甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因功能的初步研究

目的 利用λRed重组系统敲除甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因构建突变株,并且制备相应的回复株,进而初步研究该基因的功能.方法 PCR扩增得到上、下游同源臂,与卡那霉素抗性基因片段共同构建打靶片段,将其浓缩后转化含λRed重组系统的甲型副伤寒沙门氏菌(50973株),经PCR鉴定后得到突变株;将重组酶表达质粒pACU184与ompW基因的调控区和编码区序列连接后电转入突变株中,双酶切鉴定得到相应的回复株;SDS-PAGE及Western blot鉴定野生株、突变株与回复株中OmpW蛋白的表达情况;生化鉴定野生株、突变株与回复株,并观察野生株与突变株生长曲线的差异;测定野生株、突变株与回复株活菌半数致死量( LD50),以此来观察ompW基因与细菌毒力的相关性.结果 在甲型副伤寒沙门氏菌50973株中成功敲除了ompW基因,并构建了相应回复株;野生株与回复株均可表达出OmpW蛋白,突变株没有出现该蛋白的表达;野生株、突变株与回复株生化鉴定结果均为甲型副伤寒沙门氏菌,且野生株和突变株生长无明显差异;三者LD50均不存在显著差异.结论 甲型副伤寒沙门氏菌的ompW基因与该菌致病毒力无相关性,但突变株的构建为后续研究该基因具体功能提供了基础.     

甲型副伤寒沙门氏菌蛋白指纹图谱的建立

目的:利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱建立甲型副伤寒沙门氏菌蛋白指纹图谱。方法:收集临床中分离获得的甲型副伤寒沙门氏菌36株,同时采集对照菌96株,对所收集的细菌利用16S rDNA测序技术进行分子生物学验证鉴定。利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱检测细菌蛋白,ProteinChip和Biomarker Wizard软件自动采集数据,将结果用BioMarker Patterns软件建立分类树鉴定模型,并进行盲法验证。结果:在相对分子质量(Mr)3 000～20 000范围内,捕获104个蛋白峰,其中90个蛋白峰差异有统计学意义(P<0.01),择优选出质荷比(M/Z)为10 061.7的蛋白峰建立甲型副伤寒沙门氏菌的分类树模型,甲型副伤寒沙门氏菌诊断的灵敏度和特异度通过盲法验证为100%。结论:采用SELDI-TOF MS技术建立的甲型副伤寒沙门氏菌的分类树诊断模型,可用于该菌的快速鉴定。     

甲型副伤寒沙门氏菌体抗原抗血清的简易提纯

目的 单克隆抗体以其结合抗原的专一性用于血清学检验是一种必然趋势,而多克隆机体则以其简易的制备方式在目前仍得到广泛的应用,但多克隆抗体的提纯仍有许多繁琐之处,使其优势受到影响。本试验以甲型副伤寒沙门氏菌体抗原多克隆抗体的制备及提纯为例,提出可行的更简易的提纯方法。方法 利用产G蛋白链球菌,以一种较为简易的特异性结合和解离的方法来纯化甲型副伤寒沙门氏菌体抗原免疫血清。结果 得到了特异性IgG抗体。结论 利用这种纯化方法在实验室简易可行。     

抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体的研制及 …

本文采用杂交瘤技术，制备了７株抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对３株ｍＡｂ（２Ｃ８，２Ｅ６和５Ｄ７０进行了鉴定，ｍＡｂ ２Ｃ８和５Ｄ７为ＩｇＭ，２Ｅ６为ＩｇＧ１亚类，可分别识别不同的抗原表位，均具有很强的特异性，即只与甲型副伤寒沙门氏菌及其鞭毛抗原起反应，而与相关肠道细菌：尼亚里木沙门氏菌，达卡沙门氏菌及伤寒沙门氏菌，乙型和丙型副伤寒杆菌，猪霍乱沙门氏菌，纽波特沙门氏菌等均无     

抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体的研制及初步应用

本文采用杂交瘤技术,制备了７ 株抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体（ｍ Ａｂ） 的杂交瘤细胞株。对３ 株ｍＡｂ（２Ｃ８、２Ｅ６ 和５Ｄ７） 进行了鉴定,ｍＡｂ ２Ｃ８ 和５Ｄ７ 为ＩｇＭ,２Ｅ６ 为ＩｇＧ１（κ）亚类,可分别识别不同的抗原表位,均具有很强的特异性,即只与甲型副伤寒沙门氏菌及其鞭毛抗原起反应,而与相关肠道细菌：尼亚里木沙门氏菌、达卡沙门氏菌及伤寒沙门氏菌、乙型和丙型副伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等均无交叉反应。免疫印迹显示,３ 株ｍＡｂ 只能与甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原Ｍｒ 为５２ ０００ 的蛋白结合。用ｍＡｂ ２Ｅ６ 和５Ｄ７ 建立的双ｍＡｂ 夹心ＥＬＩＳＡ 法,检测了１３ 例血培养阳性的副伤寒患者血清中的甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原,１２ 例呈阳性,阳性符合率为９２－３％ 。     

与HIV感染相关的宿主细胞蛋白

HIV是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体, 它主要有1型和2型.大多数AIDS是因为感染HIV-1而引起的.HIV是有包膜的逆转录病毒, 以芽生方式从细胞获得病毒包膜[1].     

甲型副伤寒杆菌ompA基因分布及重组表达产物的免疫学鉴定

目的 构建甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpA免疫原性和保护作用,检测甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.方法 采用PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增ompA基因,T-A克隆后测序并构建ompA基因原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rOmpA表达情况及其产量,采用免疫扩散法、微量肥达试验和Western blot鉴定其抗原性和免疫反应性.采用PCR检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.采用小鼠感染模型,了解rOmpA对甲型副伤寒杆菌50001株感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的ompA基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rOmpA表达量约为细菌总蛋白的65%.rOmpA能与其兔抗血清和甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生免疫反应(Western blot),并可在家兔中诱导产生抗体.94.9%(93/98)甲型副伤寒杆菌临床菌株含有ompA基因.100 μg和200 μg rOmpA对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和58.3%(7/12).rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5～1:40.结论 ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中分布广泛.rOmpA有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可考虑为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

HLA-DQA1基因多态性与HBV感染结局相关

目的探讨中国汉族人群人类白细胞抗原(HLA)-DQA1基因多态性是否与乙型肝炎病毒(HBV)感染结局相关联。方法以213例HBV自限性感染者和420例慢性乙肝患者为研究对象,应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术进行HLA-DQA1基因分型,用EPI和SPSS软件分析DQA1多态性的分布频率及其组间差异。结果DQA1*0102在慢性乙肝组的分布频率显著低于HBV自限性感染组(15.47%比较20.42%,P<0.05),而DQA1*0201在慢性乙肝组的分布频率显著高于HBV自限性感染组(10.48%比较6.10%,P<0.05)。调整性别、年龄等混杂因素影响的非条件logistic回归分析结果显示,与HLA-DQA1其他等位基因相比,携带DQA1*0102者降低慢性乙肝发生的风险(P<0.05,OR=0.69,95%C I:0.49-0.96),而携带DQA1*0201者增加慢性乙肝发生的风险(P<0.05,OR=1.77,95%C I:1.09-2.87)。结论HLA-DQA1基因多态性可能是影响HBV感染结局的重要宿主遗传因素。     

甲型副伤寒杆菌nmpC基因原核表达及表达产物免疫保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因nmpC的原核表达系统,确定其重组表达产物rNmpC免疫原性和保护作用,了解甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.方法 采用PCR和T-A克隆法从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中获得nmpC基因克隆并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rNmpC表达情况及其产量,采用免疫扩散法、Western blot和微量肥达试验鉴定其抗原性和免疫应答性.采用PCR和ELISA分别检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.采用小鼠感染模型了解rNmpC对甲型副伤寒杆菌致死性感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的nmpC基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rNmpC表达量约为细菌总蛋白的30%.rNmpC免疫家兔可产生抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号.所有甲型副伤寒杆菌菌株均携带nmpC基因并表达NmpC蛋白,但伤寒杆菌、乙型及丙型副伤寒杆菌未检出nmpC基因.100μg和200μgrNmpC对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和66.7%(8/12).rNmpC免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清仅对甲型副伤寒杆菌H抗原产生1∶5～1∶40的凝集效价.结论 NmpC是甲型副伤寒杆菌独有的序列保守、分布广泛且自然表达的外膜蛋白抗原,该外膜蛋白具有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可作为多价甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因构建及其表达产物免疫保护作用

目的 构建甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因及其原核表达系统,确定重组表达产物rSpaO-OmpA免疫保护作用.方法 采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因,构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组表达产物rSpaO-OmpA表达情况及其产量.采用免疫扩散法、微量肥达和Western blot法鉴定rSpaO-OmpA 抗原性和免疫反应性.采用小鼠感染模型了解rSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用,实验中采用重组表达的SpaO( rSpaO)及OmpA(rOmpA)作为对照.结果 所构建的spaO-ompA融合基因与spaO或ompA单基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％.所构建的原核表达系统E.coli BL21 DE3pET42a-spaO-ompA能高效表达重组融合蛋白rSpaO-OmpA.rSpaO-OmpA能与甲型副伤寒沙门菌全菌抗血清结合并产生阳性杂交信号,免疫家兔后可产生特异性抗体.100 μg或200 μgrSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率分别为66.7％ (8/12)和83.3％ (10/12),明显高于等量rSpaO及rOmpA( P＜0.05).rSpaO-OmpA免疫小鼠血清与不同副伤寒沙门菌H抗原的凝集效价为1∶5 ～ 1∶40、与rSpaO和rOmpA及rSpaO-OmpA免疫双扩散效价为1∶1 ～1∶16.结论 人工融合重组抗原rSpaO-OmpA免疫原性和免疫保护作用较等量rSpaO或rOmpA更强.     

深圳市罗湖区住院病人新型甲型H1N1流感感染情况分析

目的分析深圳市罗湖区住院病人新型甲型H1N1流感的感染情况,为辖区住院病人的甲流防控工作提供依据。方法采用描述性流行病学研究方法对深圳市罗湖区2009年11月至2010年2月期间深圳市人民医院和罗湖区人民医院的住院病人新型甲型H1N1流感的感染情况进行分析。结果在2009年11月至2010年2月期间共检测了292份疑似甲流的住院病人的咽拭子样本,共检出甲流感染者93例。2009年11月份住院病人感染甲流的人数最多,感染率高达68.18%。30岁以下的住院病人感染甲流的人数占住院病人感染甲流总数的81.7%。男女住院病人甲流的感染率比为1.21：1.结论甲流主要感染30岁以下住院病人,因此,需要加强对该年龄段有流感症状的住院病人的甲流排查和管理。     

精子发生相关基因DYS1的分析

用ＰＣＲ方法检测了核型正常（４６，ＸＹ）的９５例无精子症患者和３５例严重少精子症患者基因组ＤＮＡ中的ＤＹＳ１，发现４例无精子症患者有ＤＹＳ１的丢失，严重少精子患者中发现３例有ＤＹＳ１的丢失。结果表明：应用ＰＣＲ法检测ＤＹＳ１基因片段是切实可行的，对无精子症和严重少精子症患者的病因诊断具有一定的应用价值。     

汕头市濠江区甲型H1N1流感病毒感染状况

目的了解汕头市濠江区甲型H1N1流感感染状况,为防控措施提供科学依据。方法在2010年1-9月期间,开展3次人群甲型H1N1流感病毒感染状况横断面调查,采用血凝抑制法检测居民甲型H1N1流感病毒血清抗体,对结果进行统计分析。结果 3次人群甲型H1N1流感病毒感染血清学检测,共检测480人,总阳性率为15%,各月份阳性率逐次下降（1月为20%、3月为15.2%、9月为9.4%）;各年龄组人群中,6～岁组阳性率（30.2%）最高,16～岁组阳性率（15.1%）次之,0～岁组幼儿阳性率（8.3%）再次之,≥60岁老人组阳性率（6.3%）最低。结论濠江区人群甲型H1N1流感病毒感染率较低,人群免疫屏障尚未完全建立,适当接种甲流疫苗仍有必要。     

甲型H1N1流感病毒感染1例死亡病例临床与病理分析

目的了解甲型H1N1流感病毒感染患儿临床与病理特征。方法分析甲型H1N1流感病毒感染1例死亡病例临床资料和尸检结果,并结合文献分析。结果男性,1岁4个月,以咳嗽和发热起病,起病1d后即出现呼吸困难和呼吸衰竭。采用WHO推荐的RT-PCR法和国家流感中心推荐的分型方法,患儿咽拭子结果示甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性,2次气管抽取物培养均为肺炎链球菌。予机械通气等治疗无好转,入院第4天死亡。尸检结果显示：病变主要在肺脏,大体可见大片状实变,灰褐色,质韧;胸膜粘连广泛。镜下显示肺弥漫性肺泡间质增宽,大部分肺泡可见透明膜形成,肺泡有炎性渗出,可见中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞,肺泡上皮肿胀,有巨细胞形成,部分肺泡塌陷闭合,小部分肺泡扩张融合;细支气管和支气管黏膜见较多淋巴细胞浸润,局灶黏膜糜烂。脑、心、肝、脾、肾、肾上腺、胰腺和胃肠道病理改变不明显。结论本例甲型H1N1流感死亡患儿上呼吸道症状突出,病情进展快。病理改变主要在肺脏,以炎症渗出、炎细胞浸润和肺透明膜形成为主。死亡主要原因为急性呼吸窘迫综合征,呼吸循环衰竭。     

人感染甲型H1N1流感病毒的研究进展

2009年4月以来,包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了人感染甲型H1N1流感病毒疫情,WHO已于2009年4月29日将此次流感流行的预警级别不断提升至5级。现已基本明确,引起此次流感疫情的甲型H1N1流感病毒是猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的一种新型变异株。     

利用RNA干扰技术鉴定HCV复制相关的宿主基因

生物谷报道：HCV复制高度依赖于宿主的细胞因素。鉴定这些宿主因素不但有助于理解HCV感染生物学，而且有助于发现治疗HCV的新靶点。为了鉴定对HCVRNA复制起重要作用的宿主基因，研究人员筛选了源于Huh7的EN5—3细胞中的近4000条人类基因的小干扰RNA库（siRNA），对参与HCV复制的宿主基因进行了鉴定。该研究结果发表在5月的《肝病学》杂志上。     

甲型副伤寒杆菌鞭毛蛋白H1a基因原核表达系统构建及其表达产物的免疫原性和保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌（Salmonella paratyphi A）H1a基因原核表达系统，确定表达产物rH1a免疫原性和保护作用，检测甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达情况。方法 采用高保真PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增H1a基因，T-A克隆后测序，构建H1a基因原核表达系统pET32a-H1a-E．coli B121DE3。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查rH1a表达情况，Ni-NTA亲和层析法收集rH1a。采用Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性。建立PCR和ELISA检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达频率。观察rH1a对甲型副伤寒杆菌50001株感染小鼠的免疫保护作用。结果 与报道的相关序列比较，所克隆的H1a基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为99．59％。rH1a表达量为细菌总蛋白的60％左右。甲型副伤寒杆菌全菌抗血清能识别rH1a并与之结合。rH1a免疫家兔可产生抗体。100％（98／98）甲型副伤寒杆菌临床菌株均含有H1a基因并表达H1a。500μg rH1a灌喂或皮下注射免疫小鼠受甲型副伤寒杆菌50001株攻击后的存活率均为50．0％，若加入5μg rLTB，存活率分别上升至75．0％和66．7％。结论 本研究成功地从甲型副伤寒杆菌临床菌株中构建了H1a基因高效原核表达系统。rH1a有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用。甲型副伤寒杆菌临床菌株广泛存在H1a基因并高频率表达。     

北京市甲型H1N1型流感病毒基因检测与流行趋势分析

目的 通过对甲H1N1型流感病毒基因的检测分析,揭示其基因变异情况及探讨甲型流感病毒的流行趋势,为甲型流感的防控提供理论依据.方法 样本为患者鼻咽部的粘膜上皮细胞和分泌物.取200μL标本置于核酸分离纯化系统中提取核酸,然后以LightCycler 480 PCR仪进行核酸扩增,最后分析曲线判断结果.每份标本均对甲型H1N1流感病毒基质蛋白基因（M基因）、核蛋白基因（NP基因）、血凝素基因（HA基因）、人类的RNA酶P基因（RNase P基因）进行检测和分析.结果判定：M基因、NP基因、HA基因、RNase P基因均阳性,为真阳性;HA基因阴性,其它三种基因阳性,为可疑阳性.结果 共检测3673份样本,其中,阴性2404份,甲型流感阳性样本共1269份,阳性率34.5％;阳性样本中季节性甲型流感641份,占50.5％;甲型H1N1流感阳性628份,占49.5％（真阳性433份,占68.9％,可疑阳性195份,占31.1％）.在整个流行季,真阳性与可疑阳性在相同时间的检出率比值基本不变.甲型H1N1检出高峰在10月,季节性甲流则分别在9月和12月.中青年人群的阳性检出率为57.5％,儿童为39.9％,而60岁以上的老年人仅占2.6％.结论 甲型H1N1流感以M、HA、NP、RNaesP四种基因阳性毒株为主,其流行高峰出现在10月份,感染人群以中青年和儿童为主.