hTERT siRNA对HepG2细胞hTERT表达及端粒酶活性的影响

目的研究siRNA技术对肝癌HepG2细胞系hTERT mRNA表达及端粒酶的抑制作用,探讨siRNA抑制肿瘤细胞的作用及机理。方法体外转录合成hTERT siRNA并转染入HepG2细胞株中,应用RT-PCR观察HepG2细胞中hTERT mRNA表达改变,Western blot检测hTERT蛋白的表达,应用末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定转染24h、48h后细胞端粒酶活性。结果hTERT siRNA转染后,对HepG2细胞hTERT mRNA和蛋白表达明显抑制。转染后24h端粒酶活性转染组均数为(0.167±0.019),与未转染组均数(0.823±0.027)、空质粒阴性对照组均数(0.826±0.031)比较,差异有统计学意义(P<0.05);48h端粒酶活性转染组均数为(0.153±0.017),与未转染组均数(0.816±0.022)、空质粒阴性对照组均数(0.809±0.028)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向hTERT的siRNA,能有效抑制肝癌细胞系HepG2 hTERT-mRNA和蛋白表达及端粒酶活性。     

山芝麻水提液对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的抑制作用

目的观察山芝麻水提液（water extracts from Helicteres angustifolia,WHA）的体外抗乙型肝炎病毒的作用。方法采用HepG2．2．15细胞模型进行体外培养,给予不同浓度山芝麻,以拉米夫定作阳性对照,作用72h后检测上清液中HBsAg、HBeAg的分泌,观察药物对HepG2．2．15细胞分泌HBV病毒抗原的影响,同时以MTT法检测药物在体外对HepG2．2．15细胞的生长抑制作用,从而评价药物的抗HBV作用。结果山芝麻水提液对HepG2．2．15细胞的半数细胞毒浓度（TC50）为482．1mg·L-1;对HepG2．2．15细胞分泌HBsAg的半数抑制浓度（IC50）为7．3mg。L-1,其治疗指数（TI）为66;对HBeAg,其Ic,n为14．6mg·L-1,TI为33。结论山芝麻水提液在体外有显著的抗HBV的作用,且毒性较低。Tel：（0771）5358342E—mail：gxLx60@163．COll]     

靶向siRNA下调人结直肠癌Colo320细胞端粒长度与端粒酶逆转录酶基因表达的研究

目的:探讨发夹状shRNA封阻原癌基因(c-myc),抑制癌细胞增殖、生长的作用。方法:针对c-myc的构建发夹状shRNA的真核表达质粒,并转染人结直肠癌Colo320细胞。荧光定量RT-PCR检测c-myc及细胞端粒酶逆转录酶的mRNA的表达,Western-blot检测c-myc、端粒酶逆转录酶(hu-man telomerase reverse transeriptase,hTERT)蛋白表达水平。Southernblot检测端粒的长度,PCR-ELISE法检测端粒酶活性。3H-thymidine实验分析DNA合成和细胞增殖。结果:转染细胞增殖、生长皆受到抑制。同时c-myc和hTERT的mRNA和蛋白表达显著下降,端粒的长度明显缩短,端粒酶活性降低。结论:c-myc的shRNA对人结直肠癌Colo320细胞的生长增殖、端粒长度、端粒酶活性有特异性抑制作用,并呈剂量依赖关系。     

慢病毒载体介导的针对端粒酶的RNA干扰技术对HepG2细胞的体外效应

目的 观察针对hTERT的siRNA对肝癌HepG2细胞的体外抑制效应.方法 将逆转录表达载体中的针对hTERT的siRNA序列亚克隆至慢病毒表达载体pWPT-GFP中,经293T细胞包装,收集病毒上清,感染肝癌细胞株HepG2.采用半定量RT-PCR法、TRAP法及MTT法,分别检测hTERT基因表达、端粒酶活性、肿瘤细胞生长抑制情况等.结果 限制性内切酶酶切分析表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的干扰RNA的慢病毒表达载体;以293T包装的重组慢病毒能够高效感染肝癌细胞,感染效率可达99%以上;在稳定表达pWPT-hTERT-siRNA的肝癌细胞中,hTERT mRNA表达水平、肿瘤细胞的体外增殖受到抑制.结论 慢病毒介导的siRNA转染能明显抑制恶性肝癌细胞的生长.     

瘦素对HepG2细胞端粒酶及端粒酶反转录酶的调控作用研究

目的 探讨瘦素(leptin)对人肝癌细胞株HepG2的增殖机制及对端粒酶(telomerase,TA)与端粒酶反转录酶(hTERT)活性表达的影响.方法 噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度leptin作用不同时间对HepG2细胞的增殖影响;流式细胞仪分析其细胞周期;TRAP-PCR银染法检测不同浓度leptin作用HepG2细胞后端粒酶的活性;实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹(Western-blot)分析leptin作用24 h后hTERT mRNA及蛋白水平的表达情况.结果 leptin可以促进HepG2细胞增殖,具有浓度-时间依赖性;流式细胞仪结果显示leptin可以改变HepG2的细胞周期,使S期比例升高;leptin可以活化HepG2细胞端粒酶,上调HepG2 hTERT mRNA及蛋白水平的表达.结论 leptin可能通过上调HepG2 hTERT表达,增强端粒酶活性,改变肝癌细胞株HepG2的生物学行为.     

siRNA沉默CD147基因对肝癌细胞的影响

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默CD147基因在肝癌细胞HepG2中的表达,探讨CD147基因对肝癌细胞生长、凋亡的影响.方法 根据CD147 cDNA序列设计具有短发夹结构的两条DNA序列,与载体pSileneerTM4.1-CMV neo构建重组表达载体,鉴定后转染至HepG2细胞,Western blotting法检测抑制效果,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况.结果 成功构建了针对CD147基因表达的干扰质粒,有效抑制了HepG2细胞增殖,促进了HepG2细胞凋亡.结论 CD147靶向RNA干扰重组表达栽体为肝癌的基因治疗提供了可能.     

人端粒酶逆转录酶mRNA在喉鳞状细胞癌患者外周血中的表达及临床意义

目的探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA在喉鳞状细胞癌(LSCC)患者外周血中的表达及临床意义。方法采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测37例LSCC患者(LSCC组)及35例喉良性病变患者(对照组)外周血中hTERT mRNA的表达。结果 LSCC组患者外周血中hTERT mRNA表达高于对照组(P<0.05)。hTERT mRNA的表达与临床分期、有无颈部淋巴结转移无明显相关(P>0.05)。结论 hTERT mRNA在LSCC患者外周血中高表达,可作为LSCC诊断和治疗的指标。     

以HepG2.2.15细胞为对象的RNAi实验研究

目的观察针对乙型肝炎病毒(HBV)X区设计的siRNA表达载体pGenesil-HBVX对HepG2.2.15细胞相应蛋白表达的影响。方法筛选出最佳转染效率的剂量配比,将阳离子脂质体METAFECTENE与pGen-esil-HBVX的复合物转染HepG2.2.15细胞,于转染后24、48、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)。结果具有最佳转染效率而且不显著影响细胞活性的剂量配比为8μl∶2.5μg。pGenesil-HBVX转染HepG2.2.15细胞后24h,细胞上清液中HBsAg、HBeAg含量尚无显著变化(P>0.05);48h后HBsAg、HBeAg表达均有明显下降(P<0.01),并且持续至72h。结论pGenesil-HBVX可以在获得一定转染效率的基础上有效抑制HepG2.2.15细胞中HBV的表达。     

联合干扰人端粒酶催化亚基对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的探讨基因的联合干扰对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法将转染细胞分为共四组:psi-control对照组(A组)、psi-端粒酶催化亚基(hTERT)1组(B组)、psi-hTERT1和psi-hTERT2共转染组(C组)、psi-hTERT1和psi-端粒酶调节相关蛋白(TRAP)1共转染组(D组)。采用RT-PCR及Western blot分别检测hTERT mRNA和蛋白表达,端粒重复序列扩增-PCR法检测端粒酶活性,MTT法检测SGC-7901细胞增殖。结果与A组相比,B组、C组hTERT mRNA和蛋白表达、端粒酶活性降低(P<0.05),细胞增殖减慢,细胞凋亡增加;而D组各指标与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论联合干扰的效果可能与剂量和目的基因有关。     

基因芯片技术研究Z24对人HepG2细胞基因表达的影响

目的:利用芯片技术观察Z24对人HepG2细胞基因表达的影响,以探讨其毒性作用的分子机制.方法:不同浓度处理培养的HepG2细胞,H-E染色观察细胞形态;抽提细胞RNA,利用荧光标记ddUTP逆转录制备cDNA探针,与毒理表达谱基因芯片杂交,并对Cy3,Cy5荧光信号做扫描分析.结果:Z24处理实验组细胞呈现凋亡形态;芯片扫描显示在IC20浓度情况下,Z24作用HepG2细胞有15个基因发生显著的变化,其中细胞凋亡通路有关的基因TNFRSF5发生明显上调,与肝功能有关的基因(AKR1C2和INSIG1)发生明显的下调.随Z24浓度的增加,发生改变的基因数增加到244个,其中109个基因发生明显的上调,135个基因发生明显的下调,下调的基因多与细胞增殖调控功能、氨基酸、能量和脂肪代谢有关;而细胞凋亡通路中几个重要关键蛋白(DFFB,CASP6,DR4)的基因明显上调,并且与肝脏有关的基因(INSIG1,PHKA2,HPX)也发生了明显的改变.结论:Z24可以诱导HepG2细胞凋亡,并可能是其产生毒性的重要机制之一;毒性作用的靶器官可能是肝脏.     

甘草甜素联合单磷酸阿糖腺苷对HepG 2.2.15细胞及其HBsAg表达的影响

目的探讨甘草甜素联合单磷酸阿糖腺苷对HepG2.2.15细胞株存活率及其HB-sAg表达的影响,评价甘草甜素(GL)与单磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)合用体外抗HBV效果。方法利用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞检测细胞培养上清液中的乙肝病毒表面抗原(HBsAg),作为这两种药物联合在体外抗HBV效果的观察指标(以抑制率来表示)。用MTT法检测HepG2.2.15细胞的存活率。结果(1)各药对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率呈药物浓度和时间依赖性;联合组与两个单药组分别比较,抑制HBsAg差异有显著意义(P<0.05或P<0.01)。(2)随着浓度的增加,各药对细胞的存活率均显示抑制作用,尤其联合组高于其它两个单药组。结论GL联合Ara-AMP在体外HepG2.2.15细胞中具有协同抗HBV的作用。     

靶向hTERT的特异性siRNA抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖机制研究

目的筛选有效抑制肝癌细胞hTERT表达的小干扰RNA(siRNA)序列,并检测其对hTERT蛋白表达、细胞凋亡的影响。方法设计并合成针对hTERT的6条siRNA双链及一条阴性对照siRNA,以LipofectaminTM2000转染至肝癌SMMC-7721细胞。用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B法,SRB法)测定干扰后细胞增殖的变化,RT-PCR测定hTERTmRNA的表达,筛选出有效序列。有效序列转染后,进一步采用Western blot法检测hTERT蛋白水平的变化,AnnexinV-FITC/PI双染、流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果以SRB和RT-PCR法筛选出的两条有效siRNA:siRNA-2和siRNA-6,能明显抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,对细胞的抑制率分别为45.3%、38.2%,能高度沉默hTERT mRNA的基因,沉默率分别为80%、75%。二者还能明显下调hTERT蛋白表达(P<0.05),明显增加凋亡,凋亡率分别为20.23%、17.94%。结论 siRNA-2和siRNA-6能特异性沉默肝癌SMMC-7721细胞hTERT基因表达,抑制增殖,降低hTERT蛋白水平,诱导凋亡,为肝癌基因治疗提供了有力的实验依据。     

六月青含药血清对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用

目的:研究六月青(LYQ)含药血清对HepG2.2.15细胞乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用。方法:采用血清药理学方法,在HBV的体外细胞培养系统(HepG2.2.15细胞)中观察LYQ抗HBV的作用。结果:LYQ含药血清在HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制HBV DNA的复制,其作用呈显著的浓度-效应和时间-效应关系。结论:LYQ在体外能显著抑制HBV,可能是复方六月雪主要活性成分之一。     

吡非尼酮对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响(“豪森杯”优秀论文三等奖)

目的：研究吡非尼酮（pirfenidone,PF）对人肝癌细胞系HepG2增殖和凋亡的影响。方法：CCK-8法测定不同浓度PF对HepG2细胞增殖活性的影响;Hoechst 33258荧光染色法观察PF处理后HepG2细胞形态的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：PF对HepG2细胞具有显著增殖抑制作用,并呈浓度和时间依赖性;Hoechst 33258染色可见PF处理后细胞出现典型的凋亡形态学变化;流式细胞仪检测结果显示,与空白组比较,PF处理后的HepG2细胞凋亡率显著增加（P﹤0.01）。结论：PF对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖具有抑制作用,且与诱导HepG2细胞凋亡有关。     

靶向survivin基因的小干扰RNA对食管癌细胞Eca-109 化疗敏感性的影响

目的 利用RNAi (RNA interference, RNAi) 技术抑制食管癌Eca-109细胞survivin基因表达,观察survivin基因沉默后对Eca-109细胞化疗敏感性的影响。方法 构建靶向survivin基因特定序列的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)真核表达载体并转染Eca-109细胞,筛选得到稳定转染的survivin干扰组细胞Eca-109 /si-survivin,同时设转染无关干扰质粒的Eca-109细胞为阴性对照组,未转染的Eca-109细胞为空白对照组;通过Western Blot法检测干扰前后survivin基因沉默抑制效果;随后将各组细胞与不同浓度的氟尿嘧啶(5-Fu)作用,MTT法检测各组细胞对5-Fu的半数抑制浓度(IC₅₀),流式细胞仪分析各组细胞的凋亡率。结果 干扰组Eca-109 /si-survivin细胞survivin蛋白表达水平(18.75±3.12)较阴性对照组Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白对照组Eca-109 (46.20±2.62)明显下调(P<0.05);联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞IC₅₀为(18.75±1.53)mg·L-1,显著低于空白对照组(39.65±1.75)mg·L-1和阴性对照组(38.95±1.34)mg·L-1,差异具有统计学意义(P<0.05);联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞凋亡率为(37.35±1.52)%,明显高于空白对照组(11.26±1.21)%和阴性对照组(12.34±1.32)%,差异具有显著性(P<0. 05)。 结论 靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并增强人食管癌Eca-109细胞对5-Fu的化疗敏感性。     

Bcl-2 siRNA induced apoptosis and increased sensitivity to 5-fluorouracil and HCPT in HepG2 cells

To investigate the changes in drug sensitivity of Bcl-2 siRNA transfected HepG2 cells. Bcl-2 siRNA and negative siRNA expression vector were constructed and stably transfected into HepG2 cells. RT-PCR and Immunofluorescence were used to detect the target gene expression. Western Blotting was used to detect Bcl-2, Bax and caspase-3 protein expressiom. Drug sensitivity of the cells to 5-fluorouracil (5-FU) and 10-hydroxycamptothecin (HCPT) were analyzed with MTT and flow cytometry. Results were following: (1) the mRNA and protein expression level of Bcl-2 in Bcl-2 siRNA stable transfectants were reduced compared with negative siRNA transfected or untreated cells. Accordingly, Bax protein expression had no change and caspase-3 protein expression showed significantly be up regulated; (2) MTT results showed that Bcl-2 siRNA transfectants had higher cell inhibitory rates after treated with 5-FU or HCPT; (3) flow cytometry results demonstrated that sub G1 population increased in Bcl-2 siRNA transfected cells compared with negative siRNA or untreated cells. After addition 5-FU (1300 mg/l) and HCPT (0.72 mg/l), Bcl-2 siRNA cells showed higher sub G1 population than negative siRNA or untreated cells. siRNA targeting Bcl-2 gene can specifically down-regulate Bcl-2 expression, increased Bax/Bcl-2 ratio expression and caspase-3 activity in HepG2 cells, which lead to increase cells spontaneous apoptosis and sensitize cells to 5-FU or HCPT. Bcl-2 siRNA may be a potential therapy agent against human hepatoblastoma.     

杨梅素诱导人肝癌HepG2凋亡机制研究

目的对杨梅素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡机制进行研究。方法采用MTT法测定细胞死亡率;采用倒置显微镜观察细胞形态学变化;用琼脂糖电泳观察DNA片段化。用Western印迹法分析相关蛋白的变化。结果杨梅素明显抑制HepG2细胞的增殖,诱导HepG2细胞调亡。Caspase-3,caspase-9抑制剂可明显抑制100μg/ml杨梅素诱导的凋亡。Western印迹结果显示100μg／ml杨梅素作用于细胞后,细胞色素c水平明显升高。结论杨梅素（100μg／ml）通过激活线粒体途径诱导HepG2细胞凋亡。     

空心莲子草总皂苷对HepG2.2.15细胞系HBsAg和HBeAg表达及HBV-DNA含量的影响

目的：研究空心莲子草总皂苷对乙肝病毒的抑制作用。方法：应用光密度测定法和细胞培养技术,研究空心莲子草总皂苷对HepG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的影响。结果：96孔板试验：实验第3、6日,空心莲子草总皂苷对HBsAg和HBeAg表达均有明显的抑制作用（与对照组比较P<0.01）;同时采用定量PCR方法检测,空心莲子草总皂苷（200 mg·L-1）可使培养基中HBV-DNA转阴。结论：空心莲子草总皂苷有较强的体外抗乙肝病毒作用。