄积对角质形成细胞的迁移有明显抑制作用,其作用机制可能与AGE及其受体途径以及整合素细胞内转导途径异常有关.     

Effects of advanced glycation end-products on cell cycle distribution and apoptosis in neonatal rat cardiac myocytes]

OBJECTIVE: To investigate the effects of advanced glycation end-products (AGEs) on cell cycle distribution and apoptosis in neonatal rat cardiac myocytes (CMs) cultured in vitro. METHODS: CMs already cultured for 3 to 5 d in vitro were continuously cultured with DMEM supplemented with 1% or 10% fetal bovine serum for 24 h, prior to exposure to AGE-modified human serum albumin (AGE-HSA, at 50 and 100 microg/ml) for 12, 24 and 48 h. Cells cultured in the same manner but without AGE-HSA treatment served as the control group. All cells were collected and analyzed by flow cytometry for cell cycle distribution and cell apoptosis, and the number of apoptotic body/nucleus of CMs was determined by in situ cell death detection kit (fluorescein). RESULTS: AGEs had no obvious effects on cell cycle distribution in CMs, but could increase the number of apoptotic body/nucleus of CMs in a time-dependent manner to up to 0.55 and 1.23 times at 24 and 48 h respectively, as compared with the number at 12 h in control cells. AGEs at 50 and 100 microg/ml increased the number of apoptotic body/nucleus of CMs to various degrees at different time points: 0.74 and 1.21 times respectively at 12 h; 1.15 and 1.78 times at 24 h; 0.83 and 1.19 times at 48 h. The average number of apoptotic body/nucleus of the cells treated with 100 microg/ml AGEs at 12, 24, 48 h were 0.27, 0.29, 0.20 times respectively that of the cells with 50 microg/ml AGEs treatment. CONCLUSIONS: AGEs do not affect the distribution of cell cycle but can impair neonatal rat CMs by increasing their apoptosis rate.     

血凝素样氧化低密度脂蛋白受体与内皮细胞p38丝裂素活化蛋白激酶关系的研究

目的探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)活化人脐静脉内皮细胞p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路中的作用。方法培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用不同浓度的ox-LDL孵育,通过W estern印迹检测LOX-1、p38MAPK蛋白水平,逆转录聚合酶链法观察LOX-1 mRNA表达,并以LOX-1特异阻断性抗体(JTX92)预处理内皮细胞,检测p38MAPK蛋白水平。四氮唑蓝法观察ox-LDL对细胞活力的影响。结果ox-LDL引起内皮细胞形态结构的改变,而且抑制内皮细胞的生长(P<0.05);ox-LDL呈浓度依赖性地上调LOX-1蛋白和mRNA表达(均P<0.05),并呈浓度依赖性激活p38MAPK通路,不同浓度ox-LDL(25μg/m l,50μg/m l,100μg/m l)组p-p38MAPK蛋白质表达水平均明显高于对照组(48±7,79±15,113±14 vs 24±5,P<0.01);JTX92+ox-LDL(100μg/m l)组p-p38MAPK蛋白水平明显低于ox-LDL(100μg/m l)组,(58±13 vs 113±14,P<0.01)。结论ox-LDL通过LOX-1途径激活p38MAPK信号通路,LOX-1上调是ox-LDL致动脉粥样硬化的重要环节。     

重组腺相关病毒介导内皮抑素的表达及体外活性研究

OBJECTIVE: To construct the recombinant adeno-associated viral vector containing human endostatin gene (rAAV-hEndo) and observe the biological activity of the expressed human endostatin in vitro. METHODS: rAAV-hEndo was prepared using a helper virus-free packaging system. The rAAV viral genome titer was quantified by Taqman real-time PCR, and the endostatin expressed in human umbilical vein endothelial cell line ECV304 was detected by immunofluorescence staining. The effects of endostatin on ECV340 cells were evaluated by MTT cell proliferation assay, cell cycle analysis and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling (TUNEL) technique. RESULTS: The viral titer of rAAV-hEndo prepared was 2 x 10(12) vg/ml and the vector had an infection efficiency of 98%. Immunofluorescence staining showed that the human endostatin protein was expressed mainly in the cytoplasm of ECV304 cells, and the proliferation of the cells was obviously inhibited by the supernatant of rAAV-hEndo, with a inhibition rate of 67.3% 72 h after the addition of the supernatant. ECV304 cells infected with rAAV-hEndo were obviously arrested in G(1) phase, and the G(1)-phase cell percentage of treatment group were significantly higher than that of control group [(72.5+/-4.0)% vs (52.1+/-2.1)%, P<0.01]. ECV304 cells infected with rAAV-hEndo demonstrated markedly enhanced apoptosis, with a significantly greater apoptotic index than that of the control cells [(32.6+/-3.2)% vs (4.2+/-1.9)%, P<0.01]. CONCLUSION: rAAV-hEndo can effectively mediate the expression of biologically active human endostatin, which may facilitate further study of antiangiogenic gene therapy with endostatin for cancers.     

Effect of pingyangmycin on the growth and cell cycle of human vascular endothelial cells]

OBJECTIVE: To study the effect of pingyangmycin (PYM, bleomycin A5) on the proliferation and cell cycle of the cultured ECV304 cells, a human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) line. METHODS: The growth inhibition of PYM on ECV304 cells was measured by MTT assay and the changes in the cell cycle by flow cytometry. RESULTS: After 10 microg/ml PYM treatment of the cells for 24, 48, and 72 h, the inhibition rates were 44.7%, 59.7%, and 74.4% respectively, showing a dose- and time-dependent inhibitory effect, with the 50% inhibitory concentration (IC50) of PYM corresponding to treatment durations of 24, 48 and 72 h being 32.94, 2.56 and 0.75 microg/ml respectively. Flow cytometry showed that ECV304 cell cycle was arrested at G2-M phase after 24-hour treatment with 1 microg/ml PYM, with significant reduction in the cell ratio of S phase and increase of G2-M phase (P<0.01) CONCLUSION: PYM can effectively inhibit the proliferation of ECV304 cells, the mechanism of which might involve the blocking of cell cycle.