SiRNA沉默 HBx对 HepG2.2.15细胞人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

目的探讨应用RNA干扰技术沉默HBx对HepG2．2．15细胞中hTERT基因表达的影响。方法（1）将pSIHBV／X质粒转染HepG2．2．15细胞,RT-PCR法评估沉默效率。（2）MTT法检测转染24h、48h、72h后细胞增殖情况。（3）Real-timePCR和Westernblot检测hTERT表达情况。结果测序结果显示pSIHBV／X质粒构建正确;RT-PCR检测HBVX基因的沉默效率为53．6％;MTT检测结果显示转染24h、48h、72h后H印G2．2．15细胞的增殖受抑制,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;Real-timePCR和Western blot检测结果均显示,转染pSIHBV／X质粒后HepG2．2．15细胞中hTERT基因的mRNA水平和蛋白水平表达分别有不同程度的下调,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论siRNA沉默HBx基因可抑制HepG2．2．15细胞中癌症标志基因hTERT的表达。     

KLF4基因沉默对大鼠肝星状细胞 HSC-T6胶原代谢的影响及机制研究

目的：探讨大鼠KLF4基因沉默,对大鼠肝星状细胞HSC-T6胶原代谢的影响及其机制。方法设计并构建针对大鼠KLF4基因的3个干扰质粒（pGPU6-1,pGPU6-2,pGPU6-3）以及阴性对照。采用实时荧光定量RT-PCR（ Real-time RT-PCR ）和western blot的方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表达情况,筛选出沉默最好的干扰质粒,将筛选出来的干扰质粒pGPU6-3,转染大鼠HSC-T6细胞。转染24 h和48 h后分别采用Real-time RT-PCR法和western blot的方法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13,MMP-13）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）mRNA和蛋白的表达。 Real-time RT-PCR法以GAPDH为内参照,用2－ΔΔCt法进行分析计算。 western blot的方法以β-actin蛋白为内参照,进行分析。结果 Real-time RT-PCR结果显示, pGPU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TIMP-1相对于对照组的mRNA表达分别下降为0敂．358±0．038,0．298±0．041和0．478±0．048;而MMP-13 mRNA的表达则上升为1．712±0．034。 Western Blot检测中,pG-PU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后,以β-actin为内参照,Ⅰ型胶原蛋白,Ⅲ型胶原蛋白和TIMP-1蛋白的表达分别下降为0．326±0．051,0．283±0．074和0．331±0．039;而MMP-13蛋白的表达则上升为1．273±0．038。结论 KLF4基因沉默可以显著减少大鼠HSC-T6细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达,其机制与增加MMP-13表达,而抑制TIMP-1的表达有关。     

应用 RNA 干扰技术下调 ANXA3表达的 MDA-MB-231乳腺癌细胞株的建立

目的：建立针对膜联蛋白A3（Annexin A3, ANXA3）的shRNA稳定转染的乳腺癌细胞株MDA-MB-231,为后续进一步研究奠定基础。方法荧光定量RT-PCR及western blot方法检测两种乳腺癌细胞株（ MDA-MB-231及MCF-7）中ANXA3 mRNA及蛋白表达水平。构建沉默ANXA3基因的shRNA质粒3个（ ANXA3-sh1-3）及阴性对照质粒,脂质体法转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231;选出ANXA3沉默效果最好的干扰质粒做后续实验。嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞;Western blot 方法检测转染后细胞中ANXA3蛋白表达水平。结果 MDA-MB-231细胞中 ANXA3 mRNA及蛋白表达水平显著高于MCF-7中的表达（ P ＜0 k．05）;成功构建3个针对ANXA3基因的shRNA质粒;转染ANXA3-sh1～3及阴性对照质粒后MDA-MB-231细胞中ANXA3 mRNA表达水平分别为（0．0196±0．0002）、（0．0085±0．0002）、（0．0220±0．0035）、（0．0661±0．0057）,未转染的MDA-MB-231细胞中ANXA3 mRNA表达水平为（0．0692±0．0050）,脂质体组MDA-MB-231细胞中ANXA3 mRNA表达水平为（0．0652±0．0118）,ANXA3-sh2对MDA-MB-231细胞中ANXA3 mRNA沉默效率最高,达87．72％,因此后续实验选择ANXA3-sh2;嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞分别命名为MDA-MB-231-Sh及MDA-MB-231-NC细胞。 Western blot检测结果显示,MDA-MB-231-Sh细胞中ANXA3蛋白显著低于MDA-MB-231及MDA-MB-231-NC细胞中的表达（ P ＜0．01）。结论 MDA-MB-231细胞较MCF-7细胞高表达ANXA3,成功的建立了稳定下调ANXA3表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-231,为后续进一步研究ANXA3的表达及特性打下基础。     

信号转导和转录激活因子基因表达的抑制及其对HepG_2细胞增殖的影响

目的探讨应用RNAi技术沉默信号转导和转录激活因子(STAT3)基因对肝癌HepG2细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(SiRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞。通过半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测STAT3基因mRNA和蛋白水平的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染后细胞增殖的变化。结果成功构建了pGeneSil 1-shRNA-STAT3重组质粒,并转染HepG2肝癌细胞;半定量RT-PCR、Western blot结果显示,重组质粒转染组细胞的STAT3基因表达在mRNA及蛋白水平上显著低于对照组;MTT实验结果显示,重组质粒转染组细胞的增殖明显受到抑制。结论pGeneSil 1.0-shRNA-STAT3转染HepG2肝癌细胞后,可有效抑制STAT3的表达,并抑制肝癌细胞的生长及增殖。     

过表达SATB1对人原发性肝癌细胞HepG2增殖的促进作用

目的研究核基质结合蛋白SATB1对人原发性肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法脂质体介导pEGFP1 SATB1真核表达全长基因质粒转染人原发性肝癌HepG2细胞,分为实验组（pEGFP1 SATB1）、对照组（pEGFP1空载体）及空白对照组。RT PCR、Western blot检测转染后SATB1mRNA和蛋白表达变化情况,噻唑蓝（MTT）法、流式细胞仪检测SATB1全长基因转染对人原发性肝癌HepG2细胞生长、增殖的影响。结果与空白对照组及对照组比较,转染pEGFP1 SATB1后,HepG2中SATB1mRNA和蛋白表达明显增加,细胞生长曲线检测结果表明转导入pEGFP1 SATB1细胞增殖明显加快,细胞数明显增多;流式细胞仪检测结果表明,细胞周期中G0/G1期细胞明显减少,S、G2/M期细胞明显增多。结论SATB1能明显促进HepG2细胞增殖,其机制可能与参与调控细胞周期各期DNA复制、转录有关。     

hTERT siRNA对HepG2细胞hTERT表达及端粒酶活性的影响

目的研究siRNA技术对肝癌HepG2细胞系hTERT mRNA表达及端粒酶的抑制作用,探讨siRNA抑制肿瘤细胞的作用及机理。方法体外转录合成hTERT siRNA并转染入HepG2细胞株中,应用RT-PCR观察HepG2细胞中hTERT mRNA表达改变,Western blot检测hTERT蛋白的表达,应用末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定转染24h、48h后细胞端粒酶活性。结果hTERT siRNA转染后,对HepG2细胞hTERT mRNA和蛋白表达明显抑制。转染后24h端粒酶活性转染组均数为(0.167±0.019),与未转染组均数(0.823±0.027)、空质粒阴性对照组均数(0.826±0.031)比较,差异有统计学意义(P<0.05);48h端粒酶活性转染组均数为(0.153±0.017),与未转染组均数(0.816±0.022)、空质粒阴性对照组均数(0.809±0.028)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向hTERT的siRNA,能有效抑制肝癌细胞系HepG2 hTERT-mRNA和蛋白表达及端粒酶活性。     

趋化因子受体CXCR4及其配体CXCL12在肝癌侵袭 转移中的作用及机制

目的 探讨趋化因子受体 CXCR4 及其配体 CXCL12（CXCL12/CXCR4）在原发性肝癌侵袭转移中的作用 及机制。方法 分别采用 Western blot、免疫组化和 Real-time PCR 等方法检测 60 例肝癌及对应癌旁组织标本中 CXCL12/CXCR4 蛋白及 mRNA 表达水平。常规培养 4 种肝癌细胞（Huh7、MHCC97h、HepG2、Hep3B）和正常肝细胞 （7702）,Real-time PCR 检测上述细胞中 CXCL12、CXCR4 mRNA 的表达,筛选合适的实验细胞。将 CXCR4 干扰质 粒（sh-CXCR4）和对应空载体（sh-control）分别转染至 MHCC97h 构建稳转细胞系。Transwell 侵袭实验、细胞划痕实 验、MTT 实验分别检测 2 组细胞的侵袭、迁移和增殖能力。取稳定表达的 sh-control 和 sh-CXCR4 MHCC97h 细胞, 接种至 6 只裸鼠皮下,观察瘤体生长情况。Western blot 检测 sh-control 和 sh-CXCR4 MHCC97h 细胞及对应裸鼠移 植瘤中血管内皮生长因子-C（VEGF-C）的表达,同时对转染 CXCR 过表达质粒的 MHCC97h 中 VEGF-C 的表达水平 进行检测。结果 （1）Western blot、免疫组化和 Real-time PCR 的结果均证实肝癌组织中 CXCL12/CXCR4 蛋白及 mRNA 表达水平均高于癌旁组织。（2）Huh7、MHCC97h、HepG2、Hep3B 细胞中 CXCL12/CXCR4 mRNA 表达水平均高 于 7702 细胞,选取 MHCC97h 为实验细胞。转染 sh-CXCR4 的 MHCC97h 细胞的侵袭、迁移和增殖能力均明显低于 sh-control 组,同时接种含 sh-CXCR4 的 MHCC97h 细胞的裸鼠移植瘤的生长速度也明显小于 sh-control 组。（3）体外 和体内实验均证实 sh-CXCR4 组的 VEGF-C 表达水平均低于 sh-control 组,而过表达 CXCR4 后,VEGF-C 的蛋白表 达明显上调。结论 CXCL12/CXCR4 在原发性癌组织和肝癌细胞中呈现高表达,CXCL12/CXCR4 可能通过调控 VEGF-C 蛋白表达从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。     

木姜子乙醇提取物对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响及机制初探

目的：探讨木姜子乙醇提取物（Litsea pungens ethanol extract,LPEE）对肝癌细胞侵袭转移能力的影响及其相关机制。方法：MTT法测定LPEE对肝癌细胞株HepG2和QGY-7703的IC50;transwell迁移实验和matrigel侵袭实验检测LPEE对HepG2和QGY-7703细胞迁移和侵袭能力的影响;qRT-PCR和Western blot检测LPEE对各组细胞中E-cadherin和VEGF基因和蛋白水平的表达变化。结果：LPEE可显著抑制HepG2和QGY-7703细胞穿过transwell小室和matrigel基质胶的细胞数（P<0.05）;50和100 μg·mL^-1 LPEE作用组与0组相比,可明显降低VEGF mRNA和蛋白水平的表达（P<0.05）,而促进E-cadherin mRNA和蛋白水平的表达（P<0.05）。结论：LPEE可抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力,其机制可能与抑制VEGF表达和促进E-cadherin表达有关。     

Claudin-1荧光真核表达载体的构建及其在HepG2肝癌细胞中的表达

目的构建pDsRED1-Claudin-1重组质粒,并在HepG2肝癌细胞中进行表达。方法采用基因重组技术构建含Claudin-1开放读码框(ORF)基因的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRED1-Claudin-1。经PCR、酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HepG2肝癌细胞后,进行荧光检测和Western blot分析。结果成功构建真核表达质粒pDsRED1-Claudin-1,转染HepG2细胞后,经荧光检测和Western blot分析可见Claudin-1红色荧光融合蛋白正确表达。结论成功构建含Claudin-1 ORF基因的红色荧光蛋白报告载体,并在HepG2肝癌细胞中正确表达。     

大鼠Adrb3基因重组慢病毒干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞Adrb3表达的影响

目的 构建大鼠Adrb3 （rAdrb3） 基因慢病毒干扰载体, 筛选高效率rAdrb3基因干扰序列, 观察其对大鼠血管平滑肌细胞 （VSMC） Adrb3基因表达的影响, 为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法 设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列, 构建慢病毒干扰质粒并进行测序鉴定。三质粒法共转染293T细胞包装慢病毒, 测定慢病毒滴度。大鼠VSMC设置正常对照组 （Normal组）, 空载慢病毒组 （Lv-rAdrb3-shRNA-control组）,携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体1组 （Lv-rAdrb3-shRNA-1组）, 携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体2组 （Lv-rAdrb3- shRNA-2组）, 感染5 d后, 收集细胞。提取细胞总RNA和蛋白, Real-time PCR检测rAdrb3 mRNA表达, Western blot 检测rAdrb3蛋白表达。结果 构建2个携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体, 滴度均为2×108 TU/mL。慢病毒感染大鼠 VSMC 72 h后, 感染效率可达80%。与Normal组比较, Lv-rAdrb3-shRNA-1、 Lv-rAdrb3-shRNA-2组Adrb3 mRNA水平沉默效率为87.18%、 65.27% （P＜0.05）; 与Normal组比较, Lv-rAdrb3-shRNA-1、 Lv-rAdrb3-shRNA-2组rAdrb3蛋白水平沉默效率为85.57%、 70.04% （P＜0.05）。结论 成功构建并筛选出有效携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体, 可显著抑制大鼠VSMC Adrb3的表达。     

Potential histamine H2-receptor antagonists. 2. N-alpha-Guanylhistamine.

The agonist molecule, histamine, has been used as a starting point for the design of potential H2-receptor antagonists. Converting the side-chain amino group into a guanidine yielded the first histamine H2-receptor antagonist, Nalpha-guanylhistamine. Antagonism of H2 receptors was demonstrated by the inhibition of histamine-stimulated gastric acid secretion in the rat at high dose levels (approximate ID50 800 MUmol/kg, iv) and by the inhibition of histamine-stimulated tachycardia of guinea-pig right atrium (pA2 equals 3.9). Guanylhistamine behaves as a partial agonist at histamine H2 receptors.     

2-Spiro-indan-1,3-dione, 2. Mitt.

2-Spiro-indane-1,3-diones, II The 2-spiro-indane-1,3-dione 1a reacts with sodium borohydride. The enaminone chromophore remains intact, but the indandione part is reduced and two diols result. Their relative configurations were determined spectroscopically.     

Angiotensin-converting enzyme inhibitors. 2. Perhydroazepin-2-one derivatives

alpha-[(3S)-3-[[(S)-1-(Ethoxycarbonyl)-3-phenylpropyl]amino]-2-oxo-6 or 7-phenylperhydroazepin-1-yl]acetic acids (monoester monoacids) and their dicarboxylic acids were synthesized, and their angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory activities were evaluated. The dicarboxylic acids having phenyl substituents at the 6R, 6S, and 7S positions on the azepinone ring showed potent inhibition in vitro. The corresponding monoester monoacids, when administered orally, suppressed the pressor response to angiotensin I administered intravenously. The monoester monoacids having the phenyl substituent at the 6-position showed a longer duration of action than one having the substituent at the 7-position. The structure-activity relationship was studied on the basis of the conformational energy calculation.